Article de méthode

Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris

11K vues

⸱

DOI :

10.3791/63253

⸱

10 novembre 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, des cellules endothéliales pulmonaires primaires ont été isolées et cultivées à partir de souris néonatales.

Résumé

Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation du tonus vasculaire, de l’immunité, de la coagulation et de la perméabilité. Le dysfonctionnement endothélial se produit dans des conditions médicales, y compris le diabète, l’athérosclérose, la septicémie et les lésions pulmonaires aiguës. Une méthode fiable et reproductible pour isoler les cellules endothéliales pures de souris est nécessaire pour étudier le rôle des cellules endothéliales dans la pathogenèse de ces conditions et d’autres. Dans ce protocole, des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires ont été préparées à partir de bébés souris néonatals âgés de 5 à 7 jours. Les poumons sont récoltés, hachés et digérés enzymatiquement avec de la collagénase I, et les cellules libérées sont cultivées pendant la nuit. Les cellules endothéliales sont ensuite sélectionnées à l’aide d’IgG anti-PECAM1 (CD-31) conjuguées à des billes magnétiques, et les cellules sont à nouveau cultivées pour confluence. Une sélection cellulaire secondaire se produit ensuite avec des IgG anti-ICAM2 (CD-102) conjuguées à des billes magnétiques pour augmenter la pureté des cellules endothéliales, et les cellules sont à nouveau cultivées à confluence. L’ensemble du processus prend environ 7 à 10 jours avant que les cellules puissent être utilisées pour l’expérimentation. Ce protocole simple produit des cellules endothéliales très pures (pureté >92%) qui peuvent être immédiatement utilisées pour des études in vitro , y compris les études axées sur la production de cytokines endothéliales et de chimiokines, les interactions leucocytaire-endothéliale, les voies de coagulation endothéliale et la perméabilité endothéliale. Avec de nombreuses lignées de souris transgéniques disponibles, cette procédure se prête également à la compréhension de la fonction de gènes spécifiques exprimés par les cellules endothéliales dans les réponses saines et pathologiques aux blessures, aux infections et à l’inflammation.

Introduction

L’intérêt pour l’étude de l’endothélium vasculaire a augmenté récemment, car le dysfonctionnement des cellules endothéliales microvasculaires se produit dans de multiples maladies humaines, telles que les accidents vasculaires cérébraux, les maladies cardiovasculaires, le diabète, les lésions pulmonaires aiguës, la septicémie et les blessures non infectieuses 1,2,3,4,5. Pour définir la pathogenèse de ces conditions et comprendre les rôles de gènes spécifiques dans les réponses protectrices et dérégulées des cellules endothéliales, il est nécessaire de disposer de méthodes fiables pour isoler et cultiver des cellules endothéliales microvasculaires de haute pureté à partir de souris. Alors que de nombreuses études utilisent des cellules endothéliales humaines telles que les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) ou les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HMVEC), il existe de multiples raisons d’utiliser des cellules endothéliales de souris pour étudier la fonction endothéliale et le dysfonctionnement. Premièrement, il existe une hétérogénéité considérable dans les réponses des cellules endothéliales de différents donneurs humains, ce qui entraîne une variabilité des résultats entre les expériences individuelles 6,7,8. Deuxièmement, le silençage des cibles géniques dans les lignées cellulaires humaines primaires peut également conduire à des niveaux d’expression protéique variables 9,10. En revanche, il y a une hétérogénéité minimale dans les réponses des cellules endothéliales de souris11, en supposant que le fond génétique est le même entre les groupes d’étude. En outre, un grand nombre de cellules endothéliales de souris peuvent être préparées en regroupant les poumons de plusieurs souris néonatales. Ces facteurs permettent d’obtenir des résultats plus cohérents et reproductibles entre les expériences. Enfin, la disponibilité de souris knockout ou transgéniques permet également d’isoler des types cellulaires dépourvus de protéines d’intérêt.

