Conception et micro-injection d’oligonucléotides antisens morpholino et d’ARNm dans des embryons de poisson-zèbre pour élucider la fonction génique spécifique dans le développement cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit la conception, la préparation et la micro-injection d’un morpholino bloquant la traduction contre un gène cardiaque représentatif ; Dérivés du cœur et de la crête neurale exprimés2 (main2) dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre nouvellement fécondés pour inhiber la fonction des gènes. Il montre également un sauvetage transitoire de ces « morphants » par co-injection d’ARNm codant pour ce produit génique.

Résumé

Le système d’inactivation basé sur des oligomères morpholino a été utilisé pour identifier la fonction de divers produits géniques par perte ou expression réduite. Les morpholinos (MO) ont l’avantage de la stabilité biologique par rapport aux oligonucléotides d’ADN car ils ne sont pas sensibles à la dégradation enzymatique. Pour une efficacité optimale, les MO sont injectés dans des embryons au stade 1 à 4 cellules. L’efficacité temporelle de l’inactivation est variable, mais on pense que les MO perdent leurs effets en raison de la dilution éventuellement. La dilution de Morpholino et la quantité injectée doivent être étroitement contrôlées afin de minimiser l’apparition d’effets hors cible tout en maintenant l’efficacité sur la cible. D’autres outils complémentaires, tels que CRISPR/Cas9, doivent être utilisés contre le gène cible d’intérêt pour générer des lignées mutantes et confirmer le phénotype du morphant avec ces lignées. Cet article montrera comment concevoir, préparer et micro-injecter un morpholino bloquant la traduction contre hand2 dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre au stade cellulaire 1 à 4 pour renverser la fonction hand2 et sauver ces « morphants » par co-injection d’ARNm codant pour l’ADNc correspondant. Par la suite, l’efficacité des micro-injections de morpholino est évaluée en vérifiant d’abord la présence de morpholino dans le jaune d’œuf (co-injecté avec du rouge de phénol) puis par une analyse phénotypique. De plus, une analyse fonctionnelle cardiaque pour tester l’efficacité du renversement sera discutée. Enfin, l’évaluation de l’effet du blocage de la traduction génique induit par le morpholino via le western blot sera expliquée.

Introduction

L’utilisation du poisson-zèbre comme modèle pour l’étude du développement et des maladies cardiovasculaires offre une variété d’avantages, notamment une conservation élevée de la fonction des gènes, une transparence optique, un développement cardiovasculaire rapide et un coût inférieur par rapport aux modèles in vivo traditionnels¹. Les oligonucléotides (MO) morpholino sont les outils d’inactivation de gènes antisens les plus couramment utilisés pour le modèle du poisson zèbre. Les MO sont fréquemment utilisés pour déterminer un phénotype ou pour sonder la fonction d’un gène. Le Dr James Summerton a d’abord mis au point le système d’administration de morpholino pour l’inhibition in vivo de la traduction de l’ARNm dans le but de mettre au point des traitements pour les défauts de développement^humain2,3. Les MO ont été utilisés pour des organismes modèles in vitro et in vivo afin d’inactiver des gènes et d’étudier les conséquences de cet inactivation sur le phénotype. Cela se fait en observant des altérations dans le développement d’organes spécifiques, par exemple le cœur. L’inactivation de gènes spécifiques au cœur dans les embryons de poisson-zèbre WT a conduit à l’échec d’un rythme cardiaque approprié, attestant de la fonction indispensable de ces gènes pour le développement cardiaque ^4,5. Ces phénotypes ont été sauvés par co-injection d’ARNm pour les gènes spécifiques. Une étude portant sur la troponine cardiaque T (Tnnt2) a montré que l’expression de l’ARNm tnnt2 complet pouvait sauver les phénotypes sarcomériques causés par l’inactivation morpholino⁶. Une autre étude a révélé que l’intégrité des bandes A et des disques Z pouvait être restaurée par la surexpression de l’ARNm régulateur de la myosine à chaîne légère orthologue (cmlc2) dans les morphants cmcl2 ⁷.

Les MO sont couramment utilisés pour inhiber l’expression des gènes en ciblant l’épissage des pré-ARNm ou en bloquant la traduction. Les MO bloquant l’épissage se lient et inhibent le pré-ARNm en inhibant l’épissage. Le blocage traductionnel se produit lorsque le MO se lie à la région 5'-non traduite de l’ARNm complémentaire pour entraver l’assemblage du ribosome. Les MO sont la méthode spécifique au gène la plus largement utilisée pour inhiber l’expression des gènes dans les modèles in vivo ; ce sont également les agents bloqueurs d’ARNm les plus efficaces utilisés dans les cultures cellulaires. Le morpholino lui-même se compose généralement d’une chaîne courte (environ 25) de bases de sous-unités morpholino. Chaque sous-unité MO comprend une base d’acide nucléique, un cycle morpholine et un phosphorodiamidate non ionique. Les différents mécanismes d’action des deux types de MO nécessitent des tests différents pour vérifier l’efficacité du knockdown. Pour les MO bloquant la traduction, une analyse par western blot est le test d’efficacité le plus fiable, car la protéine d’intérêt ne doit pas être produite en raison du blocage du site de début de la traduction de l’ATG. Les MO ne dégradent pas directement leur ARNm cible ; Au lieu de cela, ils se lient à des régions spécifiques et inhibent l’expression jusqu’à ce qu’ils se dégradent naturellement. Cependant, les MO bloquant l’épissage modifient le pré-ARNm en induisant une modification de l’épissage, qui peut être dosée par réaction en chaîne par polymérase à transcriptase inverse (RT-PCR) et électrophorèse sur gel.

Trois parties cruciales du processus de dépistage des MO doivent être normalisées : (i) La courbe de dose des MO doit être ajustée pour la reconnaissance phénotypique. La courbe de dose montre également la dose létale 50 (DL50 : la dose à laquelle 50 % des embryons injectés meurent) pour chaque MO testé afin d’améliorer la capacité à optimiser le « signal » phénotypique par rapport au « bruit » hors ^cible3. ii) La nomenclature de phénotypage adaptée devrait être bien documentée ; Une description phénotypique précise et facilement compréhensible est essentielle pour fournir des explications détaillées basées sur la littérature existante et l’expérience des chercheurs afin de faciliter le partage d’informations entre ceux qui n’ont pas examiné directement les embryons. (iii) Le fait d’avoir un langage bien défini facilite la collecte centralisée des données à partir de la base de données Morpholino⁸.

Dans les études d’inactivation de l’OM pour les gènes cardiaques, l’activité cardiaque des animaux et la dynamique du flux sanguin doivent être surveillées afin de déterminer l’impact des expériences d’inactivation de l’OM sur la fonction du système cardiovasculaire. De telles analyses nécessitent une visualisation en temps réel du système cardiovasculaire à haute résolution. La peau du poisson-zèbre est transparente pendant la première semaine de développement, ce qui permet de visualiser le cœur et la circulation sanguine par microscopie. Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les paramètres physiologiques les plus calculés sont la fréquence cardiaque et le débit cardiaque, ainsi que le raccourcissement fractionnaire, le changement de surface fractionnée et la fraction d’éjection. Les vitesses du flux sanguin peuvent être mesurées en suivant les globules rouges en mouvement, et ces mesures sont utilisées pour déterminer les niveaux de contrainte de cisaillement, un facteur mécanobiologique crucial sur les cellules endothéliales. Une telle évaluation nécessite l’enregistrement de films en accéléré pour les battements cardiaques et le sang qui circule à l’aide d’un microscope inversé ou d’un stéréomicroscope équipé d’une caméra à grande vitesse.

Cet article montre comment concevoir, préparer et microinjecter un morpholino bloquant la traduction contre un gène d’intérêt dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre fraîchement fécondés pour désactiver la fonction des gènes. Il montrera également le sauvetage de ces « morphants » par co-injection d’ARNm codant pour ce gène. Nous analyserons ensuite l’efficacité des micro-injections de morpholino à travers des caractérisations phénotypiques ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles cardiaques. Cette approche sera démontrée sur un gène cardiaque largement étudié, hand2.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux normes acceptées de soins humains aux animaux en vertu de la réglementation de l’IACUC à QU ; des animaux ont été détenus dans l’installation du poisson-zèbre du Centre de recherche biomédicale de l’Université du Qatar (QU-BRC). Tous les animaux utilisés dans ces études expérimentales étaient à moins de 3 jours après la fécondation (dpf).

REMARQUE : Pour chaque groupe expérimental, il est conseillé d’utiliser au moins 30 embryons pour une rigueur statistique. Les groupes expérimentaux sont les suivants :

Groupe témoin : Ce groupe comprend les embryons cultivés dans de l’eau d’œuf sans aucune injection. Les résultats obtenus ici constitueront la base de référence du contrôle.

Groupe témoin négatif : Ce groupe comprend les embryons cultivés dans de l’eau d’œuf injectée avec des MO brouillés.

Groupe injecté : Ce groupe comprend des embryons injectés avec hand2 MO seul et hand2 MO avec l’ARNm hand2 pour sauver le phénotype. La comparaison des groupes expérimentaux permettra d’évaluer précisément l’influence de l’inhibition et du sauvetage de la main2 sur la fonction cardiaque.

1. Morpholino dessine pour la main2.

REMARQUE : Les séquences MO peuvent être adaptées de la littérature ^9,10,11. Alternativement, ces oligos peuvent être conçus en ligne par Gene-tools. Gene-tools offre un service de conception en ligne gratuit et rapide, accessible via leur site Web¹². Il est facile de concevoir un MO personnalisé en fournissant des informations sur les gènes d’intérêt, telles que des informations sur les séquences ou les numéros d’accès. Les étapes spécifiques suivantes résument comment concevoir des MO contre hand2 chez le poisson zèbre :

1. Tout d’abord, recherchez les détails du gène d’intérêt dans la base de données NCBI. Pour la main 2, chez le poisson zèbre¹³.
2. Obtenez l’ID de transcription de l’ARNm GenBank auprès de NCBI¹⁴.
3. Obtenez la séquence de l’ARNm à partir de NