Article de méthode

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

DOI :

10.3791/63312

⸱

9 décembre 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les interactions leucocytaires-endothéliales jouent un rôle important dans les maladies inflammatoires telles que la septicémie. Au cours de l’inflammation, une migration excessive des leucocytes activés à travers l’endothélium vasculaire vers des organes clés peut entraîner une défaillance d’organe. Un test microfluidique biomimétique physiologiquement pertinent (bMFA) a été développé et validé à l’aide de plusieurs techniques expérimentales et informatiques, qui peuvent reproduire l’ensemble de la cascade de roulement/ adhésion/migration des leucocytes pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales. Les réseaux microvasculaires obtenus à partir d’images in vivo chez des rongeurs ont été numérisés à l’aide d’une approche de système d’information géographique (SIG) et microfabriqués avec du polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une lame de microscope. Pour étudier l’effet de la vitesse de cisaillement et de la topologie vasculaire sur les interactions entre les cellules leucocytes et endothéliales, un modèle de dynamique des fluides computationnelle (CFD) a été développé pour générer une carte correspondante des taux de cisaillement et des vitesses dans l’ensemble du réseau. Le bMFA permet de quantifier les interactions leucocytaires-cellules endothéliales, y compris la vitesse de roulement, le nombre de leucocytes adhérents en réponse à différents taux de cisaillement, le nombre de leucocytes migrés, la perméabilité des cellules endothéliales, l’expression des molécules d’adhésion et d’autres variables importantes. De plus, en utilisant des échantillons liés à l’homme, tels que des cellules endothéliales humaines et des leucocytes, l’AGB fournit un outil de dépistage rapide des traitements potentiels afin d’augmenter leur translatabilité clinique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’inflammation est la réponse de l’hôte à l’infection et à la blessure, et l’endothélium joue un rôle important dans la réponse inflammatoire 1,2,3. Le dérèglement inflammatoire est la cause sous-jacente d’un certain nombre de pathologies telles que la septicémie, les maladies cardiovasculaires, l’asthme, les maladies inflammatoires de l’intestin, le cancer et la COVID-19. Les interactions leucocytaires-endothéliales jouent un rôle central dans ces maladies inflammatoires. Au cours de l’inflammation, la libération de PAMPS (modèles moléculaires associés à des agents pathogènes) à partir d’agents pathogènes ou de DAMPS (modèles moléculaires associés à des dommages) à partir de tissus lésés active les cellules immunitaires pour libérer des cytokines / chimiokines et d’autres médiateurs pro-inflammatoires qui conduisent à l’activation de l’endothélium, entraînant des altérations de la fonction de barrière de l’endothélium vasculaire et une perméabilité accrue 3,4 . L’activation accrue des cellules endothéliales pendant l’inflammation entraîne une amélioration de l’interaction leucocytaire-cellule endothéliale conduisant à une migration excessive des leucocytes activés à travers l’endothélium vasculaire vers les organes clés 1,5,6,7.

Le recrutement des leucocytes est initié par des chimioattractifs chimiquement divers composés de lipides bioactifs, de cytokines, de chimiokines et de composantscomplémentaires 8,9. Le recrutement des leucocytes est un processus en plusieurs étapes qui comprend cinq étapes distinctes : 1) la marge et la capture/fixation des leucocytes, 2) le roulement, 3) l’arrêt ferme, 4) l’étalement et le rampement et 5) l’extravasation/migration (Figure 1). Chaque étape de ce processus nécessite une diaphonie entre les leucocytes et les cellules endothéliales pour orchestrer ce phénomène dynamique 1,9. En fin de compte, les leucocytes arrêtés extravasent les tissus enflammés à travers l’endothélium via un processus en plusieurs étapes contrôlé par des signaux simultanés dépendants de la chimioattraction, des événements adhésifs et des forces de cisaillement hémodynamiques 1,9,10,11,12.

