Method Article

In vitro Caractérisation des chaperons de histones à l’aide d’essais analytiques, de rabattement et de chaperoning

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

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1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une batterie de méthodes qui comprend la chromatographie analytique taille-exclusion pour étudier l’oligomérisation et la stabilité des histones chaperones, le test pull-down pour démêler les interactions hiperon-histone, l’ASC pour analyser la stœchiométrie des complexes protéiques et le test de chaperonnage des histones pour caractériser fonctionnellement un chaperon histones putatif in vitro.

Abstract

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Les protéines d’histone s’associent à l’ADN pour former la chromatine eucaryote. L’unité de base de la chromatine est un nucléosome, constitué d’un octamère d’histones constitués de deux copies des histones centrales H2A, H2B, H3 et H4, enroulées par l’ADN. L’octamère est composé de deux copies d’un dimère H2A/H2B et d’une seule copie d’un tétramère H3/H4. Les histones du noyau hautement chargées sont sujettes à des interactions non spécifiques avec plusieurs protéines du cytoplasme cellulaire et du noyau. Les chaperons d’histones forment une classe diversifiée de protéines qui transportent les histones du cytoplasme dans le noyau et facilitent leur dépôt sur l’ADN, facilitant ainsi le processus d’assemblage des nucléosomes. Certains chaperons d’histones sont spécifiques pour H2A/H2B ou H3/H4, et certains fonctionnent comme chaperons pour les deux. Ce protocole décrit comment des techniques de laboratoire in vitro telles que les essais de pull-down, la chromatographie analytique d’exclusion de la taille, l’ultracentrifugation analytique et le test de chaperonnage des histones pourraient être utilisées en tandem pour confirmer si une protéine donnée est fonctionnelle en tant que chaperon d’histones.

Introduction

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Les nucléosomes composés d’ADN et de protéines histones forment l’unité structurelle de la chromatine et régulent plusieurs événements cellulaires critiques. Les nucléosomes sont repositionnés et remodelés dynamiquement pour rendre l’ADN accessible à divers processus tels que la réplication, la transcription et la traduction 1,2. Les histones qui sont très basiques ont tendance à interagir avec les protéines acides dans le milieu cellulaire ou subissent une agrégation, conduisant ainsi à divers défauts cellulaires 3,4,5

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Protocol

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1. Chromatographie analytique d’exclusion de taille pour élucider le statut oligomère et la stabilité des chaperons d’histones

  1. Analyse du statut oligomérique des chaperons d’histones
    1. Équilibrer une colonne de chromatographie analytique d’exclusion de taille (SEC) de 24 mL avec 1,2 volume de colonne (CV), c.-à-d. 28,8 mL de tampon SEC dégazé [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM de NaCl et 1 mM de β-mercaptoéthanol (β-ME)] à 4 °C (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le type de colonne, la composition du tampon et le pH du tampon peuvent être choisis en fonction de la protéine d’intérêt. Le volume d’injection de....

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Results

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Le domaine nucléoplasmine N-terminal recombinant de la protéine FKBP53 d’Arabidopsis thaliana a été soumis à une SEC analytique. Le volume du pic d’élution a été tracé par rapport à la courbe standard pour identifier son état oligomère. Les résultats analytiques de la SEC ont révélé que le domaine existe en tant que pentamer en solution, avec une masse moléculaire approximative de 58 kDa (Figure 1A,B). De plus, la stabilité thermique et chimique du domaine nucléopla.......

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Discussion

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Ce travail démontre et valide un ensemble complet de protocoles pour la caractérisation biochimique et biophysique d’un chaperon putatif d’histones. Ici, des protéines de la famille NAP exprimées et purifiées par recombinaison, AtNRP1 et AtNRP2, et le domaine nucléoplasmine N-terminal d’AtFKBP53 ont été utilisés pour démontrer les protocoles. Le même ensemble d’expériences pourrait très bien être utilisé pour délimiter les attributs fonctionnels des chaperons d’histones non caractérisés auparavant de n’importe quel organ.......