Les défis considérables liés à l’isolement de populations saines et pures de cellules endothéliales pulmonaires de souris à l’aide des méthodes publiées 12,13,14,15,16 ont conduit au développement d’une méthode plus fiable et plus simple pour isoler des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires de souris de haute qualité. Les avantages du protocole actuel comprennent l’utilisation de souris néonatales, qui sont facilement disponibles, limitant les coûts d’élevage et de logement. De plus, selon notre expérience, la viabilité des cellules endothéliales de souris néonatales est considérablement plus élevée que celle des cellules endothéliales préparées à partir de souris adultes. Parce que les souris néonatales ont un petit tissu pulmonaire, les cellules endothéliales peuvent être récoltées en digérant les poumons excisés en collagénase plutôt que d’utiliser l’instillation trachéale de collagénase, qui est recommandée pour la collecte sur des souris adultes16. Cela réduit également le temps entre l’euthanasie des souris et l’introduction de leurs cellules endothéliales dans les milieux de culture cellulaire et l’incubateur sans affecter la pureté, le rendement ou la reproductibilité des réponses endothéliales. Enfin, les populations de cellules pures ont été isolées sans cytométrie en flux, ce qui peut endommager ou entraîner une baisse des rendements des cellules endothéliales14,15,17.

Le protocole modifié actuel conduit systématiquement à des cellules endothéliales de haute pureté et viables en 7 à 10 jours qui peuvent être utilisées immédiatement pour des expériences in vitro . L’isolement des cellules directement des animaux knock-out minimise également la manipulation des cellules avant l’expérimentation. Ces méthodes pourraient être utilisées pour étudier le rôle de diverses protéines dans la fonction endothéliale afin de découvrir des cibles thérapeutiques endothéliales pour de multiples maladies.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à San Francisco. Des bébés souris néonatales mâles C57BL/6 (âgés de 5 à 7 jours) ont été utilisés pour l’étude. L’ensemble du protocole prend de 7 à 10 jours (Figure 1).

1. Préparation du milieu cellulaire endothélial

  1. Préparer le milieu basal : milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 4 500 mg/L de glucose et 4 mM de L-glutamine (DMEM) complétés par 20 % (v/v) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 100 U/100 μg/mL de pénicilline/streptomycine et 25 mM de HEPES (voir le tableau des matières). Filtre stérile avec filtre 22 μM. Conserver le milieu basal à 4 °C et l’utiliser dans le mois suivant sa préparation.
  2. Préparer le milieu complet : milieu basal supplémenté avec 100 μg/mL d’héparine, 100 μg/mL de supplément de croissance des cellules endothéliales, 1x acides aminés non essentiels et 1 mM de pyruvate de sodium (voir le tableau des matières). Filtre stérile avec filtre 22 μM. Conserver à 4 °C et utiliser dans le mois suivant la préparation.

2. Prérevêtement de billes magnétiques anti-rats13

  1. Préparer 50 mL de tampon de lavage des billes : Solution tamponnée au phosphate (PBS) additionnée d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % (p/v). Filtre stérile avec filtre 22 μM et conserver à 4 °C et utiliser dans le mois suivant la préparation.
  2. Tourbillonner les billes magnétiques pendant quelques secondes pour remettre en suspension les billes et pipeter 50 μL des billes (2 x 107 billes) dans deux tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL, un pour CD-31 et un pour CD-102 (voir le tableau des matériaux). Ajouter 1 ml de tampon de lavage des billes et bien mélanger.
    REMARQUE: Tous les volumes mentionnés ont été utilisés pour isoler les cellules endothéliales de 3-4 bébés souris néonatals (5-7 jours). CD-31 et CD-102 sont les marqueurs de surface des cellules endothéliales utilisés pour la sélection des immunobilles magnétiques.
  3. Placez les tubes sur un séparateur magnétique et retirez le surnageant avec une pipette Pasteur en verre. Répéter le lavage 3 fois avec 1 mL de tampon de lavage de billes à chaque fois.
  4. Resuspendre les billes dans le volume de perles d’origine, 50 μL, avec tampon de lavage des perles. Ajoutez ensuite 5 μL (2,5 μg) d’anticorps (CD-31/CD-102) à chaque 50 μL de billes.
  5. Incuber la suspension de billes en rotation douce sur un rotateur bout à bout pendant une nuit à 4 °C ou pendant 3 h à température ambiante. Répétez le lavage 4 fois.
  6. Remettez les immunobilles en suspension dans le volume d’origine, 50 μL, avec un tampon de lavage de billes et conservez-les à 4 °C et utilisez-les dans les 1-2 semaines.