Compte tenu du rôle central du stress de cisaillement dans la régulation de la fonction des cellules endothéliales et de l’importance des interactions cellules leucocyte-endothélium13, plusieurs modèles in vitro ont été développés au cours des dernières décennies pour étudier divers aspects de la cascade de migration des leucocytes dans un environnement plus contrôlé14. Les dispositifs fluidiques traditionnels pour étudier les interactions leucocytaires-cellules endothéliales peuvent être classés en deux grandes catégories14: a) les dispositifs pour étudier le roulement leucocytaire, l’adhésion et l’expression des molécules d’adhésion tels que les chambres d’écoulement de plaques parallèles et b) les dispositifs pour étudier la migration des leucocytes dans des conditions statiques telles que les chambres transwell. Des systèmes tels que les chambres d’écoulement à plaques parallèles ont été utilisés pour étudier le rôle des molécules d’adhésion et de leurs ligands dans la cascade d’adhésion sous les forces de cisaillement15. Cependant, un inconvénient important est que ces dispositifs simplistes et idéalisés (p. ex., canal droit) ne sont pas en mesure de reproduire l’échelle et la géométrie de la microvascularisation in vivo (p. ex., bifurcations vasculaires successives, morphologie vasculaire) et les conditions d’écoulement qui en résultent (p. ex., écoulements convergents ou divergents aux bifurcations). En conséquence, ces dispositifs ne peuvent modéliser que l’adhérence mais pas la transmigration. Les chambres Transwell ne peuvent étudier la transmigration que dans des conditions statiques sans tenir compte des caractéristiques géométriques in vivo et des conditions d’écoulement. Ainsi, ces modèles traditionnels n’imitent pas le microenvironnement des tissus vivants et ne résolvent pas l’adhérence et la cascade de migration en un seul essai6.

Pour remédier à cette limitation, nous avons développé et validé de manière approfondie un nouveau test microfluidique biomimétique 3D (bMFA) (Figure 2), qui reproduit de manière réaliste des réseaux microvasculaires in vivo sur une puce 16,17,18. Le protocole de microfabrication de cet appareil a été publié précédemment17 et n’est que brièvement décrit ici. La microvascularisation du muscle cremaster de souris a été numérisée à l’aide d’une approche modifiée du système d’information géographique (SIG)19. Ensuite, le réseau microvasculaire synthétique a été généré sur le polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide de procédés de lithographie douce basés sur le réseau microvasculaire numérisé 14,17,20,21,22. En bref, les images de réseau numérisées ont été imprimées sur un film Mylar, qui a ensuite été utilisé comme masque pour modeler une résine photosensible positive SU-8 sur une plaquette de silicium afin de créer les maîtres pour la fabrication. Des piliers microfabriqués (10 μm de diamètre, 3 μm de haut) ont été utilisés pour créer les pores de 3 μm de haut et 100 μm de large, une taille optimale pour la migration des leucocytes 23,24,25, reliant les canaux vasculaires et les compartiments tissulaires. Le PDMS a été préparé conformément aux instructions du fabricant et versé sur les maîtres développés. De plus, le PDMS a été dégazé et autorisé à durcir pendant la nuit dans un four (65 °C) pour créer des microcanaux complémentaires dans le PDMS. Par la suite, le PDMS durci a été décollé du maître SU-8, suivi d’orifices de poinçonnage pour les entrées / sorties. Ensuite, le PMDS a été lié au plasma à une lame de verre. La surface du dispositif microfluidique comprend du verre natif et du PDMS. Afin de favoriser la fixation, la propagation et la prolifération des cellules, un revêtement à matrice extracellulaire (ECM) est nécessaire. L’AMBB comprend un réseau microvasculaire et un compartiment tissulaire relié par des pores de 3 μm de haut et 100 μm de large (figure 2). Ce système microfluidique reproduit l’ensemble de la cascade d’adhésion/migration des leucocytes dans un environnement 3D physiologiquement pertinent d’un réseau microvasculaire complet avec des vaisseaux et des bifurcations interconnectés, y compris la circulation, la marge, le roulement, l’adhésion et la migration des leucocytes dans le compartiment tissulaire extra-vasculaire dans un seul système 14,16,17,21,26.

