Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

Résumé

Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Résumé

La métastase est un processus complexe, qui oblige les cellules à surmonter des barrières qui ne sont que partiellement modélisées par des essais in vitro . Un flux de travail systématique a été établi à l’aide de modèles in vivo robustes et reproductibles et de méthodes normalisées pour identifier de nouveaux acteurs dans les métastases du mélanome. Cette approche permet d’inférer des données à des stades expérimentaux spécifiques pour caractériser avec précision le rôle d’un gène dans les métastases. Les modèles sont établis en introduisant des cellules de mélanome génétiquement modifiées par injection intracardiaque, intradermique ou sous-cutanée chez la souris, suivie d’une surveillance par imagerie in vivo en série. Une fois les critères d’évaluation préétablis atteints, les tumeurs primaires et/ou les organes porteurs de métastases sont prélevés et traités pour diverses analyses. Les cellules tumorales peuvent être triées et soumises à l’une des nombreuses plates-formes « omiques », y compris le séquençage de l’ARN unicellulaire. Les organes subissent des analyses d’imagerie et d’immunohistopathologie pour quantifier le fardeau global des métastases et cartographier leur emplacement anatomique spécifique. Ce pipeline optimisé, y compris des protocoles normalisés pour la greffe, la surveillance, la récolte, le traitement et l’analyse des tissus, peut être adopté pour les cultures à court terme dérivées de patients et les lignées cellulaires humaines et murines établies de divers types de cancer solide.

Introduction

La mortalité élevée associée au mélanome métastatique combinée à une incidence croissante de mélanome dans le monde¹ (une augmentation estimée à 7,86 % d’ici 2025) nécessite de nouvelles approches thérapeutiques. Les progrès dans la découverte de cibles reposent sur des modèles reproductibles de métastases, un processus très complexe. Tout au long des étapes de la cascade métastatique, les cellules du mélanome doivent surmonter d’innombrables obstacles pour atteindre l’évasion du système immunitaire et la colonisation des tissus éloignés². La résilience et l’adaptabilité des cellules du mélanome proviennent d’une multitude de facteurs, notamment leur charge mutationnelle génétique élevée³ et leur origine de crête neurale, qui confèrent une plasticité phénotypique cruciale ^3,4,5. À chaque étape, les programmes transcriptionnels permettent aux cellules métastasantes du mélanome de passer d’un état à l’autre en fonction des signaux de la diaphonie avec le microenvironnement, comprenant le système immunitaire⁶, le milieu extracellulaire ^7,8 et l’architecture cellulaire des barrières physiques 9 avec lesquelles elles entrent en contact. Par exemple, les cellules de mélanome échappent à la surveillance immunitaire en régulant à la baisse l’expression d’importants facteurs sécrétés par la tumeur d’amorçage immunitaire⁶.

Des études décrivent une « niche prémétastatique », dans laquelle les cellules du mélanome sécrètent des chimiokines et des cytokines pour amorcer l’organe « cible » distant pour les métastases¹⁰. Ces résultats soulèvent des questions importantes sur le tropisme organique des cellules de mélanome métastatique et la voie anatomique qu’elles empruntent pour accéder aux tissus éloignés. Après intravasation, on sait que les cellules du mélanome métastasent par les lymphatiques (propagation lymphatique) et les vaisseaux sanguins (propagation hématogène)^2,11. Alors que la plupart des patients présentent une maladie localisée, un petit sous-ensemble de cas présente une maladie métastatique à distance et aucune dissémination lymphatique (atteinte négative des ganglions lymphatiques)¹¹, ce qui suggère l’existence d’autres voies métastatiques pour le mélanome.

Lorsqu’elles colonisent un site métastatique, les cellules du mélanome subissent des adaptations épigénétiques et métaboliques^12,13. Pour accéder et envahir de nouveaux compartiments, les cellules de mélanome utilisent des protéases¹⁴ et des modifications cytosquelettiques ^11,15, qui leur permettent de traverser et de se développer dans leur nouvel emplacement. La difficulté de cibler les cellules du mélanome réside dans la complexité et le nombre de telles adaptations; ainsi, le domaine devrait s’efforcer de recréer expérimentalement autant d’étapes et d’adaptations que possible. Malgré de nombreuses avancées dans les essais in vitro tels que les organoïdes et les cultures 3D^16,17, ces modèles ne récapitulent qu’incomplètement la cascade métastatique in vivo.

Les modèles murins ont montré de la valeur en trouvant un équilibre entre la reproductibilité, la faisabilité technique et la simulation de la maladie humaine. Les cellules de mélanome implantées par voie intravasculaire, orthotopique et hétérotopique à partir de xénogreffes dérivées de patients ou de cultures à court terme dans des souris immunodéprimées ou humanisées représentent l’épine dorsale de la découverte de cibles dans le mélanome métastatique. Cependant, ces systèmes manquent souvent d’une contrainte biologique cruciale sur les métastases: le système immunitaire. Les modèles de métastases de mélanome syngénique qui possèdent cette contrainte sont relativement rares sur le terrain. Ces systèmes, développés chez des souris immunocompétentes, dont B16-F10¹⁸, la famille YUMM des lignées cellulaires¹⁹, SM1²⁰, D4M3²¹, RIM3²² ou plus récemment, les lignées cellulaires de mélanome RMS²³ et M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)²⁴ , facilitent l’étude du rôle complexe de la réponse immunitaire de l’hôte dans la progression du mélanome.

Ici, un pipeline pour l’identification de la cible des métastases du mélanome est présenté. Avec l’augmentation et l’augmentation des ensembles de données « omiques » générés à partir de cohortes de patients atteints de mélanome, nous postulons que les études les plus prometteuses sur le plan clinique sont celles qui découlent de l’intégration de données volumineuses, conduisant à un interrogatoire fonctionnel et mécaniste méticuleux ^25,26,27,28. En utilisant des modèles murins pour étudier des cibles potentielles dans le processus métastatique, on peut rendre compte des événements in vivo spécifiques et des interactions tissulaires, augmentant ainsi la probabilité de traduction clinique. Plusieurs méthodes pour quantifier la charge métastatique sont décrites, fournissant des données complémentaires sur les résultats d’une expérience donnée. Un protocole d’isolement unicellulaire des tumeurs dans divers organes est décrit pour aider à la caractérisation impartiale de l’expression des gènes dans les cellules métastatiques, qui peuvent précéder le séquençage de l’ARN unicellulaire ou en vrac.

Protocole

REMARQUE: Les procédures animales impliquées dans le protocole suivant ont été approuvées par le New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les procédures sont effectuées dans des installations approuvées par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La figure 1 illustre l’approche expérimentale générale.

