Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

Summary

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont un excellent outil pour étudier le développement pancréatique précoce et étudier les facteurs génétiques contribuant au diabète. Des cellules sécrétrices d’insuline dérivées de l’hPSC peuvent être générées pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie, cependant, avec une efficacité et des propriétés fonctionnelles limitées. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC qui sont des précurseurs des cellules bêta et d’autres cellules endocrines, lorsqu’ils expriment conjointement les deux facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1, spécifient les progéniteurs des cellules bêta fonctionnelles sécrétant de l’insuline in vitro et in vivo. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC sont actuellement utilisés pour la thérapie cellulaire chez les patients atteints de diabète de type 1 dans le cadre d’essais cliniques. Cependant, les procédures actuelles ne génèrent pas une proportion élevée de NKX6.1 et de progéniteurs pancréatiques, ce qui conduit à la cogénération de cellules endocrines non fonctionnelles et à peu de cellules sensibles au glucose et sécrétant de l’insuline. Ce travail a donc développé un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC qui maximisent la co-expression de PDX1 et NKX6.1 dans une monocouche 2D. Les facteurs tels que la densité cellulaire, la disponibilité de la matrice fraîche et la dissociation des cellules endodermiques dérivées de hPSC sont modulés pour augmenter les niveaux de PDX1 et NKX6.1 dans les progéniteurs pancréatiques générés et minimiser l’engagement à alterner la lignée hépatique. L’étude souligne que la manipulation de l’environnement physique de la cellule lors de la différenciation in vitro peut avoir un impact sur la spécification de la lignée et l’expression des gènes. Par conséquent, le protocole optimisé actuel facilite la génération évolutive de progéniteurs co-exprimant PDX1 et NKX6.1 pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie.

Introduction

Le diabète est un trouble métabolique complexe qui touche des millions de personnes dans le monde. La supplémentation en insuline est considérée comme la seule option de traitement du diabète. Les cas plus avancés sont traités par thérapie de remplacement des cellules bêta, obtenue par transplantation du pancréas cadavérique entier ou des îlots ^1,2. Plusieurs problèmes entourent la thérapie de transplantation, tels que la limitation de la disponibilité et de la qualité des tissus, le caractère invasif des procédures de transplantation en plus du besoin continu d’immunosuppresseurs. Cela nécessite la découverte....

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) de HMC (n° 16260/16) et l’Institut de recherche biomédicale du Qatar (QBRI) (n° 2016-003). Ce travail est optimisé pour les CSEh tels que H1, H9 et HUES8. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé de l’hôpital Hamad Medical Corporation (HMC) avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellule....

Results

Les résultats montrent que le protocole optimisé P2-D (figures 1A) a amélioré l’efficacité de différenciation des progéniteurs pancréatiques en régulant à la hausse la co-expression PDX1 et NKX6.1 (Figure 2A, B et Figure 3A). En particulier, les résultats ont montré que la dissociation des cellules endodermiques et leur replacage sur la matrice membranaire fraîche ainsi qu’une durée plus longue de stade 3 augmentaie.......

Discussion

Ce travail décrit un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh avec une co-expression élevée de PDX1 et NKX6.1. La dissociation et le replatage de l’endoderme dérivé de hPSC à demi-densité sur une matrice fraîche ont entraîné une augmentation de PDX1 et NKX6,1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC.

Bien que le cocktail de facteurs de croissance pour chaque stade soit très similaire à P1-ND 27, il a été démontré qu’un traitement de stade 3 plu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL, coniques, tubes à centrifuger	Thermo Scientific	339651
20X TBS Tween 20	Thermo Scientific	28360
Plaques de culture à 24 puits, fond plat avec couvercle	Costar	3524
50 mL, coniques, tubes à centrifuger	Thermo Scientific	339652
plaques de culture à 6 puits, multi-plats	Thermo Scientific
Accutase	Stem Cell Technologies	0-7920
Activine A	R& D	338-AC	Reconstitué dans 4 mM HCl
Anticorps anti-NKX6.1, souris monoclonale	DSHB	F55A12-C	Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et 1:2000 pour l’immunocoloration
Anticorps anti-PDX1, cobaye polyclonal	Abcam	ab47308	Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:1000 pour l’immunocoloration
B27 moins Vit A	ThermoFisher	12587010
Albumine sérique bovine, fraction de choc thermique, sans acides gras	Sigma	A7030
CHIR 99021	Tocris	4423	Reconstitué en DMSO
DMEM, haute teneur en glucose	ThermoFisher	41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 488		A-21206
DPBS 1X	ThermoFisher	14190144
EGF	ThermoFisher	PHG0313	Reconstitué en 0,1 % BSA dans PBS
FGF10	R& D	345-FG	Reconstitué en PBS
Glucose	Sigma Aldrich	G8644
Hoechst 33258	Sigma	23491-45-4
Microscope inversé	Olympus	IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)	Gibco	12660-012
KnockOut SR remplacement du sérum	Gibco	10828-028
Acide L-ascorbique (vitamine C)	Sigma	A92902	Reconstitué dans de l’eau distillée
Matrigel à facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basale	Corning	354230	Aliquote le stock décongelé et congélation à -20C.
MCDB131	ThermoFisher	10372019
Souris anti-SOX17	ORIGENE	CF500096	Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:2000 pour l’immunocoloration
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	85850	Mélanger le milieu basal avec un supplément. Aliquote et stockage à -20 ° ; C pour une durée plus longue ou à 4 ° ; C pour utilisation instantanée
Unités de filtration Nalgene, 0,2 & micro ; m PES	ThermoFisher	566-0020
Nicotinamide	Sigma	72340	Reconstitué dans de l’eau distillée
NOGGIN	R& D	6057-NG	Reconstitué dans 0,1 % BSA dans
solution de paraformaldéhyde PBS 4 % dans PBS	ChemCruz	sc-281692
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	ThermoFisher	15140122
Aspirateur
Rabbit anti-FOXA2	Technologie de signalisation cellulaire	3143	Dilué à 1:100 pour la cytométrie en flux et à 1:500 pour la cytométrie en flux
immunocoloration Acide rétinoïque	Sigma Aldrich	R2625	Reconstitué dans le DMSO
Inhibiteur de roche (Y-27632)	ReproCell	04-0012-02	Reconstitué dans
tubes FACS en polystyrène à fond rond DMSO avec bouchons, STÉRILE	Stellar Scientific	FSC-9010
SANT-1	Sigma Aldrich	S4572	Reconstitué dans du DMSO
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
StemFlex	ThermoFisher	A3349401	Mélangez le milieu de base avec un supplément. Aliquote et stockage à -20 ° ; C pour une durée plus longue ou à 4 ° ; C pour une utilisation instantanée
TALI Lame d’analyse cellulaire	Invitrogen	T10794
Tali Cytomètre basé sur l’image Compteur automatisé de cellules	Invitrogen	T10796
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
TrypLE 100 mL	ThermoFisher	12563011
Tween 20	Sigma	P2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-038