Il convient de noter que même lorsque le débit à l’entrée de bMFA est fixe, les conditions d’écoulement dans le réseau varient à différents endroits et ne peuvent pas être calculées par une formule mathématique simple. Un modèle numérique basé sur la dynamique des fluides (CFD) a été développé pour calculer différents paramètres d’écoulement (par exemple, la contrainte de cisaillement, le taux de cisaillement, la vitesse) à différents endroits du réseau. Ce modèle CFD a été utilisé pour simuler les modèles de perfusion de colorant et les paramètres d’écoulement dans le bMFA. La validation croisée avec les résultats expérimentaux suggère que les résistances d’écoulement à travers le réseau sont bien prédites par le modèle de calcul (Figure 3)17. Ce modèle CFD a ensuite été utilisé pour estimer la vitesse et le profil de vitesse de cisaillement dans chaque récipient de bMFA (Figure 4), permettant d’analyser les effets de l’écoulement et de la géométrie du cisaillement sur le laminage, l’adhérence et la migration des leucocytes16. Les leucocytes adhèrent préférentiellement près des bifurcations et dans les régions à faible cisaillement in vivo, et ces modèles spatiaux d’adhésion des leucocytes ont été démontrés avec succès dans l’AGB à l’aide de neutrophiles (Figure 5)16. Cet article décrit le protocole de préparation de l’AMFb pour étudier l’interaction entre les cellules leucocytaires et endothéliales dans des conditions inflammatoires à l’aide de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) et de neutrophiles humains. Les systèmes microphysiologiques, tels que le bMFA, peuvent être utilisés pour étudier les interactions des cellules endothéliales avec différents types de cellules telles que les neutrophiles, les monocytes, les lymphocytes et les cellules tumorales 18,27,28,29,30. L’AGB peut être ensemencée avec des cellules endothéliales primaires de différents organes (p. ex., poumon vs cerveau) et différentes espèces (p. ex., cellules endothéliales humaines vs murines), ainsi que des lignées cellulaires endothéliales 21,27,31,32. Le bMFA peut être utilisé pour étudier les réponses cellulaires multiples, les interactions cellule-cellule, la fonction barrière, l’administration de médicaments et la toxicité des médicaments.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sang humain héparinisé est obtenu pour l’isolement des neutrophiles auprès de donneurs adultes en bonne santé (hommes et femmes, âgés de 21 à 60 ans), après consentement éclairé approuvé par l’Institutional Review Board de Temple University (Philadelphie, PA, États-Unis).

1. Amorçage et revêtement de l’appareil avec de la fibronectine humaine

REMARQUE: Le bMFA dispose de deux ports d’entrée et de deux ports de sortie connectés au compartiment vasculaire. Il dispose également d’un port relié au compartiment tissulaire (Figure 2).