1. Cultures à court terme de mélanome dérivées du patient (CTS)

1. Placer le tissu dans une boîte de Petri de 60 mm avec 1 mL de RPMI complet (RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 1x solution d’acides aminés non essentiels MEM et pénicilline (100 UI / mL) / streptomycine (100 μg / mL)).
   REMARQUE: Pour augmenter le ratio de cellules tumorales, si nécessaire, disséquez et enlevez le tissu entourant la tumeur dans la boîte de Pétri, au microscope, à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles.
2. Coupez finement le tissu frais à l’aide de lames de rasoir stérilisées en cubes de 1 à 2 mm. Ajouter 4 mL de RPMI complet et pipeter le contenu de la plaque de haut en bas 5 à 10 fois avec une pipette sérologique de 10 mL.
3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique en polypropylène de 15 mL et faire tourner les cellules vers le bas (180 × g pendant 5 min à 4 °C). Aspirer le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu frais et transférer la suspension dans une fiole de culture tissulaire^{de 25 cm 2} .
4. Pour aider les fragments de tissu à se fixer au fond, placez la fiole inclinée à un angle de 20° à 30° dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 20 min.
5. Déposer la fiole à plat pour permettre au milieu de couvrir le tissu et vérifier quotidiennement l’état de la culture. Divisez les cellules lorsqu’elles atteignent 90 à 100% de confluence. Maintenir les cultures à court terme à un nombre de passages « faible ».
   REMARQUE: Les STC seront établis environ 2 mois après l’isolement et la culture cellulaires, bien que le calendrier réel varie entre les échantillons et les types de tumeurs. Après 10 à 14 passages, les lignées cellulaires atteignent 100% de pureté, ne contenant que des cellules de mélanome²⁹. Le seuil du nombre de passage est déterminé empiriquement en observant les changements dans la morphologie cellulaire, le temps de doublement et le comportement in vivo. Pour préserver l’hétérogénéité et d’autres caractéristiques de la tumeur mère, ne divisez pas les cellules de plus de 1:5.
6. Lors de l’établissement d’un STC et avec tout modèle de lignée cellulaire à injecter dans les animaux comme décrit dans les étapes suivantes, transduire les cellules avec un rapporteur.
   REMARQUE : Une étiquette fluorescente (p. ex. protéine fluorescente rouge (DP), protéine fluorescente verte (GFP)), par exemple, permet l’imagerie par immunofluorescence ex vivo et le tri des cellules tumorales par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La luciférase permet l’imagerie par bioluminescence in vivo , un outil utile pour surveiller la progression expérimentale (section 4).

Figure 1 : Schéma illustrant le flux de travail décrit, de l’intégration des données des patients à la génération et à l’analyse de données in vivo provenant de souris. Abréviations : LOF = perte de fonction ; GOF = gain de fonction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Implantation de xénogreffes

REMARQUE: Les procédures expérimentales décrites ici sont menées chez des souris dont le système immunitaire adaptatif et inné est altéré, NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl / SzJ (NSG); ou chez les souris qui n’ont pas d’immunité adaptative seulement, comme les souris athymiques/nues déficientes en lymphocytes T (NU/J). Les animaux sont de sexe masculin, âgés de 8 à 10 semaines. Les femelles présentent souvent une incidence élevée de métastases gonadiques lors de l’injection intracardiaque de cellules tumorales, ce qui réduit leur survie.

1. Pour les injections sous-cutanées et intradermiques, préparez une suspension cellulaire 1:1 en mélangeant une partie des cellules en suspension dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco avec une partie de substrat de matrice extracellulaire (EMS) décongelé, et maintenez sur la glace à 4 °C. Pour les injections intravasculaires (intracardiaques, intracarotidiennes, rétro-orbitaires, veine caudales ou spléniques), suspendez les cellules dans DPBS uniquement.
   REMARQUE: Le volume approprié pour les injections intradermiques doit être maintenu aussi bas que possible (30 μL). Pour les injections sous-cutanées, le volume injecté peut aller jusqu’à 150 μL, et pour les injections intravasculaires, jusqu’à 250 μL (en fonction du poids de l’animal). Ajouter à la suspension cellulaire finale 10 à 30 % de volume supplémentaire d’injectable, en fonction de la quantité injectée et de la seringue utilisée pour tenir compte du volume mort à l’intérieur de l’embout de glissement et de celui de l’aiguille (p. ex., une seringue à tuberculine de 1 mL avec une aiguille de 30 G et 25 mm a un volume mort de 100 μL).
2. Mener un pilote pour caractériser le comportement des lignées cellulaires utilisées et la chronologie de la progression tumorale in vivo. Pour les injections intradermiques, commencez par injecter de 1 000 à 50 000 cellules/30 μL. Pour les injections sous-cutanées, commencez par injecter 10 000 jusqu’à 2 × 10⁶ cellules/150 μL. Pour les injections intravasculaires (intracardiaques, intracarotidiennes, rétro-orbitaires et spléniques), commencez par injecter 50 000 cellules/150 μL.
   REMARQUE: Les injections intravasculaires prédisposent les animaux à des événements emboliques, soit en introduisant de l’air dans le système circulatoire, soit en utilisant un nombre excessif de cellules qui obstruent les petits vaisseaux. Mélangez bien la suspension cellulaire pour éviter l’agglutination. Amorcez la seringue avant de charger la suspension cellulaire. Retirez toutes les bulles d’air à l’intérieur de la seringue. Conservez la suspension cellulaire ou les seringues sur la glace jusqu’au moment du chargement et de l’injection.
3. Administrer l’anesthésie par inhalation. Réglez le régulateur de niveau d’oxygène entre 1 et 2 L / min. Placez l’animal dans la chambre d’induction avec le vaporisateur isoflurane réglé à 2,5-5% pour l’induction et 1,5-3% pour l’entretien.
   REMARQUE: Surveiller la respiration et la fréquence cardiaque de l’animal pendant la phase d’induction de l’anesthésie. Ne laissez pas l’animal sans surveillance. Ne surveillez pas plus d’un animal simultanément. Titrer la quantité d’anesthésie au poids de l’animal.
4. Déplacez l’animal de la chambre d’induction dans le cône du nez. Appliquez une pommade ophtalmique stérile à la vaseline sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la procédure.
5. Rasez le site de la procédure avec une lame de rasoir droite inclinée à un angle de 30 °. Nettoyez la peau de la zone de procédure avec des tampons d’alcool isopropylique à 70%. Avant toute autre étape, évaluez un niveau suffisant d’anesthésie par réflexe de pédale.
6. Pour les injections intradermiques, effectuez toute la procédure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions aseptiques.
   1. Anesthésier et raser l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.5.
   2. Saisissez et rétractez la peau vers l’arrière contre la trajectoire du coup de couteau à aiguille. À l’aide d’une aiguille de seringue à insuline de 31 G, de 6 mm de long, maintenue à un angle aigu, perforez doucement la peau avec le biseau tourné vers le haut.
   3. Sentez la pression se relâcher au bout de l’aiguille. Avancez doucement pour rester à l’intérieur du compartiment intradermique et ne pas traverser toute la profondeur de la peau dans la sous-cutis. Crucial: Si l’on glisse dans l’espace sous-cutané, retirez l’aiguille, changez la zone d’injection et réinsérez l’aiguille. Injecter lentement tout le volume (30 μL) de suspension cellulaire jusqu’à ce qu’on observe un wheal en forme de dôme.
      REMARQUE: De faibles volumes d’injection induiront moins de dissection des couches de la peau et moins de distorsion architecturale.
   4. Gardez l’aiguille à l’intérieur et comptez jusqu’à 5.
      REMARQUE: EMS devient visqueux à la température du corps, aidant à éviter le reflux à travers la plaie de ponction de l’aiguille.
   5. Retirez l’aiguille et placez l’animal dans une cage sur un coussinet chaud pour récupérer. Remettez l’animal dans la cage du vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire.
      REMARQUE: Surveillez l’animal en permanence pendant toutes les procédures décrites dans ce protocole. Ne laissez pas l’animal sans surveillance et ne surveillez pas plus d’un animal simultanément.
   6. Surveillez la progression de la croissance tumorale, la perte de poids et l’état de santé général en collaboration avec le personnel vétérinaire quotidiennement dans la phase de croissance initiale et plus intensément, si nécessaire, après que les animaux commencent à perdre du poids. Au cours de ces séances de surveillance: pesez les animaux et tracez un tableau pour surveiller la perte de poids, et vérifiez les signes d’ulcération tumorale, neurologiques, locomoteurs et / ou comportementaux (léthargie, manque de toilettage, faible consommation de nourriture ou d’eau).
      REMARQUE: Euthanasier les animaux immédiatement après avoir observé des signes de maladie avancée (perte de poids de plus de 20%, score d’état corporel de <2, niveaux d’activité extrêmement réduits, paralysie ou convulsions). Utilisez la méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC de l’établissement (p. ex., une chambre automatisée de CO₂ sur table est utilisée pour exposer les animaux au CO₂ pendant 15 minutes, suivie d’une méthode secondaire d’euthanasie, soit une luxation cervicale, une décapitation ou un pneumothorax induit bilatéralement par l’incisation de la cage thoracique).
   7. Prenez des mesures avec des étriers et utilisez les dimensions de longueur (L) et de largeur (W) de la tumeur pour calculer le volume (V) avec la formule:
      
