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Article de méthode

Le ver du tabac comme système modèle d’insecte pour les études précliniques sur les cannabinoïdes

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DOI :

10.3791/63228

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29 décembre 2021

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1Institute of Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo, 3Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 4Chuncheon Bioindustry Foundation

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole fournit des informations pédagogiques sur l’utilisation du ver du tabac Manduca sexta dans la recherche sur les cannabinoïdes. La méthode décrite ici comprend toutes les fournitures et protocoles nécessaires pour surveiller les changements physiologiques et comportementaux du modèle d’insecte en réponse au traitement au cannabidiol (CBD).

Résumé

Avec une attention accrue portée aux cannabinoïdes en médecine, plusieurs organismes modèles de mammifères ont été utilisés pour élucider leurs fonctions pharmaceutiques inconnues. Cependant, de nombreuses difficultés subsistent dans la recherche sur les mammifères, ce qui nécessite le développement d’organismes modèles non mammifères pour la recherche sur les cannabinoïdes. Les auteurs suggèrent le ver du tabac Manduca sexta comme un nouveau système modèle d’insecte. Ce protocole fournit des informations sur la préparation du régime artificiel avec des quantités variables de cannabidiol (CBD), la mise en place d’un environnement de culture et la surveillance de leurs changements physiologiques et comportementaux en réponse au traitement au CBD. Brièvement, après avoir reçu des œufs de vers de corne, les œufs ont été autorisés à éclore 1 à 3 jours à 25 ° C sur un cycle clair-sombre de 12:12 avant d’être répartis au hasard dans le contrôle (régime artificiel à base de germe de blé; AD), véhicule (AD + 0,1 % d’huile de triglycérides à chaîne moyenne; HUILE MCT) et groupes de traitement (AD + 0,1% MCT + 1 mM ou 2 mM de CBD). Une fois le milieu préparé, les larves du 1er stade ont été placées individuellement dans un tube à essai de 50 ml avec un bâton de brochette en bois, puis le tube à essai a été recouvert d’une étamine. Des mesures ont été prises à intervalles de 2 jours pour les réponses physiologiques et comportementales à l’administration de CBD. Cette procédure de culture simple permet aux chercheurs de tester de grands spécimens dans une expérience donnée. De plus, les cycles de vie relativement courts permettent aux chercheurs d’étudier l’impact des traitements aux cannabinoïdes sur plusieurs générations d’une population homogène, ce qui permet d’obtenir des données à l’appui d’une conception expérimentale dans des organismes modèles de mammifères supérieurs.

Introduction

Au cours des dernières années, l’attention du public a été centrée sur les cannabinoïdes en raison de leur potentiel thérapeutique, y compris le traitement de l’épilepsie1, de la maladie de Parkinson2, de la sclérose en plaques3 et de diverses formes de cancer4,5,6 avec le cannabidiol (CBD). Depuis que le cannabis est légalisé en tant que produit agricole dans la loi sur l’amélioration agricole de 2018, la loi publique 115-334 (le Farm Bill de 2018), le cannabis et ses dérivés cannabinoïdes dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique ont augmenté de manière exponentielle. De plus, des isolats de qualité clinique de cannabinoïdes simples et de mélanges de cannabinoïdes ont été testés avec succès chez des sujets humains7, des lignées cellulaires5,8 et divers systèmes de modèles animaux9,10.

Un essai clinique serait idéal pour valider l’efficacité et les effets indésirables des cannabinoïdes sur une maladie spécifique. Cependant, les essais cliniques présentent de nombreux défis, notamment l’approbation éthique/IRB, le recrutement et la rétention des sujets11. Pour surmonter ces obstacles, diverses lignées cellulaires humaines ont été utilisées parce que les lignées cellulaires d’origine humaine sont rentables, faciles à manipuler, peuvent contourner les questions éthiques et fournir des résultats cohérents et reproductibles, car les lignées cellulaires sont une « population pure de cellules qui n’ont pas de contamination croisée d’autres cellules et produits chimiques»12.