  1. Insérer un tube (O.D. de 0,06 » et I.D. de 0,02 ») (Table des matériauxs) dans tous les ports, à l’exception d’un orifice d’entrée avec pince à pointe fine. Serrez les deux orifices de sortie et l’orifice du compartiment à tissus avec des pinces à mâchoires. Assurez-vous que chaque tube mesure environ 1 pouce de longueur.
  2. Diluer la fibronectine humaine à 100 μg/mL avec du PBS à partir d’une solution mère de fibronectine (1 mg/mL). Charger une seringue de 1 mL avec une solution de fibronectine préparée. Connectez la seringue à une aiguille émoussée de 24 G et à un tube d’environ 4 pouces de long.
    REMARQUE: Pour éviter la réticulation, ne pas trop mélanger / pipeter la fibronectine humaine. D’autres matrices extracellulaires (ECM) telles que le collagène peuvent être utilisées pour différents types de cellules.
  3. Insérez le tube dans l’orifice d’entrée ouvert, poussez le piston jusqu’à ce que la fibronectine humaine sorte de l’autre orifice d’entrée, puis serrez-le. Répétez ce processus pour le reste des orifices jusqu’à ce que tous les canaux, le compartiment tissulaire et le tube soient remplis de la solution de fibronectine humaine. Retirez l’aiguille, mais gardez le tube de 4 pouces de long inséré et non serré.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tube est rempli de fibronectine avant d’être serré.
  4. Pour le dégazage, connectez le tube non calé à un réservoir d’azote comprimé à travers l’apprêt pneumatique, ajustez la pression à ~ 5 psi et courez pendant environ 15 min.
  5. Après 15 minutes, vérifiez au microscope pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans l’appareil. S’il y a des bulles d’air piégées dans le canal ou le compartiment tissulaire, reconnectez l’appareil à l’apprêt pneumatique pour le dégazage à nouveau, c’est-à-dire répétez l’étape 1.4.
    REMARQUE: Le microscope inversé est utilisé dans toutes les étapes impliquant la microscopie dans ce protocole.
  6. Retirez l’appareil de l’apprêt pneumatique. Incuber le dispositif à 37 °C pendant 1 h, puis rincer tous les canaux et le compartiment tissulaire avec un milieu de culture HLMVEC préchauffé (table des matériaux), similaire à l’étape 1.3. Le bMFA est maintenant prêt pour l’ensemencement cellulaire.
    REMARQUE: Avant de retirer / insérer un tube du port, placez d’abord une goutte d’eau avec une pipette autour de la base du tube de l’orifice d’entrée pour empêcher l’air de pénétrer dans l’appareil.

2. Ensemencement de bMFA avec HLMVEC

  1. Culture HLMVEC à 60% - 80% de confluence selon le protocole du fournisseur dans une fiole T-25.
  2. Aspirer les milieux de culture HLMVEC à partir d’une fiole de culture cellulaire. Laver deux fois avec PBS.
  3. Ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA préchauffée (37 °C) dans la fiole T-25. Incuber pendant 3-5 min dans un incubateur (37 °C, 5% de CO2) jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées de la fiole.
    REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier selon les types de cellules et la concentration de trypsine-EDTA.
  4. Ajouter 2 mL de solution de neutralisation de la trypsine (TNS, 37 °C) dans la fiole pour neutraliser la trypsine-EDTA.
  5. Tapotez doucement la fiole pour aider à dissocier les cellules. Ensuite, transférez la solution de suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
  6. Centrifuger pendant 5 min à 150 x g pour granuler les cellules endothéliales. Prélever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 mL de milieux de culture cellulaire. Comptez le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
  7. Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 150 x g pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension à la densité d’ensemencement souhaitée de 20 x 106/mL.
    REMARQUE: Selon les types de cellules et la confluence, environ 2 x 106 cellules endothéliales peuvent être collectées à partir de deux flacons T-25, et avec la densité d’ensemencement de 20 x 106 / mL, 100 μL de la suspension cellulaire (2 x 106 cellules endothéliales), est suffisant pour ensemencer 5 dispositifs.
  8. Montez une seringue de 1 mL dans la pompe à seringue programmable, fixez le tube à l’aiguille émoussée.
  9. Aspirez environ 20 μL de la suspension cellulaire dans le tube, en vous assurant que la suspension cellulaire est uniquement dans le tube, pas dans le barillet de la seringue.
  10. Retirez la pince d’un port de sortie de l’appareil. Connectez le tube à une entrée de l’appareil. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans le canal.
  11. Démarrez la pompe avec un débit de 4-8 μL/min. Observez l’appareil au microscope.
  12. Lorsque les canaux sont remplis de cellules, arrêtez la pompe, serrez la sortie et coupez le tuyau d’entrée.
    REMARQUE: Veillez à ne pas introduire de bulles d’air dans l’appareil.
  13. Mettez l’appareil dans l’incubateur pendant 4 h à 5% de CO2 et 37 °C.
  14. Après 4 h d’incubation, préparez une autre seringue remplie de milieux de culture cellulaire frais. Montez la seringue sur une pompe à seringue, connectez la seringue à l’orifice d’entrée et retirez la pince d’un orifice de sortie.
  15. Faites passer du média frais à travers l’appareil pendant environ 5 minutes à 4-8 μL / min pour laver les cellules flottantes / non attachées.