7. Pour les injections sous-cutanées :
   1. Effectuer toute la procédure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions aseptiques^26,27.
   2. Anesthésier et raser l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.5.
   3. À l’aide d’une aiguille de seringue à insuline de 28 g à 31 G, de 6 mm de long, maintenue à un angle aigu, perforez doucement la peau avec le biseau tourné vers le haut. Sentez la pression se relâcher à l’extrémité de l’aiguille deux fois en passant à travers l’épiderme, le derme et l’hypoderme.
      REMARQUE: La deuxième fois qu’un relâchement de pression est ressenti à l’extrémité de l’aiguille indique que le compartiment sous-cutané a été atteint.
   4. Injecter lentement tout le volume (30-150 μL) de suspension cellulaire jusqu’à ce qu’on observe un wheal allongé en forme d’ellipse. Gardez l’aiguille à l’intérieur et comptez jusqu’à 5. Comptez jusqu’à 10 pour les volumes plus importants (plus de 50 μL).
      REMARQUE: EMS devient visqueux à la température du corps, aidant à éviter le reflux à travers la plaie de ponction de l’aiguille.
   5. Retirez l’aiguille et placez l’animal dans une cage sur un coussinet chaud pour récupérer. Retournez l’animal dans sa cage de vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire.
      REMARQUE: Pendant la surveillance postprocédurale, observez tout signe de complications (faible fréquence respiratoire, saignement, récupération lente) et traitez-les de manière appropriée. Si aucune amélioration n’est observée, procéder aux procédures d’euthanasie sans cruauté décrites dans la NOTE de l’étape 2.6.6.
   6. Surveillez la croissance tumorale, la perte de poids et l’état de santé général de l’animal, comme décrit aux étapes 2.6.6 à 2.6.7.
8. Pour les injections intracardiaques :
   1. Effectuer toute la procédure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions aseptiques^26,30.
   2. Anesthésier l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.4.
   3. Transférez l’animal sur la plate-forme chauffée de l’appareil à ultrasons et fixez-le avec du ruban hypoallergénique au cône du nez.
   4. Rasez le thorax avec une lame de rasoir droite inclinée à un angle de 30°. Nettoyez la peau de la zone de procédure avec 3 applications de 10% de povidone-iode en alternance avec 3 applications d’alcool isopropylique.
   5. Avant toute autre étape, évaluez un niveau suffisant d’anesthésie par réflexe de pédale. Appliquez un gel à ultrasons sur le site de la procédure.
   6. Capturez la fenêtre cardiaque avec la sonde à ultrasons. Placez la sonde à ultrasons au milieu du thorax sur le côté gauche de l’animal pour capturer une fenêtre horizontale orientée pour obtenir une vue en coupe transversale (axe court) du ventricule gauche. En veillant à ce que le long axe de la sonde soit orienté vers le haut, fixez la sonde à un angle de 50° et la plate-forme chauffée à un angle de 20°. Verrouillez la sonde et le cadre de support en position.
   7. Aspirer la suspension cellulaire tout en travaillant à l’intérieur de l’armoire de biosécurité dans une seringue tuberculine de 1 mL avec une aiguille de 30 G et 25 mm. Retirez toutes les bulles d’air dans la seringue.
      REMARQUE: Il est important de créer et de maintenir une suspension unicellulaire pendant que les cellules sont traitées et injectées. L’élimination des bulles d’air est une étape importante pour éviter l’embolie d’air. Un système seringue-aiguille bien amorcé permettra d’éviter les décès évitables dans le groupe expérimental. Aspirez toujours plus de volume dans la seringue que ce qui sera injecté. Le volume supplémentaire aidera à éliminer l’air en réinjectant une partie de la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL.
   8. Verrouillez la seringue dans l’injecteur stéréotaxique. Sous guidage échographique, avancez l’aiguille à travers la paroi thoracique dans le ventricule gauche du cœur. Injecter lentement tout le volume (100-250 μL) de suspension cellulaire.
   9. Retirez l’aiguille et placez l’animal dans une cage sur un coussinet chaud pour récupérer. Retournez l’animal dans sa cage de vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire. Surveillez la croissance tumorale, la perte de poids et l’état de santé général de l’animal, comme décrit à l’étape 2.6.6.
9. Pour les injections intracarotidiennes :
   1. Effectuez toute la procédure sur une surface correctement désinfectée pour aider à maintenir les conditions aseptiques³⁰.
   2. Anesthésier l’animal avec un cocktail de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale avec une seringue à insuline, aiguille de 28 G. Appliquez une pommade ophtalmique stérile à la vaseline sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la procédure.
   3. Rasez la zone de procédure avec une lame de rasoir droite inclinée à un angle de 30 °. Avant toute autre étape, évaluez un niveau suffisant d’anesthésie par réflexe de pédale.
   4. Placez l’animal sous un stéréomicroscope sur un coussin chauffant. Nettoyez la peau de la zone de procédure avec 3 applications de 10% de povidone-iode en alternance avec 3 applications d’alcool isopropylique.
   5. Enfilez de l’équipement de protection individuelle (EPI) stérile et des gants stériles. Préparez le champ stérile en posant un drap stérile sur le corps de l’animal.
      REMARQUE: Si le drapé stérile n’a pas de trou approprié à la taille et à l’emplacement de l’incision, pliez le drapé en deux et utilisez des ciseaux Metzenbaum pour couper le trou de taille appropriée au milieu du drap stérile.
   6. Utilisez un scalpel ou des ciseaux à iris pour inciser la peau de la moitié du cou jusqu’au sternum. Avec deux pinces microchirurgicales, disséquez brutalement les 2 glandes salivaires sous-maxillaires dans le plan médian. Utilisez une cautérisation électrique pour l’hémostase, si nécessaire.
   7. Disséquez le fascia entourant l’artère carotide commune (ACC) du manubrium vers la bifurcation et continuez médialement pour libérer la paroi postérieure de la carotide externe. Coupez temporairement l’artère carotide externe (ECA) avant l’injection.
      REMARQUE: Lors de la dissection autour de la circonférence de la DPA, il faut veiller à ne pas endommager le nerf vague (situé latéralement à l’artère).
