Imagerie par autofluorescence pour évaluer le métabolisme cellulaire

Résumé

Ce protocole décrit l’imagerie par fluorescence et l’analyse des coenzymes métaboliques endogènes, du dinucléotide réduit en nicotinamide adénine (phosphate) (NAD(P)H) et du dinucléotide de flavine adénine oxydé (FAD). L’imagerie par autofluorescence du NAD(P)H et du FAD fournit une méthode non destructive sans étiquette pour évaluer le métabolisme cellulaire.

Résumé

Le métabolisme cellulaire est le processus par lequel les cellules génèrent de l’énergie, et de nombreuses maladies, y compris le cancer, sont caractérisées par un métabolisme anormal. La réduction de la nicotinamide adénine (phosphate), du dinucléotide (NAD(P)H) et de la flavine adénine dinucléotide (FAD) oxydée sont des coenzymes de réactions métaboliques. Le NAD(P)H et le FAD présentent une autofluorescence et peuvent être isolés spectralement par des longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Les deux coenzymes, NAD(P)H et FAD, peuvent exister dans une configuration libre ou liée aux protéines, chacune ayant une durée de vie de fluorescence distincte - le temps pendant lequel le fluorophore reste à l’état excité. L’imagerie par durée de vie de fluorescence (FLIM) permet de quantifier l’intensité de fluorescence et la durée de vie du NAD(P)H et du FAD pour une analyse sans étiquette du métabolisme cellulaire. L’intensité de fluorescence et la durée de vie des microscopes peuvent être optimisés pour l’imagerie NAD(P)H et FAD en sélectionnant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Les perturbations métaboliques par le cyanure vérifient les protocoles d’imagerie par autofluorescence pour détecter les changements métaboliques dans les cellules. Cet article démontrera la technique d’imagerie par autofluorescence du NAD(P)H et du FAD pour mesurer le métabolisme cellulaire.

Introduction

Le métabolisme est le processus cellulaire de production d’énergie. Le métabolisme cellulaire englobe de multiples voies, y compris la glycolyse, la phosphorylation oxydative et la glutaminolyse. Les cellules saines utilisent ces voies métaboliques pour générer de l’énergie pour la prolifération et la fonction, comme la production de cytokines par les cellules immunitaires. De nombreuses maladies, y compris les troubles métaboliques, le cancer et la neurodégénérescence, sont caractérisées par une altération du métabolisme ^cellulaire1. Par exemple, certains types de cellules cancéreuses ont des taux élevés de glycolyse, même en présence d’oxygèn....

Protocole

1. Placage cellulaire pour l’imagerie

1. Aspirer le milieu à partir d’une fiole T-75 confluente à 80-90% de cellules MCF-7, rincer les cellules avec 10 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 2 mL de trypsine à 0,25% (1x) pour détacher les cellules du fond de la fiole.
2. Incuber la fiole à 37 °C pendant environ 4 min. Vérifiez les cellules au microscope pour confirmer le détachement.
3. Ajouter immédiatement 8 mL de milieu de culture pour désactiver la trypsine.
4. Recueillir les cellules dans un tube conique (15 mL ou 50 mL). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
5. Centrif....

Résultats

La lignée cellulaire du cancer du sein épithélial, MCF-7, a été cultivée dans du DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine. Pour l’imagerie par fluorescence, les cellules ont été ensemencées à une densité de 4 × ¹⁰⁵ cellules par antenne d’imagerie à fond de verre de 35 mm 48 h avant l’imagerie. Les cellules ont été imagées avant et après le traitement au cyanure en utilisant les protocoles énoncés ci-dessus. L’objectif de l’expérience au cyanure est de confirmer l’isol.......

Discussion

L’intensité de l’autofluorescence et l’imagerie à vie ont été largement utilisées pour évaluer le métabolisme dans les ^{cellules21,55}. FLIM est à haute résolution et résout donc les cellules individuelles, ce qui est important pour les études sur le cancer car l’hétérogénéité cellulaire contribue à l’agression tumorale et à la résistance aux médicaments7,39,41,44,45,46,58.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-désoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000 ; AC111980010 ; AC111980050 ;
Antibiotique Antimicrobien (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples American	Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Logiciel d’analyse d’images Tube
conique	VWR	89039-664	15 mL Tube conique
DMEM	ThermoFisher	11965092	Milieu de culture
Miroir dichroïque FAD	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
Filtre d’excitation FAD	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Plat à fond en verre	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Laser multiphotonique	cohérent	N/A	2P Laser cohérent, accordable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H miroir dichroïque	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
Filtre d’émission NAD(P)H	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
Filtre d’excitation NAD(P)H	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Cyanure de potassium	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Logiciel d’acquisition d’images
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Logiciel d’analyse de la durée de vie de la fluorescence
Stage Top Incubateur	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urée	Sigma-Aldrich	U5128
Perles YG	Polysciences	19096-2	Microsphères Yg (20.0 µ ; m)