3. Culture cellulaire sous écoulement pendant 48 h

  1. Préparez une seringue remplie de milieux de culture cellulaire frais. Montez la seringue dans une pompe à seringue, connectez la seringue à un orifice d’entrée et gardez une sortie ouverte. Mettez l’appareil dans l’incubateur (5% de CO2, 37 °C).
  2. Programmez la pompe à seringue pour la culture des cellules endothéliales sous écoulement en suivant les instructions suivantes mentionnées dans le tableau 1.
  3. Vérifiez l’AMFb au microscope après 48 h de culture sous écoulement. Le HLMVEC doit couvrir les canaux vasculaires formant une lumière complète (Figure 6).
    REMARQUE: D’autres régimes d’écoulement peuvent être nécessaires pour différents types de cellules.

4. Cytokine et/ou traitement thérapeutique

REMARQUE: À titre d’exemple, cette section décrit l’utilisation de l’AMfb pour étudier l’impact du traitement des cellules avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et un nouvel inhibiteur anti-inflammatoire (inhibiteur peptidique delta-TAT de la protéine Kinase C, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

  1. Préparez trois périphériques bMFA différents à l’aide du protocole ci-dessus (section 1-3).
  2. Charger trois seringues de 1 mL avec des milieux de culture cellulaire (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), respectivement.
    REMARQUE: Les cytokines sont reconstituées dans des milieux de culture cellulaire.
  3. Connectez les trois seringues à trois dispositifs bMFA. Traiter le HLMVEC avec un tampon TNF-α ou un inhibiteur du TNF-α + pendant 4 h à 0,1 μL/min.
    REMARQUE : Selon les exigences spécifiques de l’étude, d’autres cytokines ou cocktails de cytokines (p. ex. TNF-α + interleukine 1 bêta (IL1-β) + interféron-gamma (IFN-γ)), peuvent être utilisés pour traiter les cellules endothéliales.

5. Isolement des neutrophiles humains

  1. Utilisez tous les réactifs à température ambiante (RT). Les réactifs comprennent un milieu d’isolement leucocytaire, 1 tampon HEPES avec Ca2+/Mg2+ (tableau 2), 6 % de Dextran dans une solution saline normale (0,9 % de NaCl), une solution de NaCl à 3,6 % et de l’eau désionisée (ID).
  2. Pipeter 20 mL de milieu d’isolement leucocytaire dans un tube conique de 50 mL et superposer soigneusement 25 mL de sang sur le milieu d’isolement des leucocytes. Centrifugeuse pendant 40 min à 427 x g à RT.
    REMARQUE: Effectuez cette étape lentement et soigneusement pour éviter de mélanger le sang et les milieux d’isolement des leucocytes.
  3. Aspirer jusqu’à ~5 mL au-dessus de la couche de globules rouges (GLOBULES ROUGES). La couche blanche de buffy sur le dessus du GLOBULES ROUGES est principalement constituée de neutrophiles.
  4. Ajoutez un tampon HEPES pour doubler le volume actuel (volume existant : tampon HEPES = 1:1).
  5. Ajoutez un montant de 6% de Dextran, ce qui représentera 20% du volume final. (volume actuel/4 = volume de 6% de Dextran ajouté).
  6. Inverser doucement le tube plusieurs fois pour bien mélanger et laisser les sédiments RBC (~25 min).
  7. Pipeter soigneusement la couche supérieure (couche riche en neutrophiles) et transférer dans un nouveau tube de 50 mL, veillez à ne pas contaminer avec des globules rouges sédimentés.
  8. Centrifuger pendant 10 min à 315 x g à RT. Retirer le surnageant et remettre la pastille dans 8 mL de tampon HEPES.
  9. Pour lyser les globules rouges résiduels, ajouter 24 mL d’eau DI et mélanger doucement pendant 50 s. Immédiatement, ajouter 8 mL de solution de NaCl à 3,6 %, mélanger et centrifuger pendant 10 min à 315 x g à RT.
  10. Retirez le surnageant, lavez la pastille de cellule avec 15 mL de tampon HEPES et centrifugez pendant 5 min à 315 x g. Remettez la pastille dans un tampon HEPES.