   8. Chargez la suspension cellulaire dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 33 G et 15 mm.
   9. Passez deux ligatures 7-0 sous le CCA et effectuez un nœud d’instrument lâche pour chacune des deux ligatures. Utilisez un clip de récipient sous pression de 5 mm et 10 G et clipsez temporairement l’ECA. Attacher la ligature proximale; ensuite, attachez la ligature distale lâchement (à côté de la bifurcation du CCA). Utilisez la boucle distale plus tard pour contrôler le saignement après l’injection.
   10. À l’aide de la seringue avec une aiguille de 33 G et 15 mm, perforez doucement le CCA avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut et à un angle aigu. Injecter lentement tout le volume (50-150 μL) de la suspension cellulaire.
   11. Saisissez la boucle distale avec la pince et soulevez-la tout en retirant l’aiguille pour obstruer la lumière du CCA et arrêter le saignement. Échangez la seringue avec une pince Jewelers #7 et attachez la boucle distale.
   12. Jetez un autre nœud d’instrument sur la ligature distale et retirez le clip du vaisseau de l’ECA. Contrôler le champ chirurgical pour les saignements et cautériser les vaisseaux hémorragiques avant la fermeture. Utilisez un dispositif d’agrafage de 9 mm pour fermer la peau de l’animal et placez l’animal sur un coussin chaud pour récupérer.
       REMARQUE: Retirez les agrafes 7 à 10 jours après la chirurgie.
   13. Administrer des médicaments analgésiques par voie sous-cutanée -Buprénorphine (0,3 mg/mL) toutes les 12 h pendant 72 h après la chirurgie à une concentration de 0,1 mg/kg.
       REMARQUE: Alternativement, envisagez d’utiliser un médicament analgésique à libération prolongée, qui nécessite 1 dose toutes les 72 h.
   14. Retournez l’animal dans sa cage de vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire. Surveillez quotidiennement les animaux après l’opération pour détecter tout signe d’infection ou de douleur au site chirurgical, l’état de santé général et les complications.
       REMARQUE: Les animaux qui ne se rétablissent pas bien de la chirurgie de survie peuvent recevoir des doses supplémentaires d’analgésiques et seront euthanasiés sans cruauté s’ils ne sont pas complètement rétablis dans les 72 heures suivant la chirurgie.
   15. Surveillez la croissance tumorale, la perte de poids et l’état de santé général de l’animal, comme décrit à l’étape 2.6.6.
10. Pour les injections rétro-orbitales :
    REMARQUE: Utilisez cette technique comme alternative aux injections de veine caudale lorsque l’opérateur est formé et compétent dans cette technique et lorsqu’il existe une justification scientifique solide. Les suspensions cellulaires délivrées par cette voie peuvent induire une croissance tumorale dans l’espace rétro-orbital; par conséquent, il convient d’examiner attentivement les risques et les avantages lors du choix de cette technique. Par exemple, pour tirer parti de la connexion circulatoire directe du sinus veineux rétro-orbitaire avec les veines intracérébrales via les anastomoses, sélectionnez cette méthode lorsque la formation de tumeurs cérébrales a échoué en utilisant d’autres voies d’injection.
    1. Effectuez toute la procédure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions aseptiques. Enfilez des EPI et des gants stériles.
    2. Anesthésier l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.4.
       REMARQUE: Pour cette procédure, n’appliquez pas de pommade ophtalmique stérile à base de vaseline sur les yeux de l’animal, car cela empêcherait l’injection; appliquer uniquement des gouttes anesthésiques locales.
    3. Chargez la suspension cellulaire dans une seringue à insuline avec une aiguille de 28-31 G, 6 mm.
    4. Avec l’animal en position couchée, rétractez les paupières jusqu’à ce que l’œil dépasse. Appliquer 1 gouttelette d’anesthésique local dans l’œil sur le côté soumis à la procédure.
    5. Insérez l’aiguille à un angle de 30-45° entre l’œil et l’épicanthe médiale avec le biseau tourné vers le bas. Injecter la suspension cellulaire (10-150 μL) lentement.
       REMARQUE: Des mouvements plus lents empêchent les dommages à l’œil et le reflux de l’injectable.
    6. Effectuez les étapes décrites dans 2.7.5-2.7.6.
11. Pour les injections spléniques :
    1. Effectuer toute la procédure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions aseptiques³¹. Enfilez des EPI stériles et des gants stériles.
    2. Anesthésier et raser l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.5.
    3. Placez l’animal dans une position couchée latérale droite. Nettoyez la peau de la zone de procédure avec 3 applications de 10% de povidone-iode alternant avec 3 applications d’alcool isopropylique et préparez le champ chirurgical comme décrit à l’étape 2.9.5.
    4. À l’aide de ciseaux Metzenbaum ou d’un scalpel, faites une incision de 1 cm dans le flanc gauche de la paroi abdominale suivie d’une incision dans le péritoine.
       REMARQUE: La rate sera vue à travers la paroi abdominale translucide après avoir fait l’incision cutanée. Effectuez l’incision péritonéale exactement dans ce site.
    5. Exposez la rate et le hile splénique à travers l’incision. À l’aide d’une aiguille de seringue à insuline de 28 à 31 G, d’une longueur de 6 mm, perforez doucement la rate avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut et à un angle aigu.
       REMARQUE: Si la plaie de ponction saigne, cautériser le site pour limiter les saignements et le reflux.
    6. Injecter lentement tout le volume (50-100 μL) de suspension cellulaire. Retirez l’aiguille. Placez une petite gaze sur la rate et appliquez une pression avec une pince. Serrez légèrement la rate entre la gaze à l’aide de fines pinces à moustiques et attendez 15 minutes.
    7. Effectuez une splénectomie en attachant le hile splénique avec une suture de soie 3-0 ou 4-0, en cautérisant les vaisseaux si nécessaire. Fermez le péritoine avec une suture résorbable à l’acide polydioxanone (PDS) ou à l’acide polyglycolique 5-0.
    8. Effectuez les étapes décrites aux étapes 2.7.5 à 2.7.6.
       REMARQUE: Les animaux qui présentent des complications hémorragiques ou qui ne se sont pas complètement rétablis 72h après la chirurgie doivent être euthanasiés sans cruauté. Rappelez-vous que le bien-être des souris est la priorité en tout temps.

