Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

Summary

Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Abstract

Chez les cyanobactéries, le phycobilisome est un complexe protéique d’antenne vital qui récolte la lumière et transfère de l’énergie aux photosystèmes I et II pour la photochimie. L’étude de la structure et de la composition du phycobilisome est d’un grand intérêt pour les scientifiques car elle révèle l’évolution et la divergence de la photosynthèse chez les cyanobactéries. Ce protocole fournit une méthode détaillée et optimisée pour casser efficacement les cellules cyanobactériennes par un batteur de perles. Le phycobilisome intact peut ensuite être isolé de l’extrait cellulaire par ultracentrifugation par gradient de saccharose. Cette méthode s’est avérée adaptée aux cyanobactéries modèles et non modèles avec différents types de cellules. Une procédure étape par étape est également fournie pour confirmer l’intégrité et la propriété des phycobiliprotéines par spectroscopie de fluorescence 77K et SDS-PAGE coloré par sulfate de zinc et bleu de Coomassie. Le phycobilisome isolé peut également être soumis à d’autres analyses structurelles et compositionnelles. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un guide de départ utile qui permet aux chercheurs qui ne connaissent pas les cyanobactéries d’isoler et de caractériser rapidement les phycobilisomes intacts.

Introduction

Le phycobilisome (PBS) est un énorme complexe pigment-protéine soluble dans l’eau qui se fixe au côté cytoplasmique des photosystèmes dans les membranes thylakoïdes des cyanobactéries1. Le PBS est principalement composé de phycobiliprotéines colorées et de protéines linker ^incolores1,2. Les phycobiliprotéines peuvent être divisées en quatre grands groupes : la phycoérythrine, la phycoérythricyanine, la phycocyanine et l’allophycocyanine3. Les quatre grands groupes absorbent différentes longueurs d’onde d’énergie lumineuse dans la gamme de 490 à 650 nm, que les ch....

Protocol

La Synechocystis sp. PCC 6803, la souche modèle tolérante au glucose, a été obtenue auprès du Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, le filamenteux non modèle, a été obtenu auprès du Dr Donald A. Bryant à la Pennsylvania State University, aux États-Unis.

1. Culture cellulaire et récolte

1. Inoculez des cellules Syn6803 ou JSC-1 à l’aide d’une boucle d’inoculation métallique dans une fiole conique de 100 mL contenant 50 mL de milieu B-HEPES28. Cultiver les cellules à 30 °C sous 50 μmol photons ^{m-2 s-1} (LED à lumière blanche) ....

Results

Les cellules Syn6803 et JSC-1 ont été cultivées dans des flacons coniques avec agitation constante en milieu B-HEPES à 30 °C, sous une lumière blanche LED (photons ^m-2s-1 de 50 μmol) dans une chambre de croissance remplie de 1% (v/v) de _CO2. À la phase de croissance exponentielle (_OD750 = ~0,5), les cellules ont été sous-cultivées en milieu frais avec une densité optique finale _OD750 = ~0,2. Après avoir atteint la phase de croissance exponentielle tardive (_OD750.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple et standard pour isoler le PBS intact dans deux types de cyanobactéries, le modèle unicellulaire Syn6803 et le non-modèle filamenteux JSC-1. Les étapes critiques du protocole sont l’homogénéisation cellulaire et l’ultracentrifugation sur un gradient de densité discontinu de saccharose. Généralement, la perturbation des cellules filamenteuses est plus compliquée que les cellules unicellulaires. L’augmentation de la quantité de matière première (le poids humide de la pastille cellulai.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Billes de verre de 0,1 mm	BioSpec	11079101	pour extraction PBS
Tube de centrifugation de 13 mL Tube de centrifugation	Hitachi	13PA	Ultracentrifugation
40 mL	Ultracentrifugation	Hitachi	40PA
Acide acétique	Merck	8.1875.2500	pour coloration au bleu de Coomassie
B-HEPES medium			Un milieu cyanobactérien modifié à partir du milieu BG-11
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	pour la coloration au bleu de Coomassie Bleu de
bromophénol	Wako pure chemical industries	2-291	Tampon de chargement de protéines
Balance électronique	Radwag	WLC 2/A2/C/2	pour la mesure du poids humide des pastilles de cellules
Spectrophotomètre de fluorescence	Hitachi	F-7000	Spectrophotomètre
Glycérol	BioShop	Gly001.500	Tampon de chargement de protéines
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse	Hitachi	CR22N	pour l’échange
tampons Leptolyngbya sp. JSC-1			du Dr Donald A. Bryant de l’Université d’État de Pennsylvanie, États-Unis.
Accessoire de mesure à basse température	Hitachi	5J0-0112	L’accessoire comprend un récipient Dewar transparent pour la spectroscopie de fluorescence 77K.
Méthanol	Merck	1.07018,2511	pour coloration au bleu de Coomassie
Microcentrifugeuse	Thermo Fisher	Pico 21	pour l’extraction PBS
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Modèle 607	pour l’extraction PBS
Phosphate de potassium dibasique	PanReac AppliChem	121512.121	pour l’extraction PBS
Phosphate de potassium monobasique	PanReac AppliChem	141509.121	pour l’extraction PBS
Flacon à bouchon à vis	BioSpec	10832	pour l’extraction PBS
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	pour la détection du signal de coloration Znic
Dodécylsulfate de sodium	Zymeset	BSD101 Tampon de	chargement de protéines
Saccharose	Zymeset	BSU101	pour l’isolation
PBSSynechocystis sp. Souche tolérante au glucose PCC 6803			du Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taïwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	tampon de charge protéique
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	pour l’extraction PBS
Filtre centrifuge à membrane Ultra 10 K	Millipore	UFC901024	pour l’échange
de tamponFiltre centrifuge à membrane Ultra 3 K	Millipore	UFC500324	pour l’échange de tampon
Ultracentrifugeuse	d’ultracentrifugation	Hitachi	CP80WX
Spectrophotomètre	Agilent	Cary 60	Sulfate
zinc	PanReac AppliChem	131787.121	pour coloration Znic
&beta ;-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	Tampon de chargement de protéines