6. Expérience d’adhésion et de migration des neutrophiles avec bMFA

  1. Remettre en suspension les neutrophiles humains isolés (15 millions) dans 999 μL de tampon HEPES.
  2. Ajouter 1 μL de CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) solution mère de colorant (10 mM) à la suspension de neutrophiles pour obtenir une concentration de travail de 10 μM CFDA-SE et incuber pendant 10 min à RT. Laver les cellules deux fois avec un tampon HEPES par centrifugation pendant 5 min à 315 x g.
  3. Compter les neutrophiles à l’aide d’un hémocytomètre et remettre en suspension à 2 millions de neutrophiles/mL avec des milieux de culture cellulaire, TNF-α (10 ng/mL) et TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), respectivement; incuber pendant 15 min à TA avant le début de l’expérience.
  4. Préparer une seringue remplie de 1 μM de N-formyl-met-leu-phe (fMLP), le chimioattractif de l’étude, dans un milieu de culture cellulaire. Prenez bMFA et ouvrez un port d’entrée et un port de sortie.
    REMARQUE: Ces conditions expérimentales sont utilisées pour imiter les conditions de septicémie qui comprennent une réponse inflammatoire systémique avec des niveaux élevés de cytokines / chimiokines circulantes. De plus, le fMLP, un peptide dérivé de bactéries à Gram négatif, est utilisé pour modéliser la présence de bactéries dans les poumons (c.-à-d. le compartiment tissulaire).
  5. Retirez le tube d’orifice du compartiment en tissu et insérez le tube fMLP. Injecter environ 20 μL de fMLP dans le compartiment tissulaire pour tous les bMFA, à l’exception de celui traité avec un milieu de culture cellulaire seul. Ensuite, coupez le tube et serrez-le.
  6. Remplissez la seringue avec environ 200 μL de suspension de neutrophile et montez la seringue sur la pompe à seringue.
  7. Placez l’appareil sur l’étage du microscope inversé (table des matériaux).
  8. Démarrez la pompe à un débit de 1 μL/min et attendez qu’une petite goutte de la suspension de neutrophiles sorte du tube. Insérez le tuyau dans l’orifice d’entrée. Reportez-vous à la figure 7 pour la configuration.

7. Acquérir des images

  1. Utilisez la fonction Scan Large Image du logiciel d’analyse d’images au microscope (Table des matériaux) pour obtenir la carte d’adhérence en bMFA (Figure 8) 10 min après le début de l’expérience. La plupart des neutrophiles entrent dans l’AMFB au cours des 10 premières minutes.
    REMARQUE: Gardez la lumière de fluorescence éteinte lorsque vous ne prenez pas d’images pour réduire le photoblanchiment.
  2. Au cours de l’heure suivante, prenez des images timelapse (1 image toutes les 5 minutes) du compartiment tissulaire (Figure 8B,C) pour l’analyse de migration afin d’obtenir la carte de migration.