3. Chirurgie de survie par étapes (SSS)

1. Sur la base des conclusions expérimentales de l’étape 2.2, déterminez le bon moment avant la chirurgie de survie. Selon la lignée cellulaire et l’hypothèse expérimentale, sélectionnez un point temporel antérieur pour la résection tumorale (à un volume tumoral = 150 mm³) ou un point temporel ultérieur (à un volume tumoral = 500 mm³)²⁶.
   REMARQUE: La limite de volume tumoral est de 1 500 mm³ lorsque la charge tumorale est suffisamment élevée pour nuire au bien-être de l’animal et prédispose aux complications.
2. Anesthésier et raser l’animal comme décrit aux étapes 2.3-2.5.
   REMARQUE: L’ensemble de la procédure est effectué à l’intérieur d’une armoire de biosécurité.
3. Nettoyez la peau de la zone de procédure avec 3 applications de 10% de povidone-iode alternant avec 3 applications d’alcool isopropylique et préparez le champ chirurgical comme décrit à l’étape 2.9.5.
4. À l’aide de ciseaux à iris ou d’un scalpel, inciser la peau, en maintenant une marge de résection de 5 à 7 mm du bord de la tumeur.
   REMARQUE: La marge de résection dépend de la capacité de la tumeur à se propager localement. Pour les tumeurs agressives, augmentez la marge de résection tout en vous assurant qu’il reste suffisamment de peau pour effectuer la fermeture de la plaie.
5. Dans le cas de tumeurs intradermiques, réséquez la tumeur avec la peau circonférentielle.
6. Pour les tumeurs sous-cutanées, disséquez et enlevez la tumeur sous la peau.
   REMARQUE: Si la tumeur envahit le péritoine et / ou la peau, réséquez-la en bloc avec la tumeur et fermez le péritoine avec des sutures résorbables à l’acide polyglycolique 5-0/4-0 PDS ou à l’acide polyglycolique.
7. Fermez la plaie avec le dispositif d’agrafage de 9 mm.
   REMARQUE: Retirez les agrafes 7 à 10 jours après la chirurgie. Administrer des analgésiques et placer l’animal sur un coussinet chaud pour récupérer. Continuer à administrer des analgésiques pendant 72 h après la chirurgie, une fois toutes les 12 h conformément à l’étape 2.9.13. Les animaux présentant des complications hémorragiques ou qui n’ont pas repris conscience après la chirurgie doivent être euthanasiés sans cruauté.
8. Hébergez l’animal dans une cage, sur un coussin chaud pour récupérer. Remettez l’animal dans la cage du vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire.
9. Continuer à surveiller l’animal après la chirurgie pour détecter les récidives locales, la perte de poids, les signes neurologiques, locomoteurs et / ou comportementaux (léthargie, manque de toilettage, faible consommation de nourriture ou d’eau) et l’état de santé général.

4. Imagerie in vivo (Figure 2A)

1. Administrer le substrat de D-luciférine (150 mg/kg) aux animaux par injection intrapéritonéale avec une seringue à insuline de 1 mL, aiguille de 28 G.
   REMARQUE: Les cellules tumorales doivent être transduites de manière stable avec l’ADNc de la luciférase.
2. Induire une anesthésie comme décrit aux étapes 2.3-2.4, 6 min après l’injection du substrat de D-luciférine.
3. Effectuer l’imagerie à l’aide d’un scanner d’imagerie par bioluminescence (BLI) (système d’imagerie in vivo )²⁶.
4. Déplacez l’animal à l’intérieur de la chambre d’imagerie et dans le cône du nez. Imagez jusqu’à 5 animaux simultanément, en fonction de la capacité du système d’imagerie.
5. Démarrez l’instrument en appuyant sur initialiser. Réglez le réglage du temps d’exposition sur auto (1-120 s).
6. Capturez une image vide pour soustraire n’importe quel arrière-plan si nécessaire. Cliquez sur Acquérir et enregistrez l’image une fois la séquence d’acquisition terminée.
7. Replacez l’animal dans une cage, qui se trouve avec 50% de la surface de base sur un coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie. Remettez l’animal dans la cage du vivarium après avoir repris conscience, lorsqu’il est sternal et ambulatoire.
8. Pour l’analyse des données dans le même logiciel d’imagerie in vivo avec lequel les images ont été capturées, accédez au dossier où les images sont enregistrées et ouvrez les images de toutes les souris relatives à l’expérience à la fois.
   REMARQUE : L’analyse d’une image à la fois ne permettra pas la normalisation entre les groupes.
9. Réglez les unités sur l’éclat (pas le nombre). Assurez-vous que la case à cocher indiquant l’individu est décochée, car cela empêchera la normalisation du signal entre les groupes.
10. À l’aide de l’outil de dessin de région d’intérêt (ROI ), dessinez des ROI circulaires pour la région du cerveau et des ROI rectangulaires pour le corps. Veillez à exclure les oreilles et le nez du roi du cerveau, car ils ont tendance à émettre une luminescence non spécifique. Pour minimiser les biais dans ce processus, dessinez des rois sur les photographies des souris uniquement, sans que le signal luminescent ne soit superposé.
11. Sélectionnez Mesurer le retour sur investissement pour quantifier le signal et exporter les données vers une feuille de calcul. Analyser les différences entre les groupes en traçant le flux luminescent total (p/sec/cm²/sr) dans les régions du corps d’intérêt.
    REMARQUE: Pour évaluer les différences entre les groupes dans le tropisme cérébral en particulier, calculez le rapport entre le signal cérébral et le signal corporel pour chaque souris. Cela contrôle la variation intermouse de la charge tumorale globale et les différences dans les niveaux d’expression de la luciférase entre les groupes expérimentaux.

5. Imagerie par résonance magnétique ex vivo

1. Effectuer une IRM ex vivo immédiatement après l’euthanasie. Alternativement, prélevez les organes d’intérêt, fixez-les dans du formol jusqu’à 72 h et effectuez l’imagerie à un moment ultérieur.
2. Obtenez les images avec un système de micro-IRM de 7 Tesla (7 T) (300 MHz) équipé d’une console RMN et d’un aimant à alésage horizontal à ébullition nulle ou d’un équipement similaire.
   REMARQUE: La nécessité d’un insert de bobine de gradient activement blindé avec le bon compromis de performance est cruciale. Il doit fournir une linéarité de gradient d’au moins 50 mm de volume sphérique dynamique (DSV) pour couvrir l’ensemble des échantillons examinés simultanément sans distorsion géométrique. La combinaison de la force de gradient (allant de 440 à 750 mT/m) et du rapport cyclique permettant des courants continus simultanés maximaux allant de 3 x 30 A à 3 x 87 A permettra des performances d’imagerie adéquates. L’insert de bobine de gradient utilisé (voir le tableau des matériaux) permet les performances suivantes : 660 mT/m, temps de montée de 130 μs, 3 x 87 A et un DSV = 80 mm.
3. Effectuez les balayages avec une bobine de radiofréquence du corps entier de la souris polarisée circulairement et transmise commercialement (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) réglée sur 300,16 MHz, la fréquence Larmor du proton ¹H.
   REMARQUE: Cette sonde rf permet l’acquisition de jeux de données 3D avec une résolution isotrope submillimétrique (<150 μm) pendant des scans de nuit couvrant 8-12 h.
4. Détectez la charge tumorale à l’aide de plusieurs séquences³⁰.
   REMARQUE: Le signal hyperintense détecté par une séquence d’imagerie rapide pondérée T₂ avec échos recentrés (RARE) reconnaît l’œdème entourant les tumeurs.
5. Effectuer la séquence RARE 3D avec les paramètres d’acquisition suivants : résolution isotrope de [120 μm]³ ; temps d’acquisition 5 h, 27 min; temps de répétition (TR) = 500 ms; espacement des échos (ES) = 12,7 min; Facteur turbo TFx = 12; temps d’écho effectif (TE_eff) = 76,2 ms; bande passante (BW) = 75 KHz; Taille de la matrice = 284³; champ de vision (FOV) = [4,0 mm]³; nombre de moyennes (Nav) = 6.
6. Détectez les métastases à l’aide des paramètres suivants.
   1. Pour les métastases pigmentées avec éclaircissement du signal, utilisez une séquence d’écho de gradient 3D pondérée T₁ avec les paramètres suivants: résolution isotrope de [120 μm]³ ; temps d’acquisition 2 h, 41 min; TR = 20 ms; temps d’écho (TE) = 4,0 ms; angle de retournement (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Taille de la matrice = 2843; Champ de vision = [34,0 mm]³; Nav = 6.
   2. Pour les métastases non pigmentées et/ou hémorragiques, utilisez un signal hypointense lors de l’acquisition sous une séquence d’écho multigradient (MGE) pondérée en T₂* (MGE 3D, [120 μm]³ résolution isotrope; temps d’acquisition 3 h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 échos; FA = 20°; BW = 100 kHz; Taille de la matrice = 284³; Champ de vision = (34,0 mm)³; Nav = 4.
7. Utilisez les 3 séquences pour quantifier la charge tumorale.
8. Croisez les zones tumorales identifiées lors de l’analyse avec des coupes histologiques pour assurer la précision. Voir les sections 7 et 8.

