Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Résumé

Le cil primaire est un organite de signalisation critique trouvé sur presque toutes les cellules qui transduit les stimuli de signalisation Hedgehog (Hh) de la surface cellulaire. Dans le précurseur des cellules granulaires (GCP), le cilium primaire agit comme un centre de signalisation pivot qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs en modulant la voie de signalisation Hh. L’étude de la machinerie de signalisation Hh primaire dépendante du cilium est facilitée par la manipulation génétique in vitro des composants de la voie pour visualiser leur localisation dynamique vers le cilium primaire. Cependant, la transfection des transgènes dans les cultures primaires de GPC à l’aide des méthodes d’électroporation actuellement connues est généralement coûteuse et entraîne souvent une faible viabilité cellulaire et une efficacité de transfection indésirable. Cet article présente un protocole d’électroporation efficace, rentable et simple qui démontre une efficacité de transfection élevée d’environ 80 à 90% et une viabilité optimale des cellules. Il s’agit d’une méthode de modification génétique simple, reproductible et efficace qui est applicable à l’étude de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium dans les cultures primaires de BPC.

Introduction

Les GCP cérébelleux sont largement utilisés pour étudier la machinerie de la voie de signalisation Hh dans les types de cellules progénitrices neuronales en raison de leur grande abondance et de leur grande sensibilité à la voie de signalisation Hh in vivo1,2,3,4. Dans les GCP, le cilium primaire agit comme un pivot de transduction du signal ^Hh5 qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs6,7,8. La vis....

Protocole

Toutes les procédures liées aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de manipulation des animaux et au protocole approuvé par le ministère de la Santé de Hong Kong. Les licences d’expérimentation animale conformément à l’ordonnance sur les animaux (contrôle des expériences) (cap. 340) ont été obtenues auprès du ministère de la Santé du gouvernement de Hong Kong. Le travail sur les animaux a été effectué conformément à l’éthique de la sécurité animale approuvée par le bureau de recherche et le comité de sécurité des laboratoires de la HKBU. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dan....

Résultats

En utilisant l’Opti-MEM (voir le tableau des matériaux) comme réactif universel, cette méthodologie d’électroporation proposée pourrait atteindre une efficacité d’électroporation constamment élevée à ~ 80-90% (Figure 1). L’efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP a été déterminée à DIV 2 après l’électroporation par quantification du pourcentage de cellules vertes à fluorescence positive dans toutes les cellules GCP exprimant la protéine 6 de la boîte appariée (Pax6)........

Discussion

La transfection de transgènes en culture primaire de BPC par électroporation est généralement associée à une faible viabilité cellulaire et à une faible efficacité de transfection9,10. Cet article présente un protocole d’électroporation rentable et reproductible qui a démontré une efficacité et une viabilité élevées. En outre, nous démontrons également une méthode simple d’étude de la voie de signalisation Hh dépendante du cilium primaire dans les cellules GCP pr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GCP Culture
B27 supplément	Life Technologies LTD	17504044
Filtre à cellules, 70 µ ; m	Corning	352350
DNase I du pancréas bovin	Roche	11284932001
Earle' s Solution saline équilibrée	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualifié	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitut
L-cystéine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Matrice de membrane basale
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain, suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Agoniste lissé
IF coloration
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Mélange d’anticorps primaires
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Facteur de dilution : 1 : 1000
Souris monoclonale anti-Arl13b ab	NeuroMab	75-287 Facteur de	dilution : 1 : 1000
Anti-Pax6 lapin polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Facteur de dilution : 1 : 1000
Secondary antibody mixAlexa
Fluor 488 âne anti-chèvre IgG	Invitrogen	A-11055	Facteur de dilution : 1 : 1000
Alexa Fluor 555 âne anti-souris IgG	Invitrogen	A-31570	Facteur de dilution : 1 : 1000
Alexa Fluor 647 âne anti-lapin IgG	Invitrogen	A-31573	Facteur de dilution : 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Facteur de dilution : 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chambre	Nepagene	CU500
Cuvette d’électroporation EPA (espace de 2 mm)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	milieu sérique réduit pour transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super électroporateur NEPA21 TYPE II Électroporation in vitro et in vivo Électroporation	Nepagene	NEPA21