3. Isolement et placage des cellules pulmonaires

  1. Préparer la solution de collagénase de type 1 le jour de l’isolement : Ajouter 25 mg de collagénase de type 1 à 25 mL d’HBSS (voir le tableau des matières). Incuber à 37 °C pendant 1 h avec une rotation douce et un filtre stérile à l’aide d’un filtre de 22 μM. Conserver la solution au chaud à 37 °C.
  2. Injecter de l’héparine (25 μL/souris, 1 000 U/mL) 10 min avant l’euthanasie à des bébés de 5 à 7 jours (25 μL/souris, 1 000 U/mL) 10 min avant l’euthanasie pour minimiser l’activation des cellules endothéliales et la formation de caillots14,15.
  3. Euthanasier le chiot souris avec décapitation à l’aide de ciseaux tranchants conformément aux directives 2020 de l’AVMA pour l’euthanasie. Ensuite, épinglez la souris à une planche de dissection avec le côté ventral vers le haut.
  4. Pulvériser la carcasse avec de l’éthanol à 70%, puis exposer la cavité thoracique en coupant d’abord le diaphragme, puis en coupant de manière supérieure vers le haut le long de toutes les parois latérales de la poitrine. Réfléchir la cage thoracique à l’époque expose le cœur et les poumons.
    REMARQUE: Utilisez des pinces et des ciseaux plus petits pour cette étape étant donné la petite taille des souris néonatales, et assurez-vous de ne pas percer le cœur ou les poumons car cela entraînerait une élimination inadéquate du sang des poumons.
  5. Fixez une aiguille de 25 G à une seringue de 10 ml et injectez 5 mL de DMEM froid dans le ventricule droit du cœur pour prélever le sang des poumons. Les poumons deviendront blancs.
  6. Retirez les poumons de la cavité thoracique, un lobe à la fois, en coupant les lobes distaux aux bronches correspondantes.
  7. Regrouper tous les lobes pulmonaires dans un tube conique de 50 mL prérempli de 20 mL de milieu basal glacé (à partir de l’étape 1.1).
  8. Répétez les étapes 3.2 à 3.7 avec les autres bébés souris, en regroupant tous les lobes pulmonaires dans le même tube conique de 50 mL.
  9. Agitez doucement le tube à la main pendant 10-15 s pour laver tout excès de globules rouges visuellement apprécié à la surface des poumons.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le sang de l’intérieur ou autour des poumons; Cependant, cela améliore la pureté. Toute autre manipulation de tissu doit être effectuée dans une cagoule stérile.
  10. Utilisez une passoire cellulaire pour retirer les poumons du milieu et transférez le tissu dans une boîte de culture tissulaire stérile jetable de 100 mm de diamètre et hachez-le avec des ciseaux stérilisés.
  11. Transférer le tissu haché dans le tube conique de 50 ml avec 25 mL de solution de collagénase préchauffée (étape 3.1). Agiter doucement sur un batteur rotatif pendant 45 min à 37 °C.
    REMARQUE: Une surdigestion même pendant 60 minutes peut entraîner une baisse des rendements.
  12. Fixer une seringue de 20 mL à une canule émoussée de 15 G (voir le tableau des matières) et triturer la suspension 10 à 15 fois pour briser le tissu en une suspension cellulaire. Soyez vigoureux, mais évitez de trop mousser.
    REMARQUE: Il n’y aura plus de morceaux visibles du poumon, et à la place, la suspension sera trouble à la fin de cette étape.
  13. Filtrer la suspension à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL. De plus, rincer le tube conique utilisé pour la digestion et la passoire cellulaire avec 15 mL supplémentaires de milieu basal.
  14. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 8 min à 4 °C.
  15. Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur en verre et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu complet. Transvaser dans une fiole T-75 et ajouter 8 mL de culture moyenne complète à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  16. Le lendemain, laver les flacons deux fois avec 10 ml de solution saline équilibrée de Hank’s sans calcium ni magnésium (HBSS/CMF) (voir le tableau des matières) et ajouter 10 ml de milieu complet.
    REMARQUE : Après 2-3 jours, la culture sera confluente à 90-95% et prête pour l’isolement primaire des immunobilles.

