Étude de conception à mise en œuvre pour le développement et la validation par le patient de diagnostics de commutation de maintien à pied sur papier

La RT-qPCR est restée la technologie de référence pour le diagnostic clinique en raison de son excellente sensibilité et spécificité. Bien que très robuste, la méthode dépend d’équipements et de réactifs coûteux et spécialisés qui nécessitent une distribution et un stockage à température contrôlée. Cela présente des obstacles importants à l’accessibilité de diagnostics de qualité à l’échelle mondiale, en particulier en période d’épidémies et dans les régions où l’accès à des laboratoires bien équipés est limité ^1,2. Cela a été observé lors de l’épidémie de virus Zika de 2015-2016 au Brésil. Avec seulement cinq laboratoires centralisés disponibles pour fournir des tests RT-qPCR, des goulots d’étranglement importants en ont résulté, limitant l’accès aux diagnostics. Cela a été particulièrement difficile pour les personnes vivant en milieu périurbain, qui ont été plus gravement touchées par l’éclosion3,4. Dans le but d’améliorer l’accès aux diagnostics, le protocole présente une plate-forme qui a été développée avec le potentiel de fournir des diagnostics décentralisés, peu coûteux et à haute capacité dans les environnements à faibles ressources. Dans ce cadre, un pipeline de découverte diagnostique a été établi, couplant l’amplification isotherme et les capteurs basés sur des commutateurs à ARN synthétique avec des systèmes d’expression sans cellules à base de papier ^5,6.

Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS), en particulier les systèmes sans cellules à base d’E. coli, constituent une plate-forme attrayante pour un large éventail d’applications de biodétection, de la surveillance environnementale^7,8 au diagnostic des agents pathogènes 5,6,9,10,11,12 . Comprenant les composants nécessaires à la transcription et à la traduction, les systèmes CFPS présentent des avantages significatifs par rapport aux biocapteurs à cellules entières. Plus précisément, la détection n’est pas limitée par une paroi cellulaire et, en général, ils sont de conception modulaire, biosûrs, peu coûteux et peuvent être lyophilisés pour une utilisation portable. La capacité de lyophiliser des réactions basées sur des circuits génétiques sur des substrats tels que le papier ou les textiles permet le transport, le stockage à long terme à température ambiante⁵ et même l’incorporation dans la technologie portable¹³.

Des travaux antérieurs ont démontré que les systèmes acellulaires d’E. coli peuvent être utilisés pour détecter de nombreux analytes, par exemple, des métaux toxiques tels que le mercure, des antibiotiques tels que la tétracycline^7,14, des perturbateurs endocriniens^15,16, des biomarqueurs tels que l’acide hippurique 17, des molécules de détection du quorum associées aux agents pathogènes ^9,18 et des substances illicites telles que la cocaïne 17 et le gamma-hydroxybutyrate (GHB)¹⁹ . Pour la détection spécifique de la séquence des acides nucléiques, les stratégies ont pour la plupart reposé sur l’utilisation de biocapteurs à commutation couplés à des techniques d’amplification isotherme. Les interrupteurs Toehold sont des riborégulateurs synthétiques (également appelés simplement « commutateurs » dans le reste du texte) qui contiennent une structure en épingle à cheveux qui bloque la translation en aval en séquestrant le site de liaison ribosomique (RBS) et le codon de départ. Lors de l’interaction avec leur ARN déclencheur cible, la structure en épingle à cheveux est soulagée et la traduction ultérieure d’un cadre de lecture ouvert rapporteur est activée²⁰.

L’amplification isotherme peut également être utilisée comme diagnostic moléculaire²¹ ; cependant, ces méthodes sont sujettes à une amplification non spécifique, ce qui peut réduire la spécificité et donc la précision du test en dessous de celle de la RT-qPCR ²². Dans les travaux rapportés ici, l’amplification isotherme en amont des capteurs à commutation a été utilisée pour fournir une amplification combinée du signal qui permet une détection cliniquement pertinente des acides nucléiques (femtomolaire à attomolaire). Ce couplage des deux méthodes fournit également deux points de contrôle spécifiques à la séquence qui, combinés, offrent un haut niveau de spécificité. En utilisant cette approche, des travaux antérieurs ont démontré la détection de virus tels que Zika⁶, Ebola⁵, Norovirus 10, ainsi que de bactéries pathogènes telles que C. difficile²³ et Typhoïde¹² résistant aux antibiotiques. Plus récemment, des interrupteurs de maintien sans cellules ont été démontrés pour la détection du SRAS-CoV-2 dans le but de fournir des diagnostics accessibles pour la pandémie de ^{COVID-19 11,12,13}.

Le protocole suivant décrit le développement et la validation du test de prise de pied synthétique sans cellule à base de papier pour la détection du virus Zika, de la conception de biocapteurs in silico , en passant par les étapes d’assemblage et d’optimisation, jusqu’à la validation sur le terrain avec des échantillons de patients. Le protocole commence par la conception in silico de capteurs basés sur des commutateurs à ARN et d’amorces d’amplification isotherme spécifiques de l’ARN viral Zika. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’amplification isotherme, l’utilisation de l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique (NASBA) pour augmenter la concentration de la cible d’ARN viral présente dans la réaction, permettant une sensibilité cliniquement significative a été démontrée. En pratique, les méthodes d’amplification isotherme ont l’avantage de fonctionner à une température constante, éliminant ainsi le besoin d’équipements spécialisés, tels que les thermocycleurs, qui sont généralement limités à des emplacements centralisés.

