Method Article

Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La métastase est un processus complexe, qui oblige les cellules à surmonter des barrières qui ne sont que partiellement modélisées par des essais in vitro . Un flux de travail systématique a été établi à l’aide de modèles in vivo robustes et reproductibles et de méthodes normalisées pour identifier de nouveaux acteurs dans les métastases du mélanome. Cette approche permet d’inférer des données à des stades expérimentaux spécifiques pour caractériser avec précision le rôle d’un gène dans les métastases. Les modèles sont établis en introduisant des cellules de mélanome génétiquement modifiées par injection intracardiaque, intradermique ou sous-cutanée chez la souris, suivie d’une surveillance par imagerie in vivo en série. Une fois les critères d’évaluation préétablis atteints, les tumeurs primaires et/ou les organes porteurs de métastases sont prélevés et traités pour diverses analyses. Les cellules tumorales peuvent être triées et soumises à l’une des nombreuses plates-formes « omiques », y compris le séquençage de l’ARN unicellulaire. Les organes subissent des analyses d’imagerie et d’immunohistopathologie pour quantifier le fardeau global des métastases et cartographier leur emplacement anatomique spécifique. Ce pipeline optimisé, y compris des protocoles normalisés pour la greffe, la surveillance, la récolte, le traitement et l’analyse des tissus, peut être adopté pour les cultures à court terme dérivées de patients et les lignées cellulaires humaines et murines établies de divers types de cancer solide.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mortalité élevée associée au mélanome métastatique combinée à une incidence croissante de mélanome dans le monde1 (une augmentation estimée à 7,86 % d’ici 2025) nécessite de nouvelles approches thérapeutiques. Les progrès dans la découverte de cibles reposent sur des modèles reproductibles de métastases, un processus très complexe. Tout au long des étapes de la cascade métastatique, les cellules du mélanome doivent surmonter d’innombrables obstacles pour atteindre l’évasion du système immunitaire et la colonisation des tissus éloignés2. La résilience et l’adaptabilité des cellules du mélanome proviennent d’une multitu....

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Protocol

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REMARQUE: Les procédures animales impliquées dans le protocole suivant ont été approuvées par le New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les procédures sont effectuées dans des installations approuvées par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La figure 1 illustre l’approche expérimentale générale.

1. Cultures à court terme de mélanome dérivées du patient (CTS)

  1. Placer le tissu dans une boîte de Petri de 60 mm avec 1 mL de RPMI complet (RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS....

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Results

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Les figures suivantes illustrent comment le flux de travail décrit a été appliqué pour l’identification de nouveaux facteurs de métastases de mélanome. La figure 2 résume les résultats d’une étude publiée dans laquelle les effets du silence de la fucosyltransférase FUT8 dans les métastases in vivo du mélanome ont été étudiés26. En bref, l’analyse des données glycomiques des patients humains (obtenues par des réseaux de lectines) et le profilage transcriptomiq.......

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Discussion

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L’objectif de ce rapport technique est d’offrir un flux de travail standardisé de haut en bas pour l’étude des acteurs potentiels dans les métastases du mélanome. Comme les expériences in vivo peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps, les stratégies visant à maximiser l’efficacité et à augmenter la valeur des informations obtenues sont primordiales.

Il est impératif d’utiliser des approches complémentaires tout au long de la procédure pour valider les résultats au sein d’un.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