4. Isolement primaire des immunobilles et culture de cellules endothéliales

  1. Laver deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 ml de hbss/cmf. Ajouter 2 mL de solution de détachement cellulaire sans trypsine (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Assurez-vous que toutes les cellules ont été retirées de la fiole.
    REMARQUE: Une solution de décollement sans trypsine doit être utilisée à la place de la trypsine car la trypsine peut perturber le marqueur d’adhésion de surface cellulaire CD-31.
  2. Ajouter 8 mL de milieu basal pour neutraliser la solution de décollement cellulaire et transférer le contenu dans un tube conique de 15 mL. Faire tourner à 400 x g pendant 4 min à température ambiante.
  3. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu basal. Transférer la suspension cellulaire de 2 mL dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL (voir le tableau des matériaux).
  4. Perles enduites anti-CD-31 de vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension et ajouter 30 μL de billes pour chaque 2 mL de suspension cellulaire. Fixez le couvercle.
  5. Incuber le tube pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur bout à bout. Placez ensuite les tubes sur un séparateur magnétique et laissez reposer 2 min.
  6. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, aspirer le surnageant. Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant 3 ml de milieu basal au tube et pipette de haut en bas plusieurs fois.
  7. Replacez le tube du séparateur magnétique pendant 2 min, puis aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
  8. Répéter les lavages (étapes 4.6-4.7) au moins 4 fois jusqu’à ce que le surnageant apparaisse clair.
  9. Après le lavage final, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans un milieu de croissance complet de 3 mL et la transférer dans une fiole T-75. Ajouter 7 mL du milieu de croissance complet et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
  10. Le lendemain, lavez les cellules avec HBSS/CMF, puis ajoutez 10 ml de milieu frais complet. Remplacer le média par 10 ml de milieu complet frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce qu’il conflue à 90-95%.
    REMARQUE: Une fois que les cellules sont ~90-95% confluentes, ce qui prend ~3-4 jours, la culture est prête pour l’isolement secondaire de l’immunobille.

5. Isolement et culture de cellules endothéliales d’immunobilles secondaires

  1. Lavez deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 ml de HBSS/CMF. Ajouter 2 mL de solution de détachement cellulaire sans trypsine et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Assurez-vous que toutes les cellules ont été retirées de la fiole.
  2. Ajouter 8 mL de milieu basal pour neutraliser la solution de détachement cellulaire et transférer dans un tube conique de 15 mL. Faire tourner à 400 x g pendant 4 min à température ambiante.
  3. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu basal. Transférer la suspension cellulaire de 2 mL dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL.
  4. Perles enduites anti-CD-102 de vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension et ajouter 30 μL de billes pour chaque 2 mL de suspension cellulaire. Fixez le couvercle.
  5. Incuber le tube pendant 10 min à température ambiante sur un rotateur bout à bout. Placez les tubes sur un séparateur magnétique et laissez reposer 2 min. Puis aspirer doucement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
  6. Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant 3 ml de milieu basal au tube et pipette de haut en bas plusieurs fois.
  7. Replacez le tube du séparateur magnétique pendant 2 min avant d’aspirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
  8. Répétez les lavages (étapes 5.6-5.7) 4 fois ou plus jusqu’à ce que le surnageant apparaisse clair.
  9. Après le lavage final, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans un milieu de croissance complet de 3 mL et la transférer dans une fiole T-75. Ajouter 7 ml de milieu de croissance complet et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  10. Le lendemain, lavez les cellules avec HBSS/CMF, puis ajoutez 10 ml de milieu frais complet. Remplacer le média par 10 ml de milieu complet frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce qu’il conflue à 90-95%. Une fois que les cellules endothéliales sont complètement confluentes, elles sont prêtes pour l’expérimentation. Les cellules ne doivent pas être utilisées au-delà du passage six car la sénescence peut se produire et d’autres types de cellules peuvent prendre le relais.