Ensuite, le processus d’assemblage des capteurs synthétiques de l’interrupteur de maintien avec des séquences de codage de rapporteur par PCR d’extension de chevauchement, et le criblage des capteurs synthétiques de l’interrupteur de maintien du pied pour une performance optimale dans les systèmes sans cellules utilisant de l’ARN synthétique est décrit. Pour cet ensemble de capteurs du virus Zika, nous avons sélectionné le gène lacZ codant pour l’enzyme β-galactosidase, capable de cliver un substrat colorimétrique, le chlorophénol rouge-β-D-galactopyranoside (CPRG), pour produire un changement de couleur jaune à violet qui peut être détecté à l’œil nu ou avec un lecteur de plaque. Une fois que les commutateurs synthétiques les plus performants sont identifiés, le processus de criblage des amorces pour l’amplification isotherme basée sur la séquence d’acide nucléique de la séquence cible correspondante à l’aide d’ARN synthétique pour trouver les ensembles qui offrent la meilleure sensibilité est décrit.

Enfin, les performances de la plateforme de diagnostic sont validées sur site en Amérique latine (Figure 1). Pour déterminer la précision du diagnostic clinique, le test acellulaire sur papier est effectué à l’aide d’échantillons de virus Zika provenant de patients; en parallèle, un test RT-qPCR de référence est effectué à des fins de comparaison. Pour surveiller les tests colorimétriques sans cellules, nous permettons la quantification sur site des résultats dans les régions où les thermocycleurs ne sont pas disponibles. Le lecteur de plaques assemblé à la main appelé Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; ci-après dénommé lecteur de plaques portable) est également présenté ici²⁴. Initialement développé comme un dispositif compagnon pour le diagnostic de l’interrupteur synthétique sans cellule, le lecteur de plaques portable offre un moyen accessible d’incuber et de lire les résultats de manière à haut débit, fournissant une analyse logicielle intégrée basée sur la vision par ordinateur pour les utilisateurs.

Figure 1 : Flux de travail pour tester des échantillons de patients à l’aide de réactions d’interrupteur de maintien sans cellules à base de papier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Toutes les procédures impliquant des participants humains doivent être menées conformément aux normes éthiques et aux directives pertinentes, y compris les principes éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains établis par la Déclaration d’Helsinki de l’Association médicale mondiale. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche humaine sous le numéro de protocole de licence CAAE: 80247417.4.0000.5190. Le Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) a levé le consentement éclairé de tous les patients inclus dans cette étude pour les échantillons diagnostiques.

REMARQUE: L’appareil PLUM sera ci-après dénommé « lecteur de plaque portable ».

1. Conception informatique d’amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques

1. Scanner le génome Zika pour identifier un ensemble de régions candidates à l’amplification d’environ 200 nucléotides (nt) à 300 nt de longueur en plaçant la séquence génomique dans NCBI/Nucleotide BLAST^25,26. Comparer le génome aux séquences d’ARN de référence (refseq_rna) et rechercher des sites qui restent hautement conservés et qui n’ont pas d’homologie avec le génome humain (les autres paramètres BLAST restent inchangés). Sélectionnez au moins deux sites pour concevoir l’interrupteur de maintien synthétique.
2. Utilisez les critères de sélection de Deiman et ^coll.27 pour générer des paires d’amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques avant et inverse pour chaque région d’amplification candidate. En bref, suivez les critères suivants pour concevoir des amorces : (1) teneur en GC entre 40 % et 60 %; (2) 20 à 24 nt de longueur avec une température de fusion de l’ADN supérieure à 41 °C; (3) pas de séries de quatre nucléotides identiques ou plus; (4) le nucléotide final 3' est une base A; (5) faible structure secondaire d’amorce et probabilité de formation de dimères. Criblez 8 à 10 paires d’amorces pour chaque région cible (recommandé).
3. Ajouter la séquence de préfixe contenant la séquence promotrice T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(séquence promotrice T7 soulignée) à l’extrémité 5' des amorces avant pour permettre la transcription des amplicons à l’aide de l’ARN polymérase T7 (RNAP). Commandez les amorces en tant qu’oligos d’ADN auprès d’une société de synthèse d’ADN.