Alves et al. (2021)13 ont testé le CBD de manière dose-dépendante dans les trophoblastes placentaires, qui sont des cellules spécialisées du placenta qui jouent un rôle essentiel dans l’implantation embryonnaire et l’interaction avec l’utérus maternel décidualisé14. Leurs résultats ont montré que le CBD causait une perte de viabilité cellulaire, une perturbation de la progression du cycle cellulaire et une induction de l’apoptose. Ces observations démontrent les effets négatifs potentiels de la consommation de cannabis chez les femmes enceintes13. De même, une série de lignées cellulaires ont également été utilisées pour examiner les effets pharmacologiques du CBD dans les maladies humaines, en particulier diverses formes de cancer. Les études in vitro ont démontré avec succès les effets anticancéreux dans les cellules cancéreuses du pancréas15, du sein8 et colorectal16. Cependant, tout en étant largement disponibles et faciles à manipuler, des lignées cellulaires spécifiques telles que HeLa, HEK293 sont sujettes à des changements génétiques et phénotypiques dus à des altérations de leurs conditions de croissance ou de leur manipulation17.

Dans la recherche sur le cannabis, divers systèmes de modèles animaux, allant de petits animaux tels que mouse18, guinea-pig19 et rabbit19 à de grands animaux tels que canine20, piglet21, monkey22, horse23, ont été utilisés pour explorer des effets thérapeutiques inconnus. Les souris ont été le système modèle animal le plus préféré pour la recherche sur les cannabinoïdes en raison de leur similitude anatomique, physiologique et génétique avec les humains24. Plus important encore, les souris ont des récepteurs CB1/2 dans leur système nerveux, qui sont présents chez l’homme. Ils ont également un cycle de vie plus court que les sujets humains, avec un entretien plus facile et des ressources génétiques abondantes, ce qui facilite grandement la surveillance des effets des cannabinoïdes tout au long d’un cycle de vie. Le système des mammifères est largement utilisé et a démontré avec succès que le CBD soulage les troubles épileptiques1, le trouble de stress post-traumatique9, les ulcères buccaux25 et les symptômes de type démence10. Le modèle murin a également permis une étude de l’interaction sociale des individus au sein d’une communauté, ce qui est extrêmement difficile chez les grands animaux et les humains26.

Malgré tous les avantages du système de modèle animal, il est toujours coûteux et nécessite des soins intensifs lors de l’administration des médicaments et de la collecte de données. En outre, l’utilisation de souris dans la recherche fait l’objet d’un examen minutieux en raison de l’irreproductibilité et de la mauvaise récapitulation des conditions humaines en raison des limites de la conception expérimentale et de la rigueur27.

Avec la demande croissante d’études médicales / précliniques sur les cannabinoïdes, un système modèle non mammifère est nécessaire. Les modèles d’invertébrés conféraient traditionnellement des avantages distincts par rapport aux modèles de vertébrés. Les avantages significatifs comprennent la facilité et le faible coût de l’élevage de nombreux spécimens et permettant aux chercheurs de surveiller plusieurs générations de populations génétiquement homogènes28. Une étude récente a prouvé que la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, était un système modèle d’insecte efficace pour étudier les fonctions pharmacologiques des cannabinoïdes dans la modulation des comportements alimentaires29. Parmi les systèmes modèles d’insectes, les auteurs se sont concentrés sur le ver du tabac, Manduca sexta, également connu sous le nom de papillon de nuit du sphinx de Caroline ou papillon faucon, en tant que nouveau système modèle d’insecte pour la recherche sur les cannabinoïdes.

Manduca sexta appartient à la famille des Sphingidae. L’insecte est le ravageur des plantes le plus commun dans le sud des États-Unis, où il se nourrit de plantes solanacées. Le modèle d’insecte a une longue histoire dans la recherche en physiologie des insectes, biochimie, neurobiologie et études d’interaction médicamenteuse. Le portefeuille de recherche de Manduca sexta comprend un projet de séquence du génome, permettant une compréhension au niveau moléculaire des processus cellulaires essentiels30. Un autre avantage crucial de ce système modèle est sa grande taille, atteignant plus de 100 mm de longueur et 10 g de poids dans les 18-25 jours de développement larvaire. La grande taille permet aux chercheurs de surveiller facilement les changements morphologiques et comportementaux en temps réel en réponse au traitement au CBD. En outre, en raison de la taille, les réponses électrophysiologiques ont été examinées avec le système nerveux abdominal, y compris les ganglions disséqués des larves sans réglages de microscope à haute résolution. Cette caractéristique unique permet aux chercheurs d’étudier facilement les réponses aiguës et à long terme au(x) cannabinoïde(s) administré(s).