6. Confirmation des marqueurs de surface des cellules endothéliales par cytométrie en flux

  1. Après avoir utilisé une solution de détachement cellulaire sans trypsine pour détacher les cellules, remettre en suspension la pastille cellulaire à 1 x 10 5 cellules/mL et aliquoter 100 μL de la suspension cellulaire dans trois tubes microcentrifugés de1,5 mL, marqués 1, 2 et 3.
  2. Lavez les cellules avec 1 mL de 1x PBS. Centrifuger à 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez le tampon de lavage et répétez deux fois.
  3. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 100 μL de 1x PBS. Dans le tube 1, ajouter 1 μL d’anticorps conjugué anti-souris CD-31 (PECAM-1) (ex: anticorps anti-souris CD-31 phycoérythrine (PE)) et 1 μL d’anticorps CD-102 anti-souris conjugué (ICAM-2) (ex: anticorps anti-souris CD102 anti-souris isothiocyanate de fluorescéine (FITC)) (voir le tableau des matériaux). Au tube 2, ajoutez les contrôles d’isotype appropriés. Le tube n° 3 restera intact.
  4. Incuber les tubes sur la glace et dans l’obscurité pendant 30-45 min.
  5. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque tube, vortex doucement et centrifuger à 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le lavage et répéter trois fois. Remettez en suspension la pastille finale dans 500 μL de PBS.
  6. Maintenir les tubes recouverts de papier d’aluminium à 4 °C jusqu’à l’analyse. L’analyse doit être terminée dans les 3-4 heures.
  7. Acquérir des données de flux à l’aide d’un cytomètre. Utilisez un échantillon non coloré comme contrôle négatif pour régler correctement la tension laser en fonction de l’autofluorescence de la cellule. Porte la population cellulaire totale avec un tracé de dispersion vers l’avant et un diagramme de dispersion latérale.
    REMARQUE : Après exclusion des doublets, les cellules CD31+ CD102+ double-positives sont définies comme des cellules endothéliales.

Résultats

Ce protocole simple permet d’isoler, de cultiver et de caractériser des cellules endothéliales microvasculaires de souris pendant 7 à 10 jours (Figure 1). Brièvement, les poumons sont excisés et digérés enzymatiquement avant le placage. Immédiatement après le placage, les cellules endothéliales et d’autres cellules flotteront dans les milieux de culture cellulaire. Le lendemain, les cellules endothéliales et les cellules contaminantes seront collées à la plaque, et une technique de lavage vigoureuse est nécessaire pour éliminer les débris et les cellules flottantes. Une fois que les cellules atteignent la confluence, la première sélection d’immunobilles est effectuée. Les cellules CD-31-positives commencent alors à se développer dans une formation pavée (Figure 2). Les cellules qui n’ont pas de morphologie pavée ou qui ne prolifèrent pas sont des contaminants et non des cellules endothéliales13,14,15,16.

Une deuxième sélection d’immunobilles est ensuite effectuée à l’aide de billes enrobées d’anti-CD-102 pour augmenter la pureté des cellules endothéliales, similaire aux autres protocoles13,16. Les cellules qui ont grandi jusqu’à confluer après la deuxième sélection immunobille peuvent ensuite être utilisées pour l’expérimentation. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est utilisé pour confirmer que la population cellulaire est CD-31 et CD-102-positive (Figure 3).

Ces cellules endothéliales peuvent ensuite être utilisées pour de nombreuses applications, telles que l’étude des voies inflammatoires endothéliales et de la fonction de barrière endothéliale. Par exemple, il a été observé que le traitement avec un cytomix murin (IFNg, TNFa et IL1b, chacun à 10 ng / mL) induisait la production d’IL-6 par les cellules endothéliales (Figure 4A). Ensuite, ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing)18 a été utilisé pour mesurer la résistance transendothéliale (TER) au flux de courant électrique à travers les monocouches de cellules endothéliales pulmonaires murines. Il a été observé que les cellules traitées avec cytomix entraînaient une diminution du TER (Figure 4B), ce qui est compatible avec une augmentation de la perméabilité endothéliale. Ces exemples illustrent comment les cellules endothéliales préparées à l’aide de ce protocole peuvent étudier divers processus endothéliaux. Cela permet aux chercheurs d’étudier plus facilement les gènes d’intérêt dans les cellules endothéliales, compte tenu du nombre toujours croissant de souris knockout et transgéniques disponibles.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma d’isolement des cellules endothéliales pulmonaires murines. Les poumons des chiots néonatals âgés de 5 à 7 jours sont récoltés et hachés. Le tissu haché a été digéré enzymatiquement avec de la collagénase I. La suspension cellulaire est plaquée et cultivée pendant 2-3 jours. Les cellules subissent ensuite un isolement primaire de l’immunobille avec des billes enrobées de CD-31 et sont cultivées pendant 3-4 jours supplémentaires. Deuxième isolement de billes immunologiques avec des billes enduites de CD-102 avant la culture de 2-3 jours supplémentaires. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’expérimentation fonctionnelle. L’image a été créée par un outil d’illustration basé sur le Web, Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Morphologie des cellules endothéliales pulmonaires murines. Les cellules endothéliales pulmonaires murines en culture présentent une morphologie pavée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Analyse des cellules endothéliales par cytométrie en flux. (A) Tous les événements sont visualisés sur un graphique à points de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC). (B) Confirmation par nuage de points que les cellules endothéliales pulmonaires murines sont positives pour les antigènes de surface cellulaire spécifiques de l’endothélium CD-31 et CD-102. (C) Histogramme de l’échantillon d’isotype et de l’échantillon coloré avec des anticorps spécifiques CD-31/CD-102. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Le cytomix induit la production d’IL-6 dans les cellules endothéliales pulmonaires murines et la perméabilité des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires murines de souris C57BL / 6 ont été traitées avec cytomix (IFNg, TNFa et IL1b, chacune à 10 ng / mL). (A) Les concentrations d’IL-6 ont ensuite été quantifiées dans les surnageants de culture à 15 h (**p<0,01, n = 4 puits/état). (B) La détection d’impédance cellule-substrat électrique a été utilisée pour mesurer la résistance transendothéliale (TER) à plusieurs reprises sur 15 heures. Les données ont été normalisées à la résistance immédiatement avant l’ajout du cytomix tel que désigné et ont été analysées par analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du post-test de Tukey19 (**p<0,01, n = 4 puits/condition). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole simple se prête aux cellules endothéliales de haute pureté provenant de poumons murins. Bien que le temps total du début à la fin soit de 7 à 10 jours, le temps de pratique est d’environ 3 à 4 h. Par rapport aux autres méthodes13,14,15,16, le protocole actuel est rationalisé, en conservant les étapes essentielles sans compromettre le rendement et la pureté.

