Conception et micro-injection d’oligonucléotides antisens morpholino et d’ARNm dans des embryons de poisson-zèbre pour élucider la fonction génique spécifique dans le développement cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit la conception, la préparation et la micro-injection d’un morpholino bloquant la traduction contre un gène cardiaque représentatif ; Dérivés du cœur et de la crête neurale exprimés2 (main2) dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre nouvellement fécondés pour inhiber la fonction des gènes. Il montre également un sauvetage transitoire de ces « morphants » par co-injection d’ARNm codant pour ce produit génique.

Résumé

Le système d’inactivation basé sur des oligomères morpholino a été utilisé pour identifier la fonction de divers produits géniques par perte ou expression réduite. Les morpholinos (MO) ont l’avantage de la stabilité biologique par rapport aux oligonucléotides d’ADN car ils ne sont pas sensibles à la dégradation enzymatique. Pour une efficacité optimale, les MO sont injectés dans des embryons au stade 1 à 4 cellules. L’efficacité temporelle de l’inactivation est variable, mais on pense que les MO perdent leurs effets en raison de la dilution éventuellement. La dilution de Morpholino et la quantité injectée doivent être étroitement contrôlées afin de minimiser l’apparition d’effets hors cible tout en maintenant l’efficacité sur la cible. D’autres outils complémentaires, tels que CRISPR/Cas9, doivent être utilisés contre le gène cible d’intérêt pour générer des lignées mutantes et confirmer le phénotype du morphant avec ces lignées. Cet article montrera comment concevoir, préparer et micro-injecter un morpholino bloquant la traduction contre hand2 dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre au stade cellulaire 1 à 4 pour renverser la fonction hand2 et sauver ces « morphants » par co-injection d’ARNm codant pour l’ADNc correspondant. Par la suite, l’efficacité des micro-injections de morpholino est évaluée en vérifiant d’abord la présence de morpholino dans le jaune d’œuf (co-injecté avec du rouge de phénol) puis par une analyse phénotypique. De plus, une analyse fonctionnelle cardiaque pour tester l’efficacité du renversement sera discutée. Enfin, l’évaluation de l’effet du blocage de la traduction génique induit par le morpholino via le western blot sera expliquée.

Introduction

L’utilisation du poisson-zèbre comme modèle pour l’étude du développement et des maladies cardiovasculaires offre une variété d’avantages, notamment une conservation élevée de la fonction des gènes, une transparence optique, un développement cardiovasculaire rapide et un coût inférieur par rapport aux modèles in vivo traditionnels¹. Les oligonucléotides (MO) morpholino sont les outils d’inactivation de gènes antisens les plus couramment utilisés pour le modèle du poisson zèbre. Les MO sont fréquemment utilisés pour déterminer un phénotype ou pour sonder la fonction d’un gène. Le Dr James Summerton a d’....

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux normes acceptées de soins humains aux animaux en vertu de la réglementation de l’IACUC à QU ; des animaux ont été détenus dans l’installation du poisson-zèbre du Centre de recherche biomédicale de l’Université du Qatar (QU-BRC). Tous les animaux utilisés dans ces études expérimentales étaient à moins de 3 jours après la fécondation (dpf).

REMARQUE : Pour chaque groupe expérimental, il est conseillé d’utiliser au moins 30 embryons pour une rigueur statistique. Les groupes expérimentaux sont les suivants :

Groupe témoin : Ce groupe comprend les....

Résultats

Le graphique de la figure 6 illustre le pourcentage moyen d’embryons survivant à 24, 48 et 72 hpf pour les embryons MO spécifiques de HAND2 et les embryons témoins injectés de MO brouillés. Les embryons injectés de MO dans des doses de 1 mM (8 ng/μL) et de 0,8 mM (6,4 ng/μL) ont montré une réduction significative du pourcentage de survie par rapport aux embryons témoins brouillés injectés de MO. Cela a été observé à chaque point temporel mesuré où une létalité ou une malformation a été obser.......