2. Conception informatique des interrupteurs de maintien

1. Installez NUPACK²⁸ version 3.2 (suite de conception d’acide nucléique) en suivant les instructions du site Web²⁹. Utilisez un système d’exploitation UNIX et MATLAB (plate-forme de calcul numérique) comme langage de programmation (recommandé).
2. Identifier les séquences cibles (p. ex. génome viral) spécifiques à l’agent pathogène d’intérêt pour la conception de l’interrupteur de maintien comme à l’étape 1.1. Choisissez les séquences cibles Zika parmi les amplicons basés sur les séquences d’acides nucléiques générés à l’étape 1.2.
   REMARQUE: En pratique, les amorces d’amplification basées sur la séquence d’acide nucléique ou les interrupteurs synthétiques peuvent être conçus et testés en premier, en fonction des besoins des utilisateurs. Si des régions cibles d’intérêt particulières ont déjà été établies (p. ex., à partir de publications ou de protocoles de diagnostic existants), la conception et le criblage des commutateurs peuvent avoir lieu en premier, suivis de la conception et du criblage des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acide nucléique. S’il n’y a pas de régions cibles établies, examinez d’abord les amorces d’amplification basées sur la séquence des acides nucléiques par rapport au génome complet afin de réduire les cibles de choix tout en sélectionnant l’efficacité de l’amplification de l’amorce. Si plusieurs séquences pour l’agent pathogène sont disponibles, il est préférable de concevoir des amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques qui se concentrent sur les régions hautement conservées (plutôt que de cribler l’ensemble du génome).
3. Téléchargez et installez le logiciel MATLAB requis sur l’ordinateur.
4. Configurez les variables d’environnement pour permettre l’appel des fonctions de la suite de conception d’acides nucléiques dans le logiciel. Pour ce faire, ouvrez le logiciel, puis ouvrez (ou créez) un fichier startup.m dans le dossier de travail par défaut. Ensuite, copiez les lignes de code suivantes dans le fichier startup.m et enfin, ajoutez le dossier contenant les fichiers binaires de la suite de conception d’acides nucléiques au PATH :
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('CHEMIN',[getenv('CHEMIN'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Ouvrez le logiciel de la plate-forme de calcul numérique et accédez au dossier du logiciel de conception. Exécutez les algorithmes de conception accessibles à https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Entrez les séquences cibles dans le design_input_file.csv situé dans le sous-dossier d’entrée. Les entrées incluent Nom, Séquence externe, Séquence interne, Température, Nom de sortie et Séquence de sortie comme défini dans le Tableau 1. Si aucun site d’amorçage n’est encore déterminé pour la cible, gardez les séquences intérieures et externes identiques. Seuls les 29 premiers nt du rapporteur seront pris en compte au cours du processus de conception. Lorsque vous avez terminé, enregistrez et fermez la feuille de calcul mise à jour.
   REMARQUE : La séquence de sortie est la séquence de la protéine rapporteur qu’il est prévu d’utiliser pour le dosage (p. ex., lacZ). La spécification des séquences interne et externe garantit que l’algorithme ne générera pas d’interrupteurs de maintien synthétiques qui chevauchent l’une ou l’autre des amorces. Il garantit également que le test reconnaît trois sites uniques dans le génome Zika afin d’améliorer sa spécificité.
7. Sélectionnez les paramètres à utiliser pour la fonction de conception : toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, options). Remplissez les valeurs de paramètre comme suit :
   1. num_designs - le nombre de conceptions supérieures pour chaque sortie cible du logiciel. La valeur par défaut est 6 et peut être modifiée selon les besoins (un minimum de six conceptions pour chaque cible est recommandé).
   2. input_file - ce paramètre spécifie le nom du fichier qui fournit les informations de séquence d’entrée. La valeur par défaut est 'design_input_file.csv' et peut être modifiée si nécessaire.
   3. Choisissez parmi les options suivantes - (1) Série A et Série B : la ou les versions du commutateur de maintien que le code va générer. Réglez SeriesB sur 1 et SeriesA sur 0 pour générer un interrupteur de maintien de la série B, qui est le format utilisé dans le diagnostic du virus Zika⁶; (2) Parallèle : réglé sur 1 pour exploiter plusieurs cœurs afin de calculer les conceptions ; sinon, définissez sur 0 ; (3) Antisens : réglez sur 1 pour générer des interrupteurs de maintien qui hybrident la séquence antisens (c’est-à-dire le complément inverse) de l’entrée cible; sinon, affectez la valeur 0.
8. Exécutez la fonction de conception à l’aide des paramètres sélectionnés : toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). L’algorithme commencera alors à générer les conceptions d’interrupteur de maintien pour les cibles d’intérêt.
9. Une fois la conception terminée, localisez les séquences de conception du commutateur de maintien du pied supérieur et les séquences cibles correspondantes dans le dossier final_designs sous la forme de feuilles de calcul au format .csv. Les séquences d’ADN de l’interrupteur de maintien générées par l’algorithme contiendront la séquence promotrice T7 à l’extrémité 5' et la séquence de liaison 21 nt conservée AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG à l’extrémité 3'.
10. Examinez les séquences de conception de commutateurs de maintien supérieur résultantes par rapport à d’autres virus courants en les plaçant sur NCBI-BLAST et en vérifiant l’homologie des séquences. Acceptez les séquences avec une homologie de 40 % ou moins.
11. Ordonner les séquences en épingle à cheveux de l’interrupteur à pied en tant qu’oligos d’ADN et les assembler plus tard avec le gène rapporteur en commutateurs entièrement fonctionnels. Commandez les amorces PCR nécessaires pour l’assemblage ultérieur du capteur en fonction de la protéine rapporteur choisie.

Tableau 1 : Définition de chaque paramètre utilisé dans le logiciel de conception du commutateur de maintien du pied.

3. Construction d’interrupteurs de maintien par PCR

REMARQUE: Ces étapes décrivent la construction des interrupteurs LacZ par PCR d’extension de chevauchement. Ici, l’oligo d’ADN est utilisé comme amorce directe et le terminateur T7 est utilisé comme amorce inverse. Nous utilisons le plasmide pCOLADuet-LacZ comme matrice pour le gène lacZ (addgene: 75006). Tout autre modèle d’ADN contenant la séquence correspondante peut être utilisé comme modèle, à condition que le terminateur T7 soit inclus dans la construction finale.

1. Une fois que les oligos d’ADN synthétique ont été reçus du fournisseur commercial, préparer des solutions d’ADN synthétique et d’amorce d’amplification inverse à une concentration de 10 μM dans de l’eau exempte de nucléase. Assembler les réactions dans des tubes de PCR sur de la glace conformément au tableau 2.
   REMARQUE: Les volumes PCR peuvent être mis à l’échelle selon les besoins. Utilisez une quantité minimale (0,1-1 ng) de gabarit d’ADN pCOLADuet-LacZ pour éviter d’avoir besoin d’une étape supplémentaire d’élimination du plasmide ou d’un signal LacZ de fond. Pour des quantités plus élevées de matrice d’ADN, suivez la PCR avec un digesteur d’enzymes de restriction DpnI pour éliminer la matrice plasmidique résiduelle.
2. Placer les réactions dans un cycleur thermique, en suivant les conditions de cyclage indiquées dans le tableau 3. Analyser les produits de PCR sur un gel d’agarose (Figure 2; voir Protocole additionnel et³⁰).
3. Purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR à base de colonne de spin et éluez l’ADN dans 15-30 μL d’eau sans nucléase, selon les instructions du fabricant. Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.

Tableau 2 : Composants PCR utilisés pour construire les interrupteurs de maintien des orteils.

Tableau 3 : Conditions de cyclage utilisées lors de la construction des interrupteurs de maintien par PCR.