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Nous remercions la Division des technologies de recherche avancées (DART) de NYU Langone Health, et en particulier le laboratoire de recherche en pathologie expérimentale, le centre de technologie du génome, le laboratoire de cytométrie et de tri cellulaire, le noyau d’imagerie préclinique, qui sont partiellement soutenus par la subvention de soutien du Perlmutter Cancer Center NIH / NCI 5P30CA016087. Nous remercions le NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr Iman Osman) d’avoir donné accès à des cultures à court terme de mélanome dérivées de patients + (10-230BM et 12-273BM), qui ont été obtenues grâce à des protocoles approuvés par la CIS....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 Lame Scapel  ;WPI500242Pour les interventions chirurgicales
#3 Scapel HandleWPI500236Pour les interventions chirurgicales
1 mL Seringue à tuberculine, embout coulissant  ;BD309626Injections
Seringue de 10 ml, embout coulissantBD301029Perfusion
10 % Formol Tamponné SodiqueEK Industries4499-20LPour perfusion/fixateur tissulaire
15 mL ConiqueCorning  ;430052Culture cellulaire
15 mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylèneFalcon352196Culture cellulaire
200 Proof EthanolDeacon Labs04-355-223Histologie
22G &ndash ; 22mm aiguilleBD305156Perfusion
4-0 Vicryl SutureEthiconJ464GSuture
4 % Carson’s phosphate tamponné paraformaldéhyde  ;EMS15733-10Pour perfusion/fixateur tissulaire
40µ ; mCorning431750Traitement des tissus
5-0 Suture résorbable  ;Ethicon6542000Bouchon
50 mL Conique  ;Corning  ;430828Culture cellulaire
50mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylèneFalcon352070Culture cellulaire
7-0 Suture en soie  ;FST18020-70Ligature
70µ ; mCorning431751Tissue processing
Supports de montage anti-décoloration  ;   ;Vector LabsH-1000-10Approximateur d’immunofluorescence
appliquant des pinces, 10cm  ;WPI14189Pour les procédures microchirurgicales
AvanceBruker3 HDNMR Console  ;
Biospec 7030°Bruker7030Micro IRM
BSABioregA941NuMA Coloration
Castroviejo pince à suture, pointes droites 5,5mm plate-forme d’attachage, 11cm  ;WPIWP5025501Pour les procédures microchirurgicales
Coplin Staining JarBel-Art  ;F44208-1000Histologie
DAPISigma-AldrichD9542-1MGImmunofluorescence
dCas9-KRABAddgene110820Manipulation génétique
DNase INEBM0303LTraitement
des tissus DPBSCorning21-030-CMTraitement des tissus
Extra Sharp Non coated Single Edge BladeGEM62-0167Traitement des tissus
Substrat de matrice extracellulaire  ;Corning354234considérer que le facteur de croissance est réduit (comme alternative)
FBSCytivaSH30910.03Culture cellulaire
Fiji Image JFiji Image JLogicielImmunofluorescence
Chèvre anti-lapin HRP multimère conjugué  ;Thermo FisherA16104NuMA Coloration du
sérum de chèvreGibcoPCN5000Immunofluorescence
HBSSCorning21-020-CVTraitement des tissus
Hématoxyline  ;Richard-Allan Scientific  ;7231Histologie
Illumina III  ;PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
Seringue à insuline 28G - Aiguille 8mmBD329424Injections
Seringue à insuline 31G - Aiguille 6mm  ;BD326730
Injections Pince à iris, 10.2cm, Full Curve, denteléeWPI504478Pour la perfusion et les interventions chirurgicales
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm PointeWPIWP6570Pour les procédures microchirurgicales
Kétamine HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anesthésie
lentiCRISPRv2Addgene98290Manipulation génétique
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectine, DyLight 649InvitrogenL32472Marqueur des cellules endothéliales
vasculaires MEM acides aminés non essentiels X 100Corning25-025-CICulture cellulaire
Ciseaux MetzenbaumWPI503269Pour chirurgical procédures
Unité de micro-injectionKOPF5000Injections intracardiaques
NaClFisherS25877  ;Coloration NuMA
Aiguille 30G x 25mmBD305128Aiguille d’injection intracardiaque
33G x 15mmHamilton7747-01 Porte-aiguilled’injection intracarotidienne
, Castroviejo, 14cm, avec serrure, 1,2mm Mâchoires denteléesWPI14137-GPour les procédures microchirurgicales
NOD. souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ sourisThe Jackson Laboratory005557Modèle murin
NU/JThe Jackson Laboratory002019Modèle murin
Appareil mitotique nucléaire Protéine polyclonale de lapin anti-humaine  ;Abcam97585NuMA Coloration
Pénicilline-Streptomycine 10000U/mLGibco15140122Culture cellulaire
PercollGE0891-01solution de séparation de densité  ;
Gants chirurgicaux PI Classic CardinalHealth2D72PT75XChirurgie
pLKO Tet-OnAddgene21915Manipulation génétique
Povidone-Iodine 10 % SolutionMedlineMDS093943Surgery
Proparacaine Drops 0.5 %Akorn PharmaAX0501Anesthésique local ophtalmique
Puralube Petrolatum Pommade ophtalmiqueDechra83592Lame de rasoir d’anesthésie
Lames à double tranchantEMS72000Rasage et tranchage cérébral du vibrotome  ;
Reflex 9mm EZ Clip  ;BraintreeEZC-  ; KITFermeture de plaie
RPMI 1640  ;Corning10-040-CMCiseaux de culture cellulaire
, ressort 10.5cm Str, lames 8mmWPI501235Pour les procédures microchirurgicales
Microtome à lame vibrante semi-automatiqueLeicaVT1200Brain Slice Immunofluorescence
de vaporisateur d’anesthésie monocanalKent ScientificVetFlo-1210S  ;anesthésie
Smartbox Système de chambre de table et souffleur d’extractionEZ SystemsTT4000CO2 Euthanasie
Champ jetable stérile fenêtréMedlineNON21002
Chirurgie Blouses chirurgicales Aurora stériles non renforcées avec manchons encastrésMedlineDYNJP2715
Surgery T25 FlaskCorning  ;430639Culture cellulaire
TrisCorning46-031-CMNuMA Coloration
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLImmunofluorescence
Pince à attacher Troutman, 10cm, Motif G incurvé, pointe de 0,52 mm avec plate-forme de liaisonWPIWP505210Pour les procédures microchirurgicales
Pinces de vaisseau 10G Pression 5x 0,8mm Mâchoires, 5/paquetWPI15911 procédures microchirurgicales
VisiopharmVisiopharmVisiopharmNuMA Logiciel de quantification de la coloration
Xylasine 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50Anesthésie
XyleneFisherX3P-1GALHistologie
Système Pour

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

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