Il convient de noter certains aspects essentiels de ce protocole. Tout d’abord, il est important d’utiliser des chiots néonatals plutôt que des souris adultes. D’après notre expérience, les cellules endothéliales de souris adultes ne prolifèrent pas aussi facilement que les cellules de chiots néonatals, et elles sont facilement envahies par des cellules dont la morphologie fusiforme correspond à celle des fibroblastes ou des cellules souches mésenchymateuses15,16. Une explication possible de la différence est que le développement pulmonaire est au stade alvéolaire chez les souris néonatales, caractérisé par la prolifération plus rapide des cellules endothéliales20. Il peut également y avoir un certain degré de sénescence avec le vieillissement21. Le temps de digestion enzymatique doit également être précis, car la sous-digestion peut conduire à une suspension unicellulaire à faible rendement. En revanche, une surdigestion peut entraîner une quantité substantielle de mort cellulaire. Nous avons déterminé que le temps optimal pour la digestion de la collagénase est déterminé à 45 minutes. Ceci est ensuite suivi d’une dissociation mécanique avec une canule émoussée. L’instillation de collagénase intratrachéale au cours de la digestion enzymatique a également été rapportée14,15; Cependant, cela peut prendre beaucoup de temps et conduire à une digestion incomplète pendant les travaux en cours. Enfin, certains protocoles procèdent directement à l’isolement des immunobilles immédiatement après la digestion enzymatique13,16. Nous avons constaté que la culture des cellules du poumon dissocié dans le milieu pendant un jour ou deux avant de faire la sélection de l’immunobille augmente considérablement le rendement des cellules endothéliales viables et très pures. Cela peut être lié à la vitesse à laquelle les cellules isolées pénètrent dans le milieu de culture tissulaire, ce qui entraîne moins de mort cellulaire dans les premiers stades après le retrait des souris, une densité d’ensemencement initiale plus élevée et le temps nécessaire aux cellules endothéliales d’adhérer et de proliférer avant le premier isolement de billes d’immunobilles.

Les limites de la préparation et de l’analyse des cellules endothéliales de souris sont les suivantes. Chaque souris ne fournit qu’un nombre limité de cellules qui doivent être utilisées en quelques passages. Ce problème peut être surmonté en regroupant la digestion pulmonaire de plusieurs souris. Malheureusement, nous n’avons pas réussi dans nos efforts pour cryoconserver et décongeler les cellules pour une utilisation future. Malgré ces limitations, les cellules endothéliales de souris présentent certains avantages. Ils peuvent être utiles, en particulier dans les situations où les cellules endothéliales humaines ne peuvent pas être utilisées (p. ex., élimination génique), lorsque des études complémentaires sont nécessaires pour corroborer les résultats avec des cellules humaines ou lorsque l’hétérogénéité des réponses des cellules endothéliales de différents donneurs humains rend la reproductibilité entre les expériences problématique6. La population homogène de cellules endothéliales de souris génétiquement identiques permet la reproductibilité entre les expériences et l’étude de gènes et de voies spécifiques dans des conditions de fond stables.