4. Préparation de la cible d’ARN synthétique (déclencheur)

1. À l’aide d’un logiciel de conception de biologie moléculaire, modifier les modèles d’ARN déclencheurs synthétiques (sélectionnés à l’étape 1.1) pour inclure une séquence promotrice T7 en amont, en veillant à ce que le modèle complet reste court (<200 pb). concevoir des amorces avant et arrière pour amplifier l’amorce de la séquence déclenchement (pour les séquences oligo, voir Protocole supplémentaire).
2. Ordonner les séquences en oligos d’ADN. Une fois reçu, reconstituer l’ADN de déclenchement synthétique et les amorces d’amplification à 10 μM dans de l’eau sans nucléase. Assembler les PCR correspondantes dans des tubes à paroi mince sur de la glace conformément au tableau 2 et utiliser 0,5 μL de l’ultramère d’ADN déclencheur (concentration finale de 0,1 μM) comme ADN matriciel.
3. Placez les réactions dans un thermocycleur et utilisez les conditions de cyclage indiquées dans le tableau 3. Utilisez un temps de prolongation de 15 s. Évaluer la qualité et purifier les produits de PCR déclencheurs tels que décrits à l’étape 3.3 et au Protocole supplémentaire.
   REMARQUE: Pour accélérer le processus, les produits PCR à déclenchement purifiés par colonne peuvent également être directement utilisés pour le dépistage initial de l’interrupteur de maintien du pied.

5. Transcription in vitro de séquences déclenchantes sélectionnées

1. Assembler les composants de réaction sur la glace conformément au tableau 4.
2. Incuber des réactions de transcription in vitro (IVT) à 37 °C pendant 4 h, suivies d’un traitement à la DNase I pour enlever l’ADN modèle. Pour l’étape DNase I, ajouter 70 μL d’eau sans nucléase, 10 μL de tampon 10x DNase I et 2 μL de DNase I (sans RNase), et incuber à 37 °C pendant 15 min. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape 5.4, désactiver la DNase I avec l’ajout de 50 mM d’EDTA et l’inactivation thermique à 65 °C pendant 10 min.
3. Étape facultative : Effectuer une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (p. ex., urée-PAGE) sur les produits de TPI afin d’évaluer la qualité de l’ARN tel que décrit dans le Protocole additionnel.
4. Purifier les produits IVT déclencheurs à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN à base de colonne conformément aux instructions du fabricant, puis quantifier la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide de la spectrophotométrie. Voir Protocole supplémentaire pour obtenir des instructions sur la façon de déterminer la molarité et le nombre de copies/μL de l’ARN.

Tableau 4 : Transcription in vitro (IVT) de séquences déclenchantes sélectionnées.

6. Filtrage initial des commutateurs

REMARQUE : cette section décrit les étapes associées à la configuration des réactions de maintien des orteils sans cellule et à base de papier, et comment rechercher des commutateurs de maintien d’orteil hautes performances. Le papier filtre bloqué BSA utilisé à l’étape 6.10 doit être préparé à l’avance, comme décrit dans le Protocole additionnel.

1. Préparer une solution mère de CPRG en dissolvant 25 mg de poudre dans 1 mL d’eau sans nucléase. Conserver la solution sur glace en tout temps et la conserver à -20 °C pour une utilisation prolongée.
2. Déterminez le nombre de réactions à configurer. Pour chaque interrupteur de maintien évalué, inclure un contrôle sans gabarit (pas d’interrupteur et pas d’ARN cible, autrement connu sous le nom de contrôle seul sans cellule) pour tenir compte de tout signal de fond pouvant découler du mélange principal. Inclure un contrôle de commutation uniquement pour évaluer la fuite du commutateur de fond ou le taux d’arrêt en l’absence d’ARN cible.
3. Assembler un mélange maître réactionnel acellulaire composé de solution A, de solution B, d’inhibiteur de RNase et de CPRG sur glace conformément au protocole standard indiqué dans le tableau 5.
   REMARQUE : Les étapes décrites ici concernent un mélange maître qui sera suffisant pour un ensemble triple de réactions de 1,8 μL avec un volume ajouté de 10 % pour tenir compte de l’erreur de pipetage. Le volume du mixage principal doit être ajusté au besoin en fonction du nombre d’interrupteurs de maintien criblés.
4. Pour chaque triple réaction acellulaire sans cellule, distribuer le mélange principal dans un tube PCR, en gardant tous les tubes sur la glace. Pour le tube mis de côté comme témoin seul sans cellule, ajouter de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 5,84 μL, mélanger en pipetant de haut en bas et centrifuger brièvement. Pour le reste des tubes, ajouter de l’ADN de commutation purifié par PCR à une concentration finale de 33 nM.
5. Pour les tubes mis de côté comme interrupteurs seuls, ajouter de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 5,84 μL. Pour les tubes mis de côté pour tester la combinaison de l’interrupteur de maintien et de l’ARN cible, ajouter in vitro de l’ARN cible transcrit à une concentration finale de 1 μM. Ensuite, ajoutez de l’eau exempte de nucléases à un volume final de 5,84 μL. Bien mélanger toutes les réactions en tuytant de haut en bas et en centrifugeant brièvement.
6. Ajouter 30 μL d’eau exempte de nucléases aux puits entourant les puits de réaction sur une plaque noire à fond clair de 384 puits. Cela minimise l’évaporation au cours de l’expérience et améliore la reproductibilité.
   REMARQUE: Si vous utilisez le lecteur de plaque portable, placez une feuille PCR sur la plaque et utilisez un couteau de précision pour découper les puits destinés à votre réaction, ainsi que chacun des quatre puits d’angle. La feuille PCR empêche la surexposition de la caméra de lecture de plaques portable des puits vides.
7. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 2 mm et d’une pince à épiler, couper les disques de papier filtre bloqués par BSA et les placer dans les puits de réaction soit en éjectant le poinçon, soit à l’aide d’une pince à épiler (voir Protocole supplémentaire pour la préparation du papier filtre bloqué par BSA). Distribuer trois volumes de 1,8 μL de chaque tube de réaction sur les disques de papier filtre de la plaque de 384 puits, en gardant tous les échantillons, ainsi que la plaque de 384 puits, sur la glace en tout temps.
   REMARQUE : Si vous utilisez le lecteur de plaques portatif, ajoutez 1,8 μL de CPRG (0,6 mg/mL) à chacun des quatre coins de la plaque de 384 puits. La couleur jaune du CPRG fournit la reconnaissance de formes au lecteur de plaques portable pour l’alignement du modèle de plaque multipuits numérique dans l’analyse d’image. Couvrir les puits de la plaque avec un film PCR pour éviter l’évaporation.
8. Placer la plaque dans un lecteur de plaque, lire OD₅₇₀ à 37 °C toutes les minutes pendant 130 min.