Malgré cette polyvalence, M. sexta n’a été exploré que récemment pour sa pertinence en tant que modèle expérimental pour les études sur le cannabis et les cannabinoïdes. En 2019, les auteurs ont utilisé pour la première fois le système de modèle d’insecte pour répondre à l’hypothèse selon laquelle le cannabis a évolué pour produire du cannabidiol afin de se protéger des insectes herbivores30,31. Le résultat a clairement montré que les plantes exploitaient le CBD comme moyen de dissuasion alimentaire et inhibaient la croissance de la chenille de l’insecte ravageur M. sexta, tout en provoquant une mortalité accrue31. L’étude a également démontré les effets de sauvetage du CBD sur les larves d’éthanol intoxiquées, identifiant l’effet véhicule potentiel de l’éthanol en tant que porteur du CBD. Comme montré, le système de modèle d’insecte a efficacement étudié les effets thérapeutiques des cannabinoïdes en 3-4 semaines avec moins de main-d’œuvre et de coûts que les autres systèmes animaux. Bien que le modèle d’insectes manque de récepteurs cannabinoïdes (c’est-à-dire pas de récepteurs CB1/2), le système modèle fournit un outil précieux pour comprendre les rôles pharmacologiques des cannabinoïdes d’une manière indépendante des récepteurs cannabinoïdes.

Les auteurs de cette étude ont déjà travaillé avec le ver du tabac comme système modèle pour la recherche sur les cannabinoïdes31. Après un examen attentif des avantages et des risques de l’utilisation de M. sexta, nous avons fourni une méthode impliquant les soins appropriés et la préparation du régime alimentaire pour les essais précliniques qui permettent des possibilités d’utilisation future en laboratoire préclinique.

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Protocole

1. Préparation du ver de corne et traitement au cannabidiol

  1. Obtenir 150-200 M viable. les œufs de sexta et les régimes artificiels à base de germe de blé (voir tableau des matières).
  2. Placer les œufs de vers de corne dans une boîte de Petri en polystyrène avec une couche de régime artificiel (DA) à base de germe de blé et transférer les œufs dans une chambre d’élevage d’insectes (voir tableau des matériaux) maintenue à 25 °C avec une humidité relative de 40 % à 60 %.
  3. Laisser les œufs de vers du tabac pendant 1 à 3 jours éclore à l’intérieur de la chambre d’élevage d’insectes maintenue à 25 ° C avec une humidité relative de 40% à 60%.
  4. Préparez une solution mère de cannabidiol (CBD) (200 mM) en ajoutant 1,26 g d’isolat de CBD de pureté >98 % dans 20 mL d’huile d’EtOH (preuve 200) ou 100 % d’huile de triglycérides à chaîne moyenne (MCT) (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: L’isolat de CBD est sensible à la lumière, alors manipulez à l’obscurité.
  5. Ajouter 5 mL et 10 mL de la solution mère de CBD de 200 mM aux 1 000 g de DA pour porter les concentrations finales des régimes à 1 mM et 2 mM de CBD, respectivement.
    REMARQUE: Assurez-vous que le régime alimentaire et la solution mère de CBD sont bien mélangés jusqu’à ce qu’un mélange complètement homogène soit formé. Mélanger le stock contenant du CBD contenant de l’AD dans un sac en plastique pendant au moins 45 min à la main.
    ATTENTION : Le mélangeur à café ou tout autre moulin métallique semblait inefficace.
  6. Distribuer 20 g des trois milieux, témoin (AD), véhicule (AD + 0,1% d’huile EtOH ou MCT) et milieu contenant du CBD (AD + 0,1% d’huile EtOH ou MCT + 1 mM / 2 mM de CBD) au fond du tube de 50 mL.
  7. Répartir au hasard les larves du 1er stade (~2 mm de long) individuellement dans un tube à essai de 50 mL et recouvrir d’un couvercle perforé ou d’une étamine (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: Placez le tube à l’envers et faites pousser les insectes dans une chambre d’élevage d’insectes maintenue à 25 ° C avec une humidité relative de 40% à 60%.
  8. Cultivez-les à l’intérieur d’une chambre d’élevage d’insectes (voir tableau des matériaux) maintenue à 25 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.