Les cellules endothéliales de souris peuvent être utilisées pour de multiples applications afin de fournir des informations sur l’activation endothéliale et le dysfonctionnement dans différents processus pathologiques. Par exemple, les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la septicémie, contribuant à la fois aux réponses bénéfiques et pathologiques par leur rôle dans l’activation de l’inflammation localisée et systémique, la promotion du trafic et de l’activation des leucocytes dans les tissus, la régulation de la coagulation et la modulation de la perméabilité endothéliale 2,22,23 . Ce protocole simple fournit des cellules endothéliales viables et fonctionnelles qui peuvent être utilisées dans des tests pour chacun de ces processus endothéliaux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH T32GM008440 (JH / EW) et NIH R01AI058106 (JH). Nous reconnaissons le noyau de cytométrie en flux du Parnassus de l’UCSF (RRID:SCR_018206) soutenu en partie par la subvention NIH P30 DK063720 et par la subvention d’instrumentation NIH S10 1S10OD021822-01.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
50 mL coniquesCorning Life Sciences430829
Accutase Solution de détachement de cellulesInnovative Cell Technologies, IncAT-104
BD PrecisionGlide Aiguille 25 g x 5/8 poBecton Disckinson305122
BioRender.comémoussée BioRender
15 g x 1-1/2 po8881202314
CD-102 Anti-souris pour rats (3C4 (MIC2/4))BD Biosciences553326
CD-31 Anti-souris pour rats (MEC 13.3)BD Biosciences557355
Collagénase, Type 1Worthington Biochemical CorpLS004194
DMEM, haute teneur en glucoseGibco11965092
Dynabeads Mouton Anti-Rat IgGInvitrogen11035
Supplément de croissance cellulaire endothélialeEMD Millipore Corp02-102
Filtres à cellules Falcon (70 µ ; m)Corning Life Sciences352350
Sérum de veau fœtal, inactivé par la chaleurGibco10082-147
Ciseaux finsOutils pour les sciences fines14060-09
Ciseaux finsOutils pour les sciences14060-10
Fisherbrand Pipettes jetables en verre borosilicatéPasteur Fisher Scientific13-678-20B
FITC Rat Anti-souris CD102 (3C4)BD Biosciences557444
FITC Rat IgG2a,  ; &kappa ; Contrôle des isotypes (R35-95)BD Biosciences553929
Graefe ForcepsFine Science Tools11050-10
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénolGibco14175095
Héparine sodique injectables (1 000 unités/mL)Medline0409-2720-02
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcineSigmaH3393
HEPES (1 M)Gibco15630106
Acides aminés non essentiels (100x)Gibco11140050
PE Rat Anti-souris CD31 (MEC 13.3)BD Biosciences553373
PE Rat IgG2a,  ; &kappa ;   ; Contrôle des isotypes R35-95)BD Biosciences553930
Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL, 10 000 & micro ; g/mL)Gibco15140122
Recombinant Murin IFN-&gamma ;Peprotech315-05
Murin recombinant IL-1&beta ;Peprotech211-11B
Recombinant murin TNF-& alpha ;Peprotech315-01A
Tubes à essai en polystyrène à fond rondCorning Life Sciences352058
Semken ForcepsFine Science Tools11008-13
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360070
Stericup Quick Release-GP Système de filtration stérile sous vide, 250 mLMilliporeS2GPU02RE
Steriflip-GP Unité de filtration supérieure à tube de centrifugeuse stérileMiliporeSCGP00525
Seringue stérile (10 mL)Fisher Scientific14-955-459
Seringue stérile (20 mL)Fisher Scientific14-955-460
Fiole de culture cellulaire T-75 avec bouchon d’aération, traitée CellBINDCorning Life Sciences3290
Canule

Références

  1. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
  2. Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
  3. Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
  4. Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
  5. Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
  6. Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
  7. Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
  8. Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  9. Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
  10. Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
  11. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  12. Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
  13. Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
  14. Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
  15. Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
  16. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).
  17. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227(2019).
  18. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  19. Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
  20. Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55(2015).
  21. Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
  22. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
  23. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Isolement de cellules endoth lialesCellules endoth liales de sourisS lection par billes magn tiquesDigestion la collag naseCellules CD31 positivesCellules CD102 positivesCulture de cellules endoth lialesPerm abilit endoth lialeEssai de fonction barri re
Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.