Tableau 5 : Composants de réaction de transcription-traduction sans cellules PURExpress.

7. Identification des interrupteurs de maintien des orteils hautement performants

REMARQUE: Cette section décrit comment analyser les données de l’étape 6 afin de sélectionner les commutateurs de maintien de pointe les plus performants pour aller de l’avant.

1. Commencez l’analyse des données en normalisant d’abord l’absorbance OD₅₇₀ de fond. Pour ce faire, soustrayez les mesures OD 570 des réactions qui n’ont pas d’ARN commutateur ou cible (c’est-à-dire des puits seuls acellulaires) des autres mesures OD₅₇₀.
2. Lissez les données normalisées à l’aide d’une moyenne mobile à trois points et ajustez la valeur minimale de chaque puits à zéro. Voir la figure 3 pour un exemple de données normalisées de parcours temporel collectées pour les interrupteurs de maintien 27B, 33B et 47B.
3. À l’aide de ces données traitées, calculer le changement de pli (ou rapport ON/OFF) en déterminant la différence dans le taux de changement de couleur (c.-à-d. changement de DO₅₇₀ au fil du temps) entre l’interrupteur de maintien et les puits cibles et interrupteurs seuls (voir Protocole supplémentaire pour le calcul du rapport; Graphique 4).
4. Sélectionnez les interrupteurs avec le changement de pli ON/OFF le plus élevé pour une caractérisation plus approfondie. Omettez les interrupteurs de maintien des orteils peu performants qui affichent le changement de pli le plus bas.

8. Criblage et sensibilité de l’amorce d’amplification basée sur la séquence des acides nucléiques

REMARQUE: Dans les étapes suivantes, un criblage des amorces d’amplification isotherme fonctionnelles est d’abord effectué, puis leur sensibilité est évaluée en déterminant le nombre de copies d’ARN cible par μL d’ARN synthétique qu’un interrupteur de maintien donné peut détecter de manière fiable lorsqu’il est couplé à une amplification isotherme. Après l’amplification isotherme, effectuer des réactions acellulaires pour identifier les ensembles d’amorces d’amplification basés sur la séquence d’acide nucléique réussis. Cependant, il peut être plus rentable d’exécuter des gels de polyacrylamide ou d’agarose sur des réactions d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques pour d’abord réduire le pool d’ensembles d’amorces candidats. Dans ce cas, les ensembles d’amorces d’amplification basés sur la séquence d’acides nucléiques qui génèrent une bande sur le gel à la taille d’amplicon appropriée peuvent être présélectionnés pour un dépistage ultérieur sans cellule.

1. Préparer une solution mère de 25 μM de tous les ensembles d’amorces avant et arrière dans de l’eau exempte de nucléases (voir Protocole additionnel). Déterminer le nombre de réactions d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques et de réactions acellulaires ultérieures qui doivent être mises en place. Cela dépendra du nombre de commutateurs de maintien et des jeux d’amorces respectifs.
   REMARQUE : Lors de l’examen des amorces, il est important de toujours inclure un contrôle sans modèle pour chaque jeu d’amorces afin de tenir compte de tous les artefacts d’arrière-plan pouvant survenir en raison de l’amplification non spécifique associée à l’amorce.
2. Configurez une réaction de 5 μL comme suit (mettez à l’échelle au besoin). Décongeler tous les réactifs sur la glace. Assembler un mélange principal réactionnel composé du tampon réactionnel, du mélange nucléotidique et de l’inhibiteur de la RNase conformément au tableau 6. Bien mélanger en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que le précipité blanc soit solubilisé, puis distribuer les aliquotes dans des tubes de PCR.
   1. Si le mélange maître sert à cribler des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques, exclure d’abord les amorces du mélange maître (distribuer 2,55 μL de mélange maître). Sinon, si vous effectuez une analyse de sensibilité de l’amorce, les amorces peuvent être incluses dans le mélange maître (auquel cas distribuer 2,75 μL d’aliquotes). Ajouter le mélange enzymatique après les étapes de dénaturation et d’équilibre.
3. Si vous filtrez des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques, ajoutez les amorces avant et arrière aux tubes appropriés. Sur un cycleur thermique, configurez le protocole d’incubation comme décrit dans le tableau 7.
4. Ajouter 1 μL d’eau exempte de nucléases ou 1 μL d’ARN déclencheur cible à 2 pM ou environ 10⁶ copies/μL, en veillant à étiqueter les tubes en conséquence. Mélanger par pipetage doux et faire tourner brièvement les tubes.
   REMARQUE : Pour le criblage de l’ensemble d’amorces, utilisez une concentration d’ARN déclencheur cible suffisamment élevée pour ne pas empiéter sur la limite inférieure de détection de la méthode d’amplification isotherme, mais pas assez élevée pour activer l’interrupteur de maintien si aucune amplification ne devait se produire.
5. Déplacez les tubes vers le thermocycleur et commencez l’incubation. Après 12 min, retirez les tubes et ajoutez 1,25 μL du mélange d’enzymes dans chaque tube. Mélanger en tuytant de haut en bas et centrifuger brièvement les tubes.
   NOTE: À ce stade, les tubes peuvent être conservés à température ambiante; Cependant, le mélange d’enzymes doit être conservé sur la glace jusqu’à ce qu’il soit ajouté aux tubes.
6. Remettez les tubes dans le cycleur thermique, en sautant l’étape de maintien à 41 °C pour commencer l’incubation de réaction de 1 h.
   REMARQUE : Après l’incubation, les réactions peuvent être placées sur de la glace pour un traitement le jour même ou congelées à -20 °C pour un traitement ultérieur.
7. Suivez les étapes 6.2 à 6.7 et le tableau 8 pour assembler les réactions de l’interrupteur de maintien sans pile à base de papier afin d’évaluer les performances de l’amorce. Analysez les données comme décrit aux étapes 7.1 à 7.2 et à la figure 3.
   REMARQUE: En plus des contrôles mentionnés précédemment, il est important d’inclure également le contrôle négatif pour tenir compte de tout signal de fond qui pourrait découler de la réaction. En outre, il est important d’inclure également un contrôle avec le commutateur et 2 pM (concentration finale) de l’ARN cible, en tant que contrôle d’amplification sans NASBA.
8. Identifier les paires d’amorces candidates pour aller de l’avant avec l’analyse de sensibilité. Les paires d’amorces sont sélectionnées en fonction de l’activation de l’interrupteur de maintien après l’ajout de la réaction incubée. Si nécessaire, répétez l’écran d’apprêt avec plus de combinaisons d’apprêts.
9. En gardant les échantillons d’ARN sur la glace en tout temps, faites l’ensemble de dilution en série suivant d’ARN cibles dans de l’eau sans nucléase : 10⁴, 10³, 10 2, 10¹ et 10^{0 copies} d’ARN/μL. Répétez l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique et les réactions sans cellules avec les ensembles d’amorces sélectionnés (étapes 8.2-8.7), en testant la série de dilutions en série afin d’identifier les ensembles d’amorces qui offrent la meilleure sensibilité. Voir la figure 5 pour un exemple de résultats permettant de déterminer la sensibilité de l’ensemble d’amorces.
   REMARQUE: Idéalement, l’interrupteur de maintien sélectionné et la paire d’amorces devraient détecter aussi peu que 1 à 100 copies d’ARN cible par μL d’ARN (concentration de solution mère).
10. Répétez l’expérience de sensibilité d’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique en triplat biologique. Cette étape sert à confirmer la reproductibilité des résultats avant de passer à des expériences avec des échantillons de patients.
11. Optionnel: Pour disposer d’une source fiable de l’ADN de commutation pour une utilisation à long terme et pour le transport, clonez la ou les séquences de commutation sélectionnées dans un plasmide en utilisant n’importe quelle méthode de clonage conventionnelle. De même, la séquence d’ARN déclencheur cible peut également être clonée dans un plasmide de choix pour le stockage.