2. Mesures de la croissance larvaire de M. sexta , de la consommation alimentaire et de la mortalité

  1. Mesurer la croissance larvaire (c.-à-d. la taille et le poids) à l’aide d’une balance analytique et de la mortalité à des intervalles de 2 jours après avoir été transférée dans des contenants individuels jusqu’à ce que la nymphose soit reconnue comme la coloration brun foncé d’une couche d’exocuticule durcie.
    1. Enregistrez la masse initiale (en grammes) de chaque groupe de larves avant d’introduire les larves dans leur régime alimentaire respectif et soustrayez la masse des larves à chaque mesure de la masse initiale pour déterminer les gains de masse entre les stades de développement des larves jusqu’à ce que les larves terminent le stade de nymphose.
    2. Enregistrez le nombre de jours entre les stades de développement de l’étage pour comprendre les différences dans le délai de développement entre les stades de croissance des larves jusqu’à la nymphose sur chaque régime.
      REMARQUE: Grattez les matières fécales du récipient pour éviter toute contamination par la moisissure. Recueillir la matière pour les tests futurs en fonction des objectifs de l’expérience (par exemple, calcul du taux d’accumulation de CBD, profilage microbien). Il est important de manipuler soigneusement l’insecte pendant les périodes fragiles d’apolyse ou d’ecdysis. Lorsque vous sortez les larves d’un récipient, attrapez doucement le corps principal de l’insecte avec une pince à pointe plate et large et ne forcez pas à enlever la couche externe de la peau lorsqu’un insecte est en train de perdre.
  2. Mesurez la consommation alimentaire31 en pesant la perte de régime du récipient entre les larves du 1er stade et la nymphose. Enregistrez les grammes initiaux de régime au début de l’expérience et soustrayez la quantité initiale de la quantité restante de régime alimentaire lorsque les larves sont entrées dans la phase complète de nymphose.
    REMARQUE: Les matières fécales doivent être exclues de la mesure du régime alimentaire. Les matières fécales et autres débris (c.-à-d. les excréments de peau) peuvent être facilement retirés du milieu en plaçant le récipient à l’envers.
  3. Pour les mesures de mobilité, permettre à l’insecte soumis d’acclimater l’environnement de la chambre pendant au moins 5 minutes et suivre les distances31 parcourues par trois groupes d’insectes du 5e stade (80 à 100 mm de longueur) à l’aide d’une chambre de conditionnement de la peur automatisée et informatisée (voir tableau des matériaux).
  4. Analysez la réponse de mobilité31 par vidéo enregistrée 60 images/s pendant 5 min à l’aide d’un logiciel de détection de mouvement (voir Table des matériaux) qui génère un indice de mouvement.

3. Analyse statistique

  1. Analysez les différences dans la croissance larvaire (c.-à-d. la taille et le poids) et l’indice de mouvement par ANOVA unidirectionnelle avec le post-test32 de Tukey.
  2. Utilisez le test log-rank (Mantel-Cox)33 pour comparer les courbes de survie.
    REMARQUE : Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique (voir tableau des matériaux).

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Résultats

Manduca sexta comme système modèle pour examiner la toxicité des cannabinoïdes
La figure 1 illustre les composants clés de l’expérience CBD utilisant le ver du tabac Manduca sexta. Un grand nombre d’insectes (>20) ont été élevés individuellement à 25 °C sur un cycle 12 h:12 h = lumière: obscurité. La taille, le poids et la mortalité des insectes ont été mesurés à des intervalles de 2 jours pour surveiller les réponses à court et à lon...

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Discussion

L’étude sur l’alimentation a démontré que de fortes doses de CBD (2 mM) inhibaient la croissance de l’insecte et augmentaient la mortalité31. Le modèle d’insecte a également montré une sensibilité à l’éthanol; cependant, le CBD a effectivement détoxiqué la toxicité de l’éthanol, augmentant leur taux de survie, leur consommation alimentaire et leurs comportements de recherche alimentaire à des niveaux similaires à ceux du groupe témoin (Figure 3A, B) <...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par l’Institut de recherche sur le cannabis de la Colorado State University-Pueblo et le ministère des Sciences et des TIC (2021-DD-UP-0379) et la ville de Chuncheon (R&D et industrialisation du chanvre, 2020-2021).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Balance analytiqueMettler Instrument Corp.AE100S
Isolat de cannabidiol (>99.4 %)Lilu’s Garden
ÉtamineVWR INTERNATIONAL470150-438
Corning 50mL tubes à centrifuger en polypropylène transparent (PP)VWR89093-192
Alcool éthylique, 200 ProofSigma-AldrichEX0276-1
Chambre de conditionnement de peurCoulbourn Instruments
Chambre d’élevage d’insectesDarwin ChambersINR034
Huile de triglycérides à chaîne moyenne (TCM)Walmart
Logiciel de détection de mouvement (Actimetrics)Coulbourn Instruments
Boîte de Pétri en polystyrène (120 mm x 120 mm x 17 mm)VWR INTERNATIONAL688161
Tabac hormworm artificiel régime alimentaireCarolina Biological Supply CompanyArticle # 143908Prêt à l’emploi Ver à cornes-Diet
Tabac hormwormCarolina Biological Supply CompanyArticle # 143880Unité de 30-50
œufs

Références

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