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Disclosures

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgements

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Les subventions extra-muros accordées à Dileep Vasudevan par le Science and Engineering Research Board, gouvernement indien [CRG/2018/000695/PS] et le Département de la biotechnologie, ministère de la Science et de la Technologie, gouvernement de l’Inde [BT/INF/22/SP33046/2019], ainsi que le soutien intra-muros de l’Institut des sciences de la vie, Bhubaneswar, sont grandement appréciés. Nous remercions Mme Sudeshna Sen et Mme Annapurna Sahoo pour leur aide dans la préparation des histones. Les discussions avec nos collègues, le Dr Chinmayee Mohapatra, M. Manas Kumar Jagdev et le Dr Shaikh Nausad Hossain, sont également reconnues.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide acétique (glaciaire)SigmaA6283
AcrylamideMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrument pour la purification des protéines
Persulfate d’ammonium (APS)SigmaA3678
An-60Ti rotorBeckman Coulter361964Rotor pour l’ultracentrifugation analytique
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA7030
ChloroformSigmaC2432
Coomassie brilliant blue R 250Sigma1.15444
Tube de dialyse (coupure de 7 kDa)Thermo Fisher68700Pour la dialyse d’échantillons de protéines
Dithiothreitol ( DTT)MP Biomedicals100597
Colorant de chargement d’ADNNew England BiolabsB7025S
EDTA sel disodiqueMP Biomedicals194822
Balance électroniqueShimadzuATX224R
EthanolSigmaE7023
Bromure d’éthidium (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SystèmeBio-Rad12009077Pour l’imagerie des gels après coloration
Appareil d’électrophorèse sur gel horizontalBio-Rad1704405Instrument pour l’électrophorèse sur gel d’agarose
Acide chlorhydrique (HCl)Sigma320331
ImidazoleMP Biomedicals102033
Chlorure de magnésium (MgCl2)SigmaM8266
MicropipettesEppendorfZ683779Pour le pipetage de micro-volumes
Mini-PROTEANBio-Rad1658000Instrument pour SDS-PAGE
N,N-méthylène-bis-acrylamideMP Biomedicals800172
Nano goutteThermo FisherND-2000Pour la mesure des concentrations
Agarose Ni-NTAInvitrogenR901-15Billes de résine pour dosage par tirage Optima
AUC ultracentrifugeuse analytiqueBeckman CoulterB86437Instrument pour l’ultracentrifugation analytique
pH-mètreMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Kit d’isolement de plasmideQiagen27104
Protéinase KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plasmide pour le dosage par superenroulement
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseThermo Fisher75002402
Marqueur protéique SDS-PAGEBio-Rad1610317
SEDFITLogiciel gratuit pour les données analytiques d’ultracentrifugation analyse
SEDNTERPLogiciel libre pour estimer la viscosité et la densité du tampon et du volume spécifique partiel d’une protéine
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000Pour le dosage par tirage
Acétate de sodiumSigmaS2889
Chlorure de sodium (NaCl)MerckS9888
Dodécylsulfate de sodium (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Colonne pour la chromatographie analytique d’exclusion stérique
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Colonne pour la chromatographie analytique d’exclusion stérique
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerase IInspiralisWGT102Enzyme utilisée dans essai de superenroulement plasmidique
Base TrisMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UréeMP Biomedicals191450
Bain d’eauNü ; veNB 5Pour le traitement thermique d’échantillons de protéines
&beta ;-mercaptoéthanol (&beta ;-ME)SigmaM6250
Système d’électrophorèsede protéines et d’ADN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nu....

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Histone ChaperonesChromatin AssemblyPull Down AssayAnalytical UltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyPlasmid Super CoilingNucleosome AssemblyH2A H2B DimerH3 H4 TetramerProtein DNA Interaction

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