Tableau 6 : Composants de la réaction NASBA.

Tableau 7 : Conditions de réaction pour la NASBA.

Tableau 8 : Composants de réaction acellulaires à base de papier.

9. Prélèvement d’échantillons de patients et extraction d’ARN viral

REMARQUE : Cette section décrit le protocole de prélèvement d’échantillons de patients et d’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit de purification de l’ARN. Le protocole ci-dessous est utilisé pour obtenir du sérum à partir de sang périphérique. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été prélevés chez des patients présentant de la fièvre, un exanthème, une arthralgie ou d’autres symptômes connexes d’infection à arbovirus dans l’État de Pernambuco, au Brésil.

1. Prélever des échantillons de sang périphérique de patients soupçonnés d’être infectés par des arbovirus. Effectuer une ponction veineuse (tube de sang total) en utilisant une technique aseptique standard. Étiquetez les tubes d’échantillon avec un code anonyme et la date de prélèvement de l’échantillon.
2. Centrifuger le sang pour séparer le sérum à 2 300 x g pendant 10 min. À l’aide d’une pipette, préparer des aliquotes de sérum (200 μL) qui seront utilisées pour l’extraction de l’ARN dans des tubes de 1,5 mL.
   REMARQUE : S’il n’est pas possible d’effectuer l’extraction de l’ARN peu de temps après le prélèvement de l’échantillon, les échantillons de sérum doivent être conservés à -80 °C avant les applications en aval.
3. Pipeter 560 μL de tampon AVL (tampon de lyse virale) préparé contenant l’ARN porteur dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 140 μL de sérum au mélange tampon AVL/ARN porteur dans le tube. Mélanger par tourbillon d’impulsions pendant 15 s.
4. Incuber pendant 10 min à température ambiante, puis centrifuger brièvement l’échantillon pour recueillir le contenu au fond du tube. Ajouter 560 μL d’éthanol (96 %-100 %) à l’échantillon et mélanger par tourbillon d’impulsions pendant 15 s. Après mélange, centrifuger l’échantillon pour recueillir le contenu au fond du tube.
5. Ajouter délicatement 630 μL de la solution de l’étape 9.4 à la colonne de rotation sans mouiller la jante. Après cette étape, fermez le bouchon et centrifugez à 6 000 x g pendant 1 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat.
6. Ouvrez délicatement la colonne de rotation et répétez l’étape 9.5. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 500 μL de tampon AW1 (tampon de lavage 1). Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat.
7. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 500 μL de tampon AW2 (tampon de lavage 2). Fermer le bouchon et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat.
8. Pour éviter la contamination par le tampon résiduel AW2, qui pourrait causer des problèmes dans les réactions enzymatiques en aval, placer la colonne de spin dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé avec le filtrat. Centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min.
9. Placer la colonne d’essorage dans un tube propre de 1,5 mL et jeter le tube collecteur usagé avec le filtrat. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 60 μL de tampon AVE (tampon d’élution) équilibré à température ambiante. Après cette étape, fermez le bouchon et incuber à température ambiante pendant 1 min.
10. Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. L’ARN élué peut ensuite être utilisé comme entrée pour les NASBA et RT-qPCR en parallèle.
11. Suivez les étapes 8.3 à 8.11 pour effectuer l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique et les réactions sans cellules à base de papier en utilisant 1 μL d’ARN de patient extrait, en veillant à inclure les réactions de contrôle négatives et positives. Après les réactions, préparer la plaque de réaction à 384 puits et exécuter l’essai dans le dispositif portatif de lecture de plaques à 37 °C (voir détails dans le protocole additionnel).
    REMARQUE : Deux concentrations d’ARN de 10⁴ et 10² UFP/mL, extraites du virus Zika en culture, sont utilisées comme témoins positifs pour toutes les expériences au cours de la validation clinique. En plus des contrôles mentionnés précédemment, il est important d’inclure également le déclencheur (10 ng / μL) comme témoin positif.
12. À la fin de chaque expérience, les données brutes (.csv fichier) du lecteur de plaques prtable peuvent être téléchargées dans une base de données sécurisée en ligne. De plus, le lecteur de plaques portatif génère un rapport indiquant si les échantillons sont positifs ou négatifs pour le virus Zika (Figure 6); voir la section des résultats représentatifs pour des exemples de tous les graphiques obtenus pendant l’incubation (figure 7).
    REMARQUE: Les utilisateurs peuvent également transférer des fichiers du lecteur de plaques portable vers leur propre ordinateur via l’USB.

