Method Article

Génération d’un modèle Hook Ischemia-Reperfusion à l’aide d’un embryon de poussin en développement de trois jours

DOI:

10.3791/63288

⸱

February 19th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Restorative Neurology, Department of Biotechnology, Era’s Lucknow Medical College Hospital, Era University, 2Era University, 3Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Era University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit la modélisation de l’ischémie-reperfusion (I / R) dans un embryon de poussin de 3 jours à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale pour mieux comprendre le développement et le traitement de l’I / R. Ce modèle est simple, rapide et peu coûteux.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ischémie et les troubles de la reperfusion (I / R), tels que l’infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies vasculaires périphériques, sont quelques-unes des principales causes de maladie et de décès. De nombreux modèles in vitro et in vivo sont actuellement disponibles pour étudier le mécanisme I/R dans la maladie ou les tissus endommagés. Cependant, à ce jour, aucun modèle in ovo I/R n’a été rapporté, ce qui permettrait de mieux comprendre les mécanismes I/R et d’accélérer le dépistage des drogues. Cet article décrit la modélisation I/R à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale dans un embryon de poussin de 3 jours pour comprendre les mécanismes de développement et de traitement de l’I/R. Notre modèle peut être utilisé pour étudier les anomalies au niveau de l’ADN, de l’ARN et des protéines. Cette méthode est simple, rapide et peu coûteuse. Le modèle actuel peut être utilisé indépendamment ou en conjonction avec des modèles I/R in vitro et in vivo existants.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lésions tissulaires d’ischémie-reperfusion ont été liées à un certain nombre de pathologies, notamment les crises cardiaques, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les traumatismes et les maladies vasculaires périphériques1,2,3,4,5. Cela est principalement dû à l’absence d’une compréhension globale de la progression de la maladie et à l’absence d’un modèle de recherche efficace. Une lésion ischémique se produit lorsque l’apport sanguin à une zone spécifique du tissu est coupé. En conséquence, le tissu ischémique finit par se nécroser, bien que le taux varie en fonction du tissu. Par conséquent, la restauration de l’approvisionnement en sang peut aider à atténuer les dommages. Cependant, il a été observé, dans certains cas, que la reperfusion provoque plus de dommages tissulaires que l’ischémie seule6,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de l’ischémie-reperfusion est nécessaire pour développer une intervention thérapeutique efficace. À l’heure actuelle, aucun traitement efficace pour les lésions I/R n’est connu. Cette disparité a incité à la création de nouveaux modèles expérimentaux, allant des modèles in vitro aux modèles in vivo, pour résoudre le problème existant9,10,11,12,13.

Les embryons de poussins (Gallus gallus domesticus) sont largement utilisés dans la recherche en raison de leur facilité d’accès, de leur acceptabilité éthique, de leur taille relativement grande (par rapport à d’autres embryons), de leur faible coût et de leur croissance rapide14. Nous avons utilisé un embryon de poussin à 72 h de développement pour créer un in ovo I/R en obstruant et en libérant l’artère droite de vitelline à l’aide d’une aiguille spinale. Nous l’avons nommé le modèle Hook-I/R ischemia-reperfusion (Figure 1). Le modèle utilisé dans cette étude est capable de simuler avec précision tous les processus en aval, y compris les voies oxydatives et inflammatoires, qui sont fréquemment associées à des dommages I/R15,16,17.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le comité d’éthique animale institutionnelle du Lucknow Medical College and Hospital d’Era a émis une renonciation écrite indiquant qu’aucune approbation formelle n’était requise pour mener ces expériences conformément au Comité aux fins du contrôle et de la supervision des expériences sur les animaux (CPCSEA). Cependant, les procédures opérationnelles normalisées ont été suivies afin de minimiser tout risque de détresse embryonnaire.

1. Préparation du tampon (tableau 1)

  1. Préparer la solution de Ringer
    1. Pour préparer la solution de Ringer, dissoudre 0,72 g de NaCl (123 mM), 0,017 g de CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g de KCl (4,96 mM) dans 70 mL de H2O distillé stérile, avec un volume final de 100 mL. Ajustez le pH à 7,4. Laissez-le se dissoudre complètement et autoclaver. Ensuite, filtrez à travers un filtre de 0,22 μm, aliquote en quantités à usage unique (environ 10 mL) et conservez à température ambiante.
  2. Préparer une solution saline normale (chlorure de sodium à 0,9 %, NaCl).
    1. Dans 70 mL de H2O distillé stérile, dissoudre 0,9 g de NaCl (154 mM). Porter le volume à 100 mL. Autoclave pendant 15 min à 121 °C. Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH si nécessaire. Faire des aliquotes de 10 mL dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL et conserver à température ambiante.
  3. Préparer de l’éthanol à 70 % (v/v).
    1. Mélanger 70 mL d’éthanol pur (Mol. wt. 46,07 g/L) à 30 mL de H2O stérile. Préparer au besoin ou conserver à température ambiante. Il n’y a pas besoin de stérilisation.
  4. Préparez 1x phosphate buffer Saline (1x PBS).
    1. Préparer 100 mL de 1x PBS en ajoutant 0,144 g de Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g de NaCl (136,8 mM), 0,2 g de KCl (26,8 mM), 0,2 g de KH2PO4 (14,6 mM) à 70 mL d’eau distillée. Dissoudre et porter le volume à 100 mL et autoclaver pendant 15 min à 121 °C. Porter le pH à 7,4, en ajoutant quelques gouttes de 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, si nécessaire. Faire des aliquotes de 10 mL dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL et conserver à température ambiante.

2. Jour 1

  1. Disposez tous les outils nécessaires à la stérilisation des œufs (éthanol à 70%, lingettes nettoyantes, un porte-œufs et un marqueur OHP).
  2. Nettoyez les œufs de 0 jour avec 70% d’éthanol à l’aide de lingettes en papier de soie. Utilisez seulement un œuf de 0 jour, car les œufs plus âgés peuvent ne pas donner naissance à un embryon.
  3. Écrivez la date actuelle sur les œufs avec un marqueur OHP.
  4. Placez les œufs dans un incubateur à œufs réglé à une température de 36-37 ° C et à un taux d’humidité de 60% à 65%. Incuber les œufs pendant les 24 heures suivantes.

3. Jour 2

  1. Disposez l’équipement nécessaire pour le retrait de 5 à 6 mL d’albumine (ciseaux à bord tranchant, seringue de 5 mL, aiguille de 18 G, déflateur de seringue et ruban adhésif).
  2. Essuyez les ciseaux chirurgicaux avec 70% d’éthanol ou stérilisez-les à l’aide d’un autoclave après les avoir essuyés avec 70% d’éthanol.
  3. Maintenant, prenez l’œuf de l’incubateur à œufs à 37 ° C pour la superposition.
  4. Placez l’œuf sur une grille à œufs propre.
  5. Fixez un petit morceau de ruban adhésif (taille: environ 1 pouce de longueur x largeur) au bord de l’œuf.
  6. Faites un petit trou dans le bord de la coquille d’œuf à l’aide de ciseaux à bord pointu. Insérez une seringue de 5 mL à un angle approximatif de 75°.
    REMARQUE: La seringue de 5 mL est livrée avec une aiguille de 24 G x 1 (stérile), mais il est bon de remplacer l’aiguille de 24 G x 1 par une aiguille de 18 G x 1,5 (stérile). L’aiguille de 18 G x 1,5 mesure 1,25 x 38 mm de largeur. Par conséquent, il facilitera l’élimination de l’albumine.
  7. Après avoir inséré l’aiguille dans le sac vitellin, retirez lentement 5 à 6 mL d’albumine.
    REMARQUE: Cela fournit à l’embryon un lit sur lequel il peut se développer. Le retrait de l’albumine empêche le débordement d’albumine tout en établissant une fenêtre. Enfin, le risque que l’embryon soit endommagé pendant le fenêtrage est atténué en éliminant 5 à 6 mL d’albumine.
  8. Après avoir retiré l’albumine, refermer l’ouverture avec du ruban adhésif et laisser les œufs incuber à 37 °C pendant 48 h.

4. Jour 4

  1. Préparez la solution de Ringer, une solution saline normale à 0,9 % et 1x PBS comme décrit à la section 1 du protocole. Ensuite, autoclavez les trois solutions. Après l’autoclavage, placez la solution respective à température ambiante.
  2. Sortez l’œuf de l’incubateur à 37 °C et coupez la coquille en une forme circulaire. Avant de couper la coquille d’œuf, couvrez la zone à couper avec du ruban adhésif.
    REMARQUE: Couvrir la zone de la fenêtre avec du ruban adhésif empêche la rupture de la coquille d’œuf dans des endroits indésirables. Cependant, si vous vous introduisez dans un endroit indésirable, scellez la zone avec le ruban adhésif. Couvrir les endroits à couper avec du ruban adhésif empêche les morceaux de coquille de tomber sur le sac vitellin.
  3. Créez un petit trou dans la coquille d’œuf avec un ciseau de bord pointu à l’endroit où la fenêtre est souhaitée et commencez à couper une ouverture circulaire. Ce processus est connu sous le nom de fenêtrage.
    REMARQUE: Assurez-vous que la coupe circulaire est suffisamment grande pour permettre un accès facile à l’embryon de n’importe quelle direction. Si nécessaire, modifiez la position de l’œuf pour l’adapter à la position de l’embryon.
  4. Ensuite, à l’aide d’un microscope chirurgical à zoom stéréo, localisez l’artère vitelline droite (RVA).
    REMARQUE: Les embryons de poulet subissent normalement une torsion thoracique (ainsi qu’une flexion cervicale, etc.) à mesure qu’ils se développent, de sorte que le côté gauche de la tête est contre le jaune au stade de 72 h. Plus caudalement, là où les artères vitelline sortent du corps, l’embryon n’est pas très tordu, et cette partie du corps se trouve du côté ventral vers le bas vers le jaune. Ainsi, en regardant directement, le droit de l’embryon est à la droite du chercheur.
  5. Une fois le RVA localisé, créez deux petits trous sur les côtés gauche et droit du RVA à l’aide d’une aiguille de 26 G (Figure 2).
  6. Placez la sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler au-dessus du RVA. Assurez-vous que la sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler est placée à 5 ± 1 mm du site de l’ischémie et vers l’extrémité distale de l’ARV. Prenez une lecture de flux pendant 2 min et 30 s (ou plus si vous le souhaitez). Ce sera la lecture de la phase normoxique.
  7. Entre-temps, à l’aide d’une pince nasale et d’une pince dentée, moulez manuellement le bord de l’aiguille vertébrale en forme de crochet (Figure 3). Pour ce faire, pliez le bord de l’aiguille rachidienne sur environ 1 mm. Une taille plus grande rendra plus difficile l’insertion et le retrait de l’aiguille vertébrale pendant la procédure I / R.
  8. Insérez l’aiguille vertébrale directement sous l’artère vitelline droite à l’aide d’un micromanipulateur.
    REMARQUE: Insérez l’aiguille vertébrale avec une extrême prudence pour éviter d’endommager le RVA ou les artères adjacentes. La technique optimale consiste à ajuster le crochet personnalisé de l’aiguille spinale exactement au-dessus du côté droit du trou RVA, puis à insérer progressivement le bord personnalisé de l’aiguille vertébrale dans le sac vitellin à l’aide d’un micromanipulateur sous la direction d’un microscope chirurgical à zoom stéréo à travers le trou droit. Une fois que le crochet de l’aiguille vertébrale est dans le sac vitellin, ajustez progressivement le crochet sous le RVA afin que son bord soit exactement placé sous le trou gauche. Il est maintenant temps de soulever l’aiguille de la colonne vertébrale.
  9. Maintenant, avec l’aide du micromanipulateur, soulevez progressivement l’artère jusqu’à ce que le flux sanguin Doppler indique une diminution minimale de 80% du flux artériel.
  10. Une fois qu’une baisse de 80% ou plus du flux Doppler est obtenue, laissez l’aiguille vertébrale soulevée (en tirant l’artère vers le haut) pendant 5 minutes. Ce sera la période d’ischémie dans la RVA.
    REMARQUE: Il est essentiel de surveiller le flux Doppler pendant la durée de l’ischémie. Si une quantité importante de fluctuation est trouvée, mettez fin aux tests.
  11. Après la période d’ischémie de 5 minutes, relâchez progressivement l’artère pour rétablir un flux sanguin normal. Assurez-vous qu’une lecture de débitmètre sanguin Doppler affiche des valeurs comparables à celles obtenues lors de la normoxie. Ce sera la période de reperfusion dans le RVA (Figure 4).
  12. Après la procédure I/R, appliquez quelques gouttes (2-3) de 1x PBS sur l’embryon et surveillez-le pendant 2-3 min.
    REMARQUE: L’utilisation de 1x PBS aide à empêcher l’embryon de se dessécher.
  13. Enfin, refermez la fenêtre avec du ruban adhésif et replacez l’œuf dans l’incubateur à œufs pendant 5 h et 55 min.
  14. Après 5 h et 55 min, sortez l’œuf de l’incubateur à œufs, placez-le sur la grille à œufs, rouvrez la fenêtre et suivez le protocole de traitement en aval.

5. Traitements

  1. Pour le traitement des artères avec des médicaments, des activateurs ou des inhibiteurs, excisez le RVA après 1 h du processus I /R.
  2. Pour les études en aval, retirez d’abord l’embryon de la coquille de l’œuf en le plaçant sur une boîte de Petri stérile de 90 mm.
  3. Une fois l’embryon libéré dans la boîte de Pétri, excisez le RVA à l’aide de l’iris oculaire sous la direction d’un microscope chirurgical à zoom stéréo.
  4. Assurez-vous que la dimension d’excision de l’ARV peut atteindre 15 ± 1 mm (distale du tronc), 5 ± 1 mm chacune sur les côtés gauche et droit de l’artère et 2 ± 1 mm vers le tronc.
    REMARQUE: Une règle peut être utilisée pour mesurer la surface à exciser (facultatif).
  5. Après avoir excisé le RVA, lavez-le avec 1x PBS dans une boîte de Petri stérile contenant 1x PBS.
  6. Pour les traitements souhaités, placer l’artère dans un tube centrifuge de 1,5 mL (stérilisé) rempli de 500 μL de solution de Ringer. Placez le RVA dans le tube de la centrifugeuse et placez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 5 h et 55 min.
    REMARQUE: Selon les traitements, utilisez soit la solution de Ringer sans aucun traitement, soit le traitement avec le volume et la concentration souhaités de médicament, d’activateur ou d’inhibiteur.
  7. Après 5 h et 55 min d’incubation, retirez le RVA de l’incubateur de laboratoire à 37 °C et procédez aux traitements souhaités.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique d’imagerie du flux sanguin Doppler a été utilisée pour évaluer l’efficacité de notre modèle. En bref, nous avons comparé les données du groupe témoin avec les données du groupe RVA pour déterminer le succès de notre création. La figure 4A illustre un flux typique associé à l’animal témoin, tandis que la figure 4B illustre les résultats obtenus à partir d’un ARV. Le numérique 1-8 représente les différents événements associés aux phases I/R. En bref, ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de la recherche sur l’ischémie-reperfusion est de créer des stratégies thérapeutiques qui préviennent la mort cellulaire et favorisent la récupération29,30. Pour surmonter les contraintes actuelles dans la recherche I/R, nous avons conçu un modèle d’embryon de poussin Hook I/R pour produire un modèle I/R fiable et reproductible. À notre connaissance, le nôtre est le premier modèle I/R jamais créé dans un embryon de poussin de 3 jours pour des expérienc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à exprimer notre gratitude à Hari Shankar pour ses contributions critiques lors de la vidéographie et du montage, à M. Baqer Hussain pour la voix off, à M. Asghar Rizvi pour le montage vidéo, à M. Mohammad Haider pour les tournages vidéo, à M. Mohammad Danish Siddiqui pour l’assistance pendant les expériences.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(-80° ; C) congélateurHaier,
Tube à centrifugerTARSONS, Inde500010X
100mm Boîte de Pétri (stérile)Tarsons, Inde460050
18G Aiguille (18G & fois ; 1,5 (1,25&fois ; 38mm)Ramsons, Inde13990
1mL SeringueDISPO VAN-26G
Aiguille (26G&fois ; 1/2 (10.45x13mm)DISPO VAN, inde30722D
37° ; C incubateur d’œufs avec pourcentage d’humidité réglableGentek, IndeGL-100
37° ; C INCUBATEUR DE LABORATOIRESCIENCE TECH, IndeCB 101-14
3-Méthyladénine (3-MA)Sigma Aldrich, USAM9281
3mL Pipette de pâturageTARSONS, Inde940050
50mL BécherTARSONS,Inde-5mL
SeringueDISPO VAN, IndeIP53
70 % éthanolMerck Millipore, États-Unis64-17-5
Ruban adhésif/Ruban adhésifSunrise,Inde-Ambra1
amorcesApplied Biosystems, Foster city, États-UnisHs00387943_m1
IgG anti-souris, États-Unis7076S
IgG anti-lapinJackson Immuno Research Laboratories, États-Unis711-035-152
Atg7R& D Systems, États-UnisMAB6608
Amorces Atg7Applied Biosystems, Foster City, États-UnisHs00893766_m1
Autoclave BagTarsons, Inde550022
Autoclave Machinefabriquée localement, Lucknow,Inde-Beclin-1
Proteintech,États-Unis 66665-1-Ig
BetaActin ImmunoTag, États-UnisITT07018
Albumine sérique bovineHimedia, Mumbai, IndeTC194
Chlorure de calciumHimedia, Mumbai, IndeGRM534
CatalaseImmunoTag, États-UnisITT5155
Lingettes nettoyantesKimberly-Clark, Inde370080
Caspase3 clivéeImmunoTag, États-UnisITT07022
di-Sodium hydrogénophosphate heptahydratéHimedia, Mumbai, IndeGRM39611
Débitmètre sanguin DopplerInstrument Moors, Royaume-UnimoorVMS-LDF1
Egg rack--
GAPDHImmunoTag, USAM1000110
GAPDH primersApplied Biosystems, Foster city, États-Unis
GlycineHimedia, Mumbai, IndeMB013
Plateau rénalHOSPITO-LC3A
/BCell Signaling Technology, USA4108S
MethanolRankem laboratories, Mumbai, IndeM0252
MicromanipulateurNarishige, JaponM-152
N-acétyl-L-cystéine (NAC)Sigma Aldrich, États-UnisA7250
NaringeninSigma Aldrich,États-Unis 67604-48-2
NF-k&beta ;Thermo Fisher Scientific, États-Unis51-0500
NLRP3ImmunoTag, États-UnisITT07438
Pince à nezFabrication locale, Lucknow, Inde-Pince
oculaireStoelting, Allemagne52106-40
Iris oculaireTufft Surgical Instruments, Jaipur, IndeHard Age Vannas Micro Ciseaux Inclinés 8CM / 3 1/8"
OHP marqueurCamlin,
ImmunoTag, USAITT08329
Ciseaux pointus à bord tranchantStoelting, Allemagne52132-11
Chlorure de potassiumHimedia, Mumbai, IndeMB043
Phosphate de potassium monobasique anhydreHimedia, Mumbai, IndeMB050
Inhibiteur de protéaseAbcam, États-UnisAb65621
SOD-1ImmunoTag, États-UnisITT4364
Chlorure de sodiumFisher Scientific, Mumbai, Inde27605
Dodécylsulfate de sodiumHimedia, Mumbai, IndeGRM886
Aiguille spinale 25GA ; 3.50 IN (90.51 X 90mm)Ramson, IndeGS-2029
Microscope chirurgical Stereo ZoomOlympus, JaponSZ2-STU3
Jeteur de seringuesBIOHAZARD882210
Pince dentéeStoelting, Allemagne52102-30
Tris BaseG Biosciences, États-UnisRC1217
Tris Hydrochloric AcidHimedia, Mumbai, IndeMB030
Tween 20G Biosciences, États-UnisRC1227
Œufs 0-jour de poule White Leghorn--
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMKMP Biomedicals, LLC, États-UnisFK009
Chine-1.5mL Technologie de signalisation cellulaireEgg rack--Hs02758991_g1 India-ORP-150

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