6. Traitement tissulaire pour le séquençage de l’ARN unicellulaire ou en vrac

1. Euthanasier l’animal en utilisant n’importe quelle méthode approuvée par l’IACUC de l’institution. Voir l’une des procédures décrites dans la NOTE de l’étape 2.6.6.
2. Disséquez les organes d’intérêt et placez-les dans des puits séparés d’une plaque contenant la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sur de la glace. Travaillez rapidement et gardez le tissu sur la glace en tout temps pour maximiser la viabilité cellulaire.
   REMARQUE: Les étapes suivantes sont spécifiques au traitement du cerveau. Ajustez le type de collagénase au tissu spécifique, en fonction de vos besoins.
3. Préparer une plaque de 6 puits avec 3 mL de HBSS dans chaque puits.
4. Pour visualiser et aider à guider la dissection, utilisez un microscope à fluorescence et identifiez les zones marquées.
5. Disséquez les zones fluorescentes et placez les fragments de tissu dans la plaque de 6 puits (1 fragment par puits si des foyers métastatiques individuels doivent être analysés ou plusieurs fragments d’un organe si plusieurs métastases dans le même organe doivent être analysées). Utilisez des lames de rasoir stériles pour hacher le tissu en fragments aussi petits que possible (sans passer plus de 1-2 minutes sur cette étape pour chaque échantillon).
   REMARQUE: Limiter le temps de traitement des tumeurs aide à préserver la viabilité cellulaire.
6. Aspirer et transférer le contenu de chaque puits dans un tube conique de 15 mL.
   REMARQUE: Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour faciliter le transfert de fragments plus gros.
7. Ajouter 1 mL de HBSS au puits et s’assurer que les fragments/cellules tissulaires restants sont transférés dans le tube de 15 mL, qui contiendra un volume final de 4 mL. Ajouter 50 μL de collagénase de type I (40 mg/mL) et 12,5 μL de DNase I (2 000 unités/mL) à chaque tube.
8. Placer les tubes coniques dans un bain-marie chauffé à 37 °C pendant 45 min. Vortex brièvement les tubes coniques toutes les 5 minutes.
9. Préemballez une passoire de 70 μm avec HBSS. Utilisez l’extrémité coiffée d’un tube de microcentrifugation stérilisé ou la partie en plastique d’un piston de seringue et broyez les homogénats tissulaires à travers une passoire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
   REMARQUE: La préhumidification des crépines avec un tampon HBSS ou FACS facilite la déformation.
10. Lavez la passoire avec 1 mL de HBSS. Préemballez une passoire de 40 μm avec HBSS. Filtrer à nouveau chaque échantillon à travers une passoire de 40 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL. Ajouter 1 mL de FBS à la passoire de 40 μm pour la laver. Gardez les tubes coniques sur la glace tout le temps.
11. Remplissez le tube conique à 50 mL avec du DPBS glacé. Faire tourner les cellules (180 × g pendant 10 min à 4 °C). Jetez le surnageant, en veillant à ne pas perdre la pastille de cellule.
    REMARQUE: Pour les échantillons de cerveau, remettre les cellules en suspension dans 2,5 mL de solution de séparation de densité à 38% (diluer dans HBSS et stocker à température ambiante (RT)). Transférer dans des tubes FACS de 5 mL. Tourner pendant 20 min à 800 × g. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 000 μL et retirez la couche supérieure de graisse. Ne laissez pas de graisse sur les parois des tubes. S’il reste de la graisse, tournez à nouveau vers le bas et répétez le processus. Il s’agit d’une étape cruciale . Retirez le reste de la phase liquide (la pastille sera translucide et difficile à visualiser).
12. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (RBC) et incuber pendant 60 s à TA. Éteindre la solution de lyse en ajoutant 20 mL de DPBS.
13. Faire tourner les cellules à 180 × g pendant 10 min à 4 °C. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 2 mL de tampon FACS (5 % FBS dans DPBS).
14. Procéder au tri des cellules étiquetées et/ou à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage de l’ARN en vrac ou unicellulaire.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être filées, congelées et stockées à -80 ° C avant l’isolement de l’ARN pour l’ARN en vrac.

7. Perfusion de tissus animaux et préparation aux analyses immunohistologiques

1. Anesthésier l’animal avec un surdosage de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) cocktail par injection intrapéritonéale avec une seringue à insuline et une aiguille de 28 G.
2. Exposez le cœur par dissection grossière et faites une incision dans l’oreillette droite. Maintenez le cœur doucement en place avec de longues pinces incurvées tournées vers l’avant.
   REMARQUE : Le formol et le paraformaldéhyde (PFA) sont cancérigènes. Lisez la fiche de données de sécurité (FDS), évitez l’exposition aux fumées et portez l’EPI approprié.
3. À l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 22 G et 22 mm, injecter 10 mL de DPBS suivis de 10 mL de PFA à 4 % dans le ventricule gauche.
4. Procédez au prélèvement des organes et chargez-les dans des cassettes histologiques prémarquées. Placez les cassettes dans un récipient de taille appropriée qui contient suffisamment de fixateur (formol) pour couvrir les tissus.
   REMARQUE: Idéalement, le volume fixateur devrait être de 5 à 10 fois le volume des tissus.
5. Fixez les organes à l’intérieur des cassettes histologiques dans 10% de formol pendant 48-72 h. Jetez le formol à 10% et lavez les cassettes deux fois avec 1x DPBS.
6. Commencez le processus de déshydratation en immergeant les cassettes dans de l’éthanol à 70% pendant 2 h. Continuer à immerger les cassettes successivement dans des concentrations croissantes d’éthanol : 80%, 95%, 100% pendant 1 h chacune. Changer la solution à 100% deux fois après 1,5 h. Immergez les cassettes dans du xylène pendant 1,5 h et effectuez trois changements de la solution.
7. Incorporer les cassettes dans de la cire de paraffine à 58-60 °C. Sectionnez les blocs de paraffine. Procéder à la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) ou immunohistochimie.
8. Pour identifier les cellules de mélanome, utilisez l’un de ces marqueurs ou un panneau : S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Dans la mesure du possible, utilisez la coloration de la protéine de l’appareil mitotique nucléaire (NuMA), car il s’agit d’un marqueur cellulaire humain très spécifique.
   REMARQUE: La coloration NuMA offre une délimitation nette entre l’hôte (souris) et les cellules greffées (humain) qui facilite le traitement de l’image et les étapes ultérieures de quantification tumorale.