10. Dispositif portatif de lecture de plaques

1. Le lecteur de plaques portatif (figure 8) peut être utilisé comme alternative à un lecteur de plaques^{conventionnel 24}. Pour le protocole et les résultats représentatifs, voir Protocole additionnel.

11. RT-qPCR pour la détection du virus Zika

REMARQUE : Cette section décrit les étapes à suivre pour effectuer la RT-qPCR pour la détection du virus Zika à partir d’échantillons de patients (voir Protocole supplémentaire).

1. Pour éviter toute contamination, assemblez les composants RT-qPCR dans une zone isolée du processus d’amplification (p. ex., hotte propre). Placez le tampon RT-qPCR, les enzymes et l’amorce/les sondes sur de la glace ou un bloc froid. Ensuite, ajoutez les réactions à une plaque de 384 puits sur glace conformément au tableau 9.
   REMARQUE : Les tests négatifs (contrôle d’extraction et contrôle sans gabarit [NTC]) et positifs (10⁴ UFP/mL) sont recommandés pour toutes les expériences.
2. Après avoir ajouté les réactifs dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, mélanger la réaction en pipetant de haut en bas (ne pas vortex) et distribuer 6,5 μL dans chaque puits. Ajouter 3,5 μL de chaque matrice d’ARN en trois exemplaires.
3. Placez un film PCR sur le dessus de la plaque. Centrifuger la plaque de 384 puits à 600 x g pendant 2 min.
4. Placez la plaque dans une machine RT-qPCR en utilisant les conditions de cyclage suivantes décrites dans le tableau 10. Pour analyser les résultats, utilisez le logiciel de conception et d’analyse de la machine RT-qPCR et tenez compte du seuil automatique et de la ligne de base (voir les détails dans le Protocole supplémentaire).

Tableau 9 : Composants RT-qPCR pour amplifier l’ARN du virus Zika sur la base du protocole des Centers for Disease Control and Prevention (CDC USA) pour détecter le virus Zika à partir d’échantillons de patients³¹.

Tableau 10 : Conditions de cyclage pour la RT-qPCR.

Suite au pipeline de conception informatique, la construction de trois interrupteurs de maintien a été effectuée par PCR. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose (figure 2). La présence d’une bande claire d’environ 3 000 pb, à peu près la taille du gène lacZ couplé à un interrupteur de maintien du pied, indique généralement une réaction réussie. Alternativement, une voie sans bande, plusieurs bandes ou une bande de taille incorrecte indique un échec de la PCR. Dans le cas d’une PCR échouée, les conditions de réaction et/ou les séquences d’amorce doivent être optimisées.

Les interrupteurs de maintien assemblés ont été examinés pour évaluer chaque capteur par rapport à son ARN déclencheur transcrit in vitro respectif (Figure 3). Alors que les trois capteurs affichaient une absorbance OD570 accrue, le commutateur 27B (Figure 3A) avait la vitesse de marche la plus rapide. Les commutateurs 33B et, dans une moindre mesure, 47B ont montré une absorbance OD570 accrue en l’absence d’ARN déclencheur cible, ce qui indique que ces commutateurs possèdent une certaine activité de fond ou une fuite (Figure 3B, C) - une caractéristique non souhaitée dans un capteur candidat car elle peut réduire la spécificité. Pour identifier plus clairement le capteur présentant le rapport de signal ON/OFF le plus élevé, le changement de pli de l’absorbance OD570 a été calculé (voir informations supplémentaires section 5) et tracé (Figure 4). De cette analyse, il est clair que l’interrupteur 27B est le capteur qui a les meilleures performances avec un rapport ON/OFF d’environ 60.

La sensibilité de l’interrupteur de maintien du pied le plus performant (27B) a ensuite été évaluée en déterminant la plus faible concentration d’ARN requise pour activer l’interrupteur de maintien du pied lorsqu’il est couplé à une réaction NASBA. Le graphique illustre que les capteurs Zika les plus performants peuvent détecter l’ARN à des concentrations aussi faibles que 1,24 molécule par μL (équivalent à ~2 aM; Graphique 5).

Après l’identification et la validation du commutateur 27B, les matériaux du capteur ont été distribués aux membres de l’équipe à Recife, dans l’État de Pernambuco au Brésil. Au Brésil, la précision diagnostique clinique de la plateforme de diagnostic du virus Zika a été évaluée à l’aide d’échantillons de patients atteints du virus Zika, parallèlement à la RT-qPCR à des fins de comparaison. Pour valider la plate-forme de diagnostic Zika sur papier, le lecteur de plaques portable a été utilisé, capable d’incuber et de lire la sortie colorimétrique des capteurs à base de papier. Le changement de couleur du jaune au violet est utilisé pour identifier un échantillon positif, tandis qu’un échantillon négatif reste jaune (Figure 6). Une option supplémentaire pour visualiser les résultats générés par le lecteur de plaques portable (Figure 8) consiste à tracer la réponse colorimétrique pour chaque réaction sur papier au fil du temps. Les échantillons ont été testés en triple exemplaire et ceux qui dépassaient le seuil (ligne rouge fixée à 1) ont été considérés comme positifs, tandis que les échantillons inférieurs au seuil ont été considérés comme négatifs (figure 6 et figure 7).

Enfin, pour évaluer et comparer les performances cliniques du capteur de maintien du pied Zika avec la méthode de référence actuelle pour diagnostiquer l’infection par le virus Zika, tous les échantillons de patients ont été testés en parallèle avec la RT-qPCR. Le diagramme d’amplification de deux échantillons représentatifs de patients a été testé en triple exemplaire pour la détection du virus Zika par RT-qPCR (Figure 9). Les échantillons sont considérés comme positifs lorsque la valeur du seuil de cycle (Ct) est de ≤38; la ligne rouge indique un échantillon positif et la ligne bleue indique un échantillon négatif pour le virus Zika.

Figure 2 : Électrophorèse sur gel d’agarose pour évaluer la qualité des produits de PCR. Les produits PCR sont analysés sur un gel d’agarose à 1% dans 1X TAE, fonctionnant à 80 V pendant 90 min. Une seule bande claire indique généralement une réaction réussie. Voie 1 : échelle d’ADN de 1 kb ; Voies 2-4: ADN de commutateur 27B, ADN de déclenchement 33B et ADN de déclenchement 47B, respectivement. Les chiffres sur le côté gauche représentent la taille de la bande en pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Prototypage de trois interrupteurs de maintien pour les capteurs Zika sur papier. La performance de trois capteurs de prise d’orteil à ARN à base de papier a été mesurée à 37 °C pendant plus de 130 minutes. Chaque graphique contient deux traces, l’une représente le contrôle de commutateur uniquement, tandis que l’autre représente le commutateur et le déclencheur. Les trois graphiques représentent les données acquises à l’aide des capteurs de commutation 27B (A), 33B (B) et 47B (C). Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB) de trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les capteurs les plus performants sont identifiés en calculant la variation de pli de l’absorbance à 570 nm. Le changement de pli (ou rapport ON/OFF maximal) est calculé en mesurant le rapport d’absorbance (OD570) à 130 min entre la commande de l’interrupteur uniquement et le test CFPS interrupteur plus déclenchement. Les barres d’erreur représentent le MEB à partir de trois réplications. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Évaluation de la sensibilité du commutateur le plus performant. L’ARN Zika transcrit in vitro est titré en réactions NASBA. Après une incubation de 1 h, les réactions ont été ajoutées aux réactions PURExpress acellulaires sur disques papier dans un rapport de 1:7. Le changement de pli après 130 min à 37 °C est tracé. Ce chiffre a été reproduit à partir de24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Page de capture du lecteur de plaques portable chargée avec les données d’image capturées. Cette figure montre un exemple d’image de l’image finale capturée par le lecteur de plaques portable lors d’une collecte de données. L’horodatage d’origine est visible en haut de l’image. La couleur jaune indique un contrôle ou des réactions négatives, et la couleur violette indique une réaction positive. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Mode d’analyse des données. Sur la gauche, les utilisateurs sélectionnent les ensembles de données qu’ils souhaitent tracer ; Les graphiques sont ensuite affichés à droite avec des couleurs uniques pour chaque échantillon ou jeu de contrôle. La ligne rouge pointillée sert de seuil pour déterminer les échantillons positifs et négatifs. Les échantillons testés en triple exemplaire qui dépassent le seuil sont considérés comme positifs, tandis que les échantillons en dessous du seuil sont considérés comme négatifs. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (ET) de trois répétitions. Ctrl 1 à Ctrl 5 indique les contrôles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 8. PLUM, un lecteur de plaques portable. Ce lecteur de plaques portable agit comme un laboratoire dans une boîte et sert de lecteur de plaques à température contrôlée pour incuber et surveiller les réactions colorimétriques. Cet appareil portable peut fournir des mesures quantitatives et à haut débit des capteurs Zika sur papier sur site. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Graphique RT-qPCR de l’amplification de deux échantillons de patients testés en triple exemplaire pour la détection du virus Zika. Les échantillons sont considérés comme positifs lorsque la valeur du seuil de cycle (Ct) est de ≤38. La ligne pointillée rouge sert de seuil pour déterminer les échantillons positifs et négatifs. La trace rouge indique un échantillon positif et la trace bleue indique un échantillon négatif. La valeur ΔRn (delta Rn) représente l’amplitude normalisée du signal de fluorescence détecté par l’instrument RT-qPCR pour tous les échantillons testés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier du protocole supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Chiffres supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces chiffres. 

K.P. et A.A.G. sont les co-inventeurs de technologies liées aux capteurs de maintien du pied à base de papier. Y.G., S.C. et K.P. sont les cofondateurs de LSK Technologies, Inc. et sont les co-inventeurs des technologies liées au PLUM. M.K., K.P. et A.A.G. sont les cofondateurs d’En Carta Diagnostics Ltd. Les autres auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts. Brevets : Dispositif PLUM : La demande de brevet Y.G., S.C. et K.P. a été déposée par l’Université de Toronto et attribuée à LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 déposée le 27 février 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., et J.J. C. « Riboregulator compositions and methods of use », Brevet. WO2014074648A3 déposé le 6 novembre 2012; Brevet de diagnostic sur papier : K.P. et J.J.C. « Paper-based synthetic gene networks » Brevet américain en instance No. US15/963,831 déposé le 6 décembre 2013; Zika patent 1 : K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., et J.J.C., « Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform », U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 déposée le 4 octobre 2016 ; Zika patent 2 : K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., et J.J.C., « Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform », U. S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 déposée le 25 mai 2016.