8. Analyse d’images numériques

  1. Pour la carte d’adhérence, comptez le nombre de neutrophiles adhérents dans chaque vaisseau. Pour chaque bifurcation, créez une région circulaire d’intérêt (ROI) d’un diamètre égal à deux fois le diamètre du vaisseau et comptez le nombre de neutrophiles adhérents.
  2. Utilisez le comptage manuel ou la fonction automatisée De comptage d’objets pour quantifier le nombre de neutrophiles adhérents dans chaque vaisseau et région de bifurcation.
  3. Utilisez la carte de taux de cisaillement du réseau générée à l’aide de la simulation CFD17 pour déterminer le taux de cisaillement dans chaque navire. Ensuite, tracez le nombre de neutrophiles adhérents dans un récipient donné par rapport au taux de cisaillement dans ce récipient pour créer une carte du taux de cisaillement dans bMFA comme le montre la figure 9A.
  4. Les neutrophiles sont comptés comme migrés s’ils ont traversé l’endothélium dans le compartiment tissulaire. Comptez le nombre de neutrophiles migrés à 10 min, 15 min, 30 min et 60 min. Tracez le nombre de neutrophiles migrés par rapport au temps, comme le montre la figure 9B.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Après 48 h de culture sous écoulement de cisaillement dans la bMFA, les cellules endothéliales recouvraient la surface des canaux vasculaires dans la bMFA et s’alignaient dans le sens de l’écoulement (Figure 6). La microscopie confocale a indiqué que toutes les surfaces des canaux vasculaires étaient recouvertes de cellules endothéliales, formant une lumière 3D complète dans bMFA18.

En utilisant ce protocole, une carte d’adhésion des neutro...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le bMFA reproduit la topographie et les conditions d’écoulement des réseaux microvasculaires in vivo et peut être utilisé pour étudier l’interaction cellule leucocytaire-endothéliale et la fonction endothéliale in vitro dans des conditions physiologiquement réalistes. Dans la microvascularisation de la souris ou de l’homme, la géométrie des réseaux microvasculaires est auto-similaire et fractale, et le nombre de Reynolds << 1, ce qui indique que la géométrie vasculaire n’a pas d’impact significatif sur ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 et GM134701 (M.F.K. et L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), et Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. et L.E.K.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mLFisher Scientific14-823-30
Dosage microfluidique biomimétique (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exclusivité chez SynVivo
Aiguille émousséeJensen GlobalJG24-0.5
Chlorure de calciumFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250 000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Milieu d’isolement des leucocytes
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Fibronectine humaineFisher Scientific33-016-015utiliser l’ECM recommandée par le fournisseur pour différentes cellules lines
Milieu de croissance des cellules endothéliales microvasculaires-2 BulletKitLonzacc-3202Milieu de culture de cellules endothéliales endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC).
Les cellules endothéliales microvasculaires du poumon humainLonzacc-2527utilisent vedor remommended trypsine-EDTA et TNS
Chlorure de magnésiumFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.
Microscope NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Logiciel d’imagerie
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Pompe à seringue UltraAppareil Harvard70-3007Pompe à seringue
Hydroxyde de potassiumFisher Scientific02-003-763
TNF-alpha humain recombinantR& D Systems210-TA
Pince à glissièreSynVivo
Chlorure de sodiumFisher ScientificS640-500
Synvivo Amorce pneumatiqueSynVivo
Trypsine-EDTA, Trypsine Neutralisation Solution (TNS)Lonzacc-5034
Tygon tubingFisher Scientific50-206-8921Tubing

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770(2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725(2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171(2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309(2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379(2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025(2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Interaction leucocytes endoth liumEssai microfluidique biomim tiqueMod le de maladie inflammatoireMigration des neutrophilesPerm abilit des cellules endoth lialesMicroscopie confocaleAnalyse du taux de cisaillementExpression des mol cules d adh sionDynamique des fluides num rique

Articles connexes