Figure 2 : Exemples d’images de coloration BLI, brightfield, ex vivo et H&E illustrant l’approche à plusieurs volets pour l’analyse des effets des gènes candidats dans les métastases du mélanome. (A) Images de coloration BLI, (B) BF, (C) ex vivo et (D) H&E. Les images utilisées à des fins d’illustration correspondent à une expérience dans laquelle des cellules de mélanome 131/6-4L transduites avec un shRNA de contrôle non ciblé (shNTC) ou un shRNA ciblant FUT8 ont été injectées à des souris immunodéficientes (NSG). Le silencieux FUT8 a altéré la dissémination métastatique des cellules de mélanome. Barres d’échelle et barre de couleur = p/sec/cm²/sr × 10⁶ (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Abréviations : BLI = imagerie par bioluminescence; H&E = hématoxyline et éosine; shRNA = ARN en épingle à cheveux court; shNTC = shRNA de contrôle non ciblé; NSG = diabète diabétique sévère non obèse immunodéficience combinée gamma; FUT8 = fucosyltransférase 8; BF = champ lumineux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Coloration de la protéine de l’appareil mitotique nucléaire (NuMA) (Figure 3)

1. Utiliser un anticorps anti-NuMA comme marqueur de fuseau mitotique hautement spécifique à l’homme pour l’identification et la quantification de la charge métastatique dans les sections de tissus. 8.1. Une identification très spécifique et sensible des cellules de mélanome est réalisée.
2. Si l’immunohistochimie chromogène pour NuMA est effectuée sur un instrument d’immunocoloration automatique, suivez les étapes décrites³² :
3. Déparaffinez les sections dans le xylène et réhydratez-les en diminuant séquentiellement les concentrations d’éthanol. Gardez les lames immergées pendant 15 min dans du xylène et transférez-les dans de l’éthanol à 100% pendant encore 15 min.
   REMARQUE: Le reste des étapes de réhydratation de l’éthanol (95%, 80%, 75%) durent de 3 à 5 minutes chacune.
4. Rincez les lames à l’eau désionisée.
5. Effectuer la récupération de l’épitope en immergeant les lames dans un récipient (par exemple, un pot de coloration Coplin) dans un tampon de citrate de sodium de 10 mM, pH 6,0, dans un four à micro-ondes de 1200 watts à 100% de puissance pendant 10 min.
6. Utiliser un anticorps polyclonal non conjugué anti-NuMA humain de lapin pour le marquage, dilué à 1:7 000 dans l’albumine sérique Tris-Bovine (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7,2). Exécutez les contrôles positifs et négatifs appropriés en parallèle avec les sections de l’étude.
7. Incuber les lames avec l’anticorps primaire pendant 12 h. Détectez l’anticorps primaire avec un multimère conjugué HRP anti-lapin de chèvre et visualisez le complexe avec de la 3,3-diaminobenzidine et un exhausteur de sulfate de cuivre.
8. Laver les lames dans de l’eau distillée, contre-tacher avec de l’hématoxyline, déshydrater et monter avec un milieu permanent.
   REMARQUE: Les étapes de déshydratation sont l’inverse des étapes de réhydratation décrites à l’étape 8.3. Scannez les diapositives avec le scanner disponible à un grossissement de 20x ou 40x et téléchargez-les dans une base de données.
9. À l’aide d’un logiciel, dessinez des rois pour inclure toutes les cellules colorées par NuMA dans le tissu organique, à l’exclusion des autres parenchymes d’organes et des espaces vides.
10. Ajustez les paramètres pour catégoriser les cellules NuMA-positives et NuMA-négatives tout en utilisant les contrôles positifs et négatifs appropriés pour chaque organe. Utilisez un algorithme logiciel établi pour quantifier le nombre total/pourcentage de cellules NuMA positives pour chaque échantillon.

9. Immunofluorescence des tranches tissulaires

Pour identifier le stade métastatique dans lequel un candidat génétique particulier est nécessaire (par exemple, extravasation vs survie après l’ensemencement), on peut déterminer l’immunofluorescence des tranches tissulaires à différents moments pour suivre la progression des cellules tumorales de l’injection à l’invasion d’organes distants, à l’ensemencement et à la croissance. Cette approche permet l’ajout de marqueurs pour les cellules voisines afin de capturer l’événement d’extravasation et les changements de microenvironnement tumoral^{environnants 33}.

1. Anesthésier l’animal comme décrit à l’étape 7.1.
2. Injecter 100 μg de lectine Lycopersicon Esculentum (Tomate) conjuguée au fluorophore dans le ventricule gauche de chaque animal, 3 min avant la perfusion, pour délimiter l’endothélium vasculaire.
   REMARQUE: Laissez le temps à la lectine de tomate de recirculer dans tout le système.
3. Perfuser l’animal comme décrit aux étapes 7.2-7.3. Prélever les organes d’intérêt et les transférer dans des récipients pré-étiquetés remplis de PFA à 4%. Fixez le tissu pendant 24 à 48 h. Découpez le tissu à l’aide d’un vibratome en tranches de 30 à 50 μm d’épaisseur.
   REMARQUE: L’épaisseur doit être optimisée. Des tranches d’une épaisseur comprise entre 30 μm et 50 μm sont recommandées, en particulier lors de l’imagerie z-stack.
4. Incuber les tranches dans un tampon bloquant (10% de sérum de chèvre normal, 2% de BSA, 0,25% de Triton X-100 dans DPBS) pendant 2 h à RT.
5. Effectuez une expérience d’optimisation de la coloration.
   REMARQUE: Comme le temps de récupération de l’antigène, les tampons utilisés pour la récupération de l’antigène, la température, les différents anticorps / différents lots et le type de tissu influencent la coloration, des expériences d’optimisation sont nécessaires.
6. Ajouter des anticorps primaires à une dilution optimisée et incuber pendant un temps optimisé à une température optimisée (voir les exemples dans le tableau 1).
   REMARQUE : Utiliser des témoins appropriés pour les anticorps primaires/secondaires et les échantillons de tissus non colorés.
7. Lavez les tranches de tissu 3 fois pendant 5 min avec 0,25% de Triton X-100 dans du DPBS.
8. Incuber les tranches de tissu dans un anticorps secondaire dilué dans une solution bloquante pendant le temps souhaité (tableau 1).
9. Lavez les tranches de tissu 3 fois pendant 5 min avec 0,25% de Triton X-100 dans du DPBS.
10. Colorer les noyaux avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué à 1:1 000 dans du DPBS ou un tampon bloquant pendant 5 min.
11. Ajouter 2 gouttes de milieu de montage de fluorescence antifade à un couvercle et monter le tissu sur des lames de verre, en s’assurant que les tranches sont entièrement recouvertes par un support de montage.
    REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air directement sur les tranches car cela déforme la microscopie.
12. Capturez des images confocales avec le microscope disponible à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 60x.
    REMARQUE: Lors de l’acquisition d’images confocales, appliquez les mêmes paramètres de réglage (tension, unités aérées et gain) sur toutes les images de l’expérience.
13. Capturez des images non confocales à l’aide du microscope à 10x, 20x ou 40x.
14. Téléchargez les images dans un logiciel d’analyse d’images et analysez-les en comparant les paramètres de votre choix (c.-à-d. la surface, le nombre, l’intensité des marqueurs ou le contact avec les cellules adjacentes).

Résultats

Les figures suivantes illustrent comment le flux de travail décrit a été appliqué pour l’identification de nouveaux facteurs de métastases de mélanome. La figure 2 résume les résultats d’une étude publiée dans laquelle les effets du silence de la fucosyltransférase FUT8 dans les métastases in vivo du mélanome ont été étudiés²⁶. En bref, l’analyse des données glycomiques des patients humains (obtenues par des réseaux de lectines) et le profilage transcriptomiq...

Discussion

L’objectif de ce rapport technique est d’offrir un flux de travail standardisé de haut en bas pour l’étude des acteurs potentiels dans les métastases du mélanome. Comme les expériences in vivo peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps, les stratégies visant à maximiser l’efficacité et à augmenter la valeur des informations obtenues sont primordiales.

Il est impératif d’utiliser des approches complémentaires tout au long de la procédure pour valider les résultats au sein d’un...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#15 Lame Scapel  ;	WPI	500242	Pour les interventions chirurgicales
#3 Scapel Handle	WPI	500236	Pour les interventions chirurgicales
1 mL Seringue à tuberculine, embout coulissant  ;	BD	309626	Injections
Seringue de 10 ml, embout coulissant	BD	301029	Perfusion
10 % Formol Tamponné Sodique	EK Industries	4499-20L	Pour perfusion/fixateur tissulaire
15 mL Conique	Corning  ;	430052	Culture cellulaire
15 mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylène	Falcon	352196	Culture cellulaire
200 Proof Ethanol	Deacon Labs	04-355-223	Histologie
22G &ndash ; 22mm aiguille	BD	305156	Perfusion
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	J464G	Suture
4 % Carson’s phosphate tamponné paraformaldéhyde  ;	EMS	15733-10	Pour perfusion/fixateur tissulaire
40µ ; m	Corning	431750	Traitement des tissus
5-0 Suture résorbable  ;	Ethicon	6542000	Bouchon
50 mL Conique  ;	Corning  ;	430828	Culture cellulaire
50mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylène	Falcon	352070	Culture cellulaire
7-0 Suture en soie  ;	FST	18020-70	Ligature
70µ ; m	Corning	431751	Tissue processing
Supports de montage anti-décoloration  ;   ;	Vector Labs	H-1000-10	Approximateur d’immunofluorescence
appliquant des pinces, 10cm  ;	WPI	14189	Pour les procédures microchirurgicales
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console  ;
Biospec 7030°	Bruker	7030	Micro IRM
BSA	Bioreg	A941	NuMA Coloration
Castroviejo pince à suture, pointes droites 5,5mm plate-forme d’attachage, 11cm  ;	WPI	WP5025501	Pour les procédures microchirurgicales
Coplin Staining Jar	Bel-Art  ;	F44208-1000	Histologie
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Immunofluorescence
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Manipulation génétique
DNase I	NEB	M0303L	Traitement
des tissus DPBS	Corning	21-030-CM	Traitement des tissus
Extra Sharp Non coated Single Edge Blade	GEM	62-0167	Traitement des tissus
Substrat de matrice extracellulaire  ;	Corning	354234	considérer que le facteur de croissance est réduit (comme alternative)
FBS	Cytiva	SH30910.03	Culture cellulaire
Fiji Image J	Fiji Image J	Logiciel	Immunofluorescence
Chèvre anti-lapin HRP multimère conjugué  ;	Thermo Fisher	A16104	NuMA Coloration du
sérum de chèvre	Gibco	PCN5000	Immunofluorescence
HBSS	Corning	21-020-CV	Traitement des tissus
Hématoxyline  ;	Richard-Allan Scientific  ;	7231	Histologie
Illumina III  ;	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Seringue à insuline 28G - Aiguille 8mm	BD	329424	Injections
Seringue à insuline 31G - Aiguille 6mm  ;	BD	326730
Injections Pince à iris, 10.2cm, Full Curve, dentelée	WPI	504478	Pour la perfusion et les interventions chirurgicales
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Pointe	WPI	WP6570	Pour les procédures microchirurgicales
Kétamine HCl 100mg/mL	Mylan Ind.	1049007	Anesthésie
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Manipulation génétique
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectine, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Marqueur des cellules endothéliales
vasculaires MEM acides aminés non essentiels X 100	Corning	25-025-CI	Culture cellulaire
Ciseaux Metzenbaum	WPI	503269	Pour chirurgical procédures
Unité de micro-injection	KOPF	5000	Injections intracardiaques
NaCl	Fisher	S25877  ;	Coloration NuMA
Aiguille 30G x 25mm	BD	305128	Aiguille d’injection intracardiaque
33G x 15mm	Hamilton	7747-01 Porte-aiguille	d’injection intracarotidienne
, Castroviejo, 14cm, avec serrure, 1,2mm Mâchoires dentelées	WPI	14137-G	Pour les procédures microchirurgicales
NOD. souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ souris	The Jackson Laboratory	005557	Modèle murin
NU/J	The Jackson Laboratory	002019	Modèle murin
Appareil mitotique nucléaire Protéine polyclonale de lapin anti-humaine  ;	Abcam	97585	NuMA Coloration
Pénicilline-Streptomycine 10000U/mL	Gibco	15140122	Culture cellulaire
Percoll	GE	0891-01	solution de séparation de densité  ;
Gants chirurgicaux PI Classic Cardinal	Health	2D72PT75X	Chirurgie
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Manipulation génétique
Povidone-Iodine 10 % Solution	Medline	MDS093943	Surgery
Proparacaine Drops 0.5 %	Akorn Pharma	AX0501	Anesthésique local ophtalmique
Puralube Petrolatum Pommade ophtalmique	Dechra	83592	Lame de rasoir d’anesthésie
Lames à double tranchant	EMS	72000	Rasage et tranchage cérébral du vibrotome  ;
Reflex 9mm EZ Clip  ;	Braintree	EZC-  ; KIT	Fermeture de plaie
RPMI 1640  ;	Corning	10-040-CM	Ciseaux de culture cellulaire
, ressort 10.5cm Str, lames 8mm	WPI	501235	Pour les procédures microchirurgicales
Microtome à lame vibrante semi-automatique	Leica	VT1200	Brain Slice Immunofluorescence
de vaporisateur d’anesthésie monocanal	Kent Scientific	VetFlo-1210S  ;	anesthésie
Smartbox Système de chambre de table et souffleur d’extraction	EZ Systems	TT4000	CO2 Euthanasie
Champ jetable stérile fenêtré	Medline	NON21002
Chirurgie Blouses chirurgicales Aurora stériles non renforcées avec manchons encastrés	Medline	DYNJP2715
Surgery T25 Flask	Corning  ;	430639	Culture cellulaire
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA Coloration
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Immunofluorescence
Pince à attacher Troutman, 10cm, Motif G incurvé, pointe de 0,52 mm avec plate-forme de liaison	WPI	WP505210	Pour les procédures microchirurgicales
Pinces de vaisseau 10G Pression 5x 0,8mm Mâchoires, 5/paquet	WPI	15911	procédures microchirurgicales
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA Logiciel de quantification de la coloration
Xylasine 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anesthésie
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	Histologie