Discussion

La technologie Morpholino (MO) a été largement utilisée chez les poissons-zèbres, les xénopes, les oursins et, plus récemment, dans les systèmes de culture cellulaire. Avec la plupart des méthodes, en plus des avantages, il y a aussi des pièges dont l’expérimentateur doit être conscient. L’un des principaux pièges de la technologie MO est l’inquiétude que les effets phénotypiques observés par l’approche d’inactivation du gène médiée par MO ne sont pas dus à la perte de fonction associée .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrylamide 40 %	Sigma	Sigma, réf. C977M88
Agarose	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich n° de catalogue A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen n° de catalogue 80204.
alpha Tubuline	Abcam	Abcam- ab4074	Lapin polyclonal à alpha Tubuline lot GR3 180877-1 (50 kDa)
Persulfate d’ammonium grade moléculaire	Sigma	Sigma, cat. no C991U65
BV10 chanfreineuse capillaire	Sutter Instruments Produit	Sutter Instruments Catalogue de produits # BV10
Chimiluminescence Imagerie Gnome	SYNGENE	SYNGENE
Cleaver Scientific Blot	CVS10D_OmniPAGEMini	CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no C861C44
Kit d’électrochimiluminescence (ECL) Abcam	Biochemicals	Abcam Biochemicals cat. no ab65623
Glycine	Sigma	Sigma, cat. no C988U91
Chèvre anti Rabbit	Abcam	Abcam-  ; ab6721	Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (HRP) 2nd anticorps lot GR3179871-1
HAND2	Outils géniques	Fabriqués sur mesure pour HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'Hand2
	Abcam	Abcam- ab10131	Anticorps polyclonaux de lapin Anti-HAND2 lot GR143200-9 (24- 26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Humain étiqueté ORF Clone	OriGene Technologies, Inc	RC224436L3	Vecteur : pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI KIT D’EXTRACTION D’ADN/ARN/protéines	IBI Scientific IBI	Scientific cat. no -r IB47702
Système d’imagerie	iBright iBright	CL1000 Système
Isopropanol	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 278475-2L
Tampon de chargement d’échantillons Laemmli (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 70607
Mercaptoethanol	Sigma	Sigma, cat. no M6250-1L
Spectrophotomètre à microplaques avec l’interface du logiciel Gen5 Data Analysis	Epoch	Microscope Ziess SteREO
	Lumar V12 Microscope	fluorescence Ziess SteREO Lumar V12 Microscope
Huile minérale	Fisher Scientific	Fisher Scientific n° de catalogue 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Kit de transcription	Thermo Fisher	Thermo Fisher N° cat. AM1340	pour la génération d’ARNm
Eau sans nucléase	New England Biolabs	New England Biolabs n° de catalogue B1500L
PC-100 Extracteur de micropipettes	NARISHIGE GROUP Produit	NARISHIGE GROUP Catalogue de produits # PC-100
Rouge phénolique	Sigma	Sigma, réf. P-0290
Injecteur de picolitre	Appareil Harvard Catalogue	appareils Harvard # PLI-90A
Pierce Dosage de l’acide bicchoninique (BCA) Kit de dosage des protéines	Thermo Fisher	Thermo Fisher réf. 23227
PMSF, Inhibiteur de protéase comme inhibiteurs de protéase	Thermo Fisher	N° de cat. 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich n° de catalogue 10165921001
Inhibiteur de protéase Cocktail	Thermo Fisher	Thermo Fisher n° de catalogue 88668
Échelle protéique	SMOBiO	SMOBiO cat. no PM2500
Test de radio-immunoprécipitation (RIPA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 89900
Ringer' s solution	Thermofisher	N° de catalogue S25513
SDS	Sigma	Sigma, cat. no 436143
Standard Control	Gene tools	SKU : PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- qui cible une mutation de l’intron de bêta-globine humaine
Tampon de stripping	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. 21059
Temed	IBI scientific	IBI scientific cat. no C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no BP-152-500
Tween	sigma life science	sigma life science cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Chambre système de chenilles avec le logiciel EthoVision XT 11.5	Noldus Information Technology, NL	Noldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5s	Zeiss	Stemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-C	Zeiss	Stemi 2000-C