Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes

Résumé

Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.

Résumé

Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales ^1,2. Ces obstac....

Protocole

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du HMC (n° 16260/16) et de l’ICRQ (n° 2016-003). Ce travail est également optimisé pour les CSEh tels que H1 et H9. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d’individus en bonne santé.

Résultats

Schéma et morphologie des cellules au cours de la différenciation mésenchymateuse : La différenciation des CSPi en CSM implique différents stades de développement allant de la formation de l’EB, de la différenciation des CSM et de l’expansion des CSM (Figure 1). Au cours de ces stades de développement, les cellules acquièrent une morphologie variée en raison des différents produits chimiques stimulants auxquels elles sont soumises. Lors du début de la différenciation, les cellules sont plaqu.......

Discussion

Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA^14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois^14,15, ce protocole étant applicable à la fois aux CSPi .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adiponectine	Abcam	ab22554	Marqueur de maturation adipocytaire
anti-CD105	BD Pharmingen	560839	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD14	BD Pharmingen	561712	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD19	BD Pharmingen	555415	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD34	BD Pharmingen	555824	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD44	abcam	ab93758	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD45	BD Pharmingen	560975	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD73	BD Pharmingen	550256	Marqueur de différenciation MSC
anti-CD90	BD Pharmingen	555596	Marqueur de différenciation MSC
bFGF	R& D	233-FP	Supplément de milieux de culture MSC
C/EBPA	Abcam	ab40761	Marqueur de maturation adipocytaire
Dexaméthasone	Torics	1126	Supplément de milieux de différenciation adipocytaire
FABP4	Abcam	ab93945	Marqueur de maturation adipocytaire
Sérum de veau fœtal	ThermoFisher	10082147	Supplément de milieux de culture MSC
Glutamax	ThermoFisher	35050-061	MSC Complément de milieux de culture
IBMX	Sigma Aldrich	I5879	Complément de milieux de différenciation adipocytaires
Indométhacine	Sigma Aldrich I7378		Supplément de milieux de différenciation adipocytaires
Insuline	Sigma Aldrich	91077C	Supplément de milieux de différenciation des adipocytes
Knockout DMEM	ThermoFisher	12660012	Milieux de base pour la préparation de matrigel
DMEM à faible teneur en glucose	ThermoFisher	11885084	MSC Milieux de culture
Matrigel	Corning	354230	Matrice d’enrobage
MEM-alpha	ThermoFisher	12561056	Milieux de différenciation des adipocytes
Nilered	Sigma Aldrich	19123	Marqueur de tri pour adipocytes
Pénicilline	ThermoFisher	15140122	MSC/Adipocyte Supplément
de milieu Saline tamponnée au phosphate	ThermoFisher	14190144	Tampon
Pierce&trade ; 20X TBS Tampon Thermo	Fisher	28358	Tampon
de signalisation cellulaire	PPARG	2443	Marqueur de maturation adipocytaire
ReLeSR	Cellule souche Technologies	5872	Réactif de dissociation
Acide rétinoïque	Sigma Aldrich	R2625	Complément de milieu de différenciation MSC
Inhibiteur	de roche Tocris	1254/10	Complément de milieu de culture
Roziglitazone	Sigma Aldrich	R2408	Complément de milieu de différenciation des adipocytes
StemFlex	ThermoFisher	A334901	hPSC milieux de culture
Triton	Thermo Fisher	28314	Réactif de permébéalisation
Trypsin	ThermoFisher	25200072	Réactif de dissociation
Tween 20	Sigma Aldrich	P7942	Tampon de lavage

Tampon de lavage