Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.
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Article de méthode
Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont un excellent outil pour étudier le développement pancréatique précoce et étudier les facteurs génétiques contribuant au diabète. Des cellules sécrétrices d’insuline dérivées de l’hPSC peuvent être générées pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie, cependant, avec une efficacité et des propriétés fonctionnelles limitées. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC qui sont des précurseurs des cellules bêta et d’autres cellules endocrines, lorsqu’ils expriment conjointement les deux facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1, spécifient les progéniteurs des cellules bêta fonctionnelles sécrétant de l’insuline in vitro et in vivo. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC sont actuellement utilisés pour la thérapie cellulaire chez les patients atteints de diabète de type 1 dans le cadre d’essais cliniques. Cependant, les procédures actuelles ne génèrent pas une proportion élevée de NKX6.1 et de progéniteurs pancréatiques, ce qui conduit à la cogénération de cellules endocrines non fonctionnelles et à peu de cellules sensibles au glucose et sécrétant de l’insuline. Ce travail a donc développé un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC qui maximisent la co-expression de PDX1 et NKX6.1 dans une monocouche 2D. Les facteurs tels que la densité cellulaire, la disponibilité de la matrice fraîche et la dissociation des cellules endodermiques dérivées de hPSC sont modulés pour augmenter les niveaux de PDX1 et NKX6.1 dans les progéniteurs pancréatiques générés et minimiser l’engagement à alterner la lignée hépatique. L’étude souligne que la manipulation de l’environnement physique de la cellule lors de la différenciation in vitro peut avoir un impact sur la spécification de la lignée et l’expression des gènes. Par conséquent, le protocole optimisé actuel facilite la génération évolutive de progéniteurs co-exprimant PDX1 et NKX6.1 pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie.
Introduction
Le diabète est un trouble métabolique complexe qui touche des millions de personnes dans le monde. La supplémentation en insuline est considérée comme la seule option de traitement du diabète. Les cas plus avancés sont traités par thérapie de remplacement des cellules bêta, obtenue par transplantation du pancréas cadavérique entier ou des îlots 1,2. Plusieurs problèmes entourent la thérapie de transplantation, tels que la limitation de la disponibilité et de la qualité des tissus, le caractère invasif des procédures de transplantation en plus du besoin continu d’immunosuppresseurs. Cela nécessite la découverte....
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Protocole
L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) de HMC (n° 16260/16) et l’Institut de recherche biomédicale du Qatar (QBRI) (n° 2016-003). Ce travail est optimisé pour les CSEh tels que H1, H9 et HUES8. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé de l’hôpital Hamad Medical Corporation (HMC) avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellule....
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Résultats
Les résultats montrent que le protocole optimisé P2-D (figures 1A) a amélioré l’efficacité de différenciation des progéniteurs pancréatiques en régulant à la hausse la co-expression PDX1 et NKX6.1 (Figure 2A, B et Figure 3A). En particulier, les résultats ont montré que la dissociation des cellules endodermiques et leur replacage sur la matrice membranaire fraîche ainsi qu’une durée plus longue de stade 3 augmentaie.......
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Discussion
Ce travail décrit un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh avec une co-expression élevée de PDX1 et NKX6.1. La dissociation et le replatage de l’endoderme dérivé de hPSC à demi-densité sur une matrice fraîche ont entraîné une augmentation de PDX1 et NKX6,1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC.
Bien que le cocktail de facteurs de croissance pour chaque stade soit très similaire à P1-ND 27, il a été démontré qu’un traitement de stade 3 plu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (Subvention No. NPRP10-1221-160041).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 15 mL, coniques, tubes à centrifuger | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| Plaques de culture à 24 puits, fond plat avec couvercle | Costar | 3524 | |
| 50 mL, coniques, tubes à centrifuger | Thermo Scientific | 339652 | |
| plaques de culture à 6 puits, multi-plats | Thermo Scientific | ||
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activine A | R& D | 338-AC | Reconstitué dans 4 mM HCl |
| Anticorps anti-NKX6.1, souris monoclonale | DSHB | F55A12-C | Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et 1:2000 pour l’immunocoloration |
| Anticorps anti-PDX1, cobaye polyclonal | Abcam | ab47308 | Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:1000 pour l’immunocoloration |
| B27 moins Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Albumine sérique bovine, fraction de choc thermique, sans acides gras | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstitué en DMSO |
| DMEM, haute teneur en glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstitué en 0,1 % BSA dans PBS |
| FGF10 | R& D | 345-FG | Reconstitué en PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Microscope inversé | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR remplacement du sérum | Gibco | 10828-028 | |
| Acide L-ascorbique (vitamine C) | Sigma | A92902 | Reconstitué dans de l’eau distillée |
| Matrigel à facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basale | Corning | 354230 | Aliquote le stock décongelé et congélation à -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Souris anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:2000 pour l’immunocoloration |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mélanger le milieu basal avec un supplément. Aliquote et stockage à -20 ° ; C pour une durée plus longue ou à 4 ° ; C pour utilisation instantanée |
| Unités de filtration Nalgene, 0,2 & micro ; m PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstitué dans de l’eau distillée |
| NOGGIN | R& D | 6057-NG | Reconstitué dans 0,1 % BSA dans |
| solution de paraformaldéhyde PBS 4 % dans PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Aspirateur | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Technologie de signalisation cellulaire | 3143 | Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:500 pour la cytométrie en flux |
| immunocoloration Acide rétinoïque | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstitué dans le DMSO |
| Inhibiteur de roche (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstitué dans |
| tubes FACS en polystyrène à fond rond DMSO avec bouchons, STÉRILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstitué dans du DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mélangez le milieu de base avec un supplément. Aliquote et stockage à -20 ° ; C pour une durée plus longue ou à 4 ° ; C pour une utilisation instantanée |
| TALI Lame d’analyse cellulaire | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cytomètre basé sur l’image Compteur automatisé de cellules | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575-038 |
Références
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J.
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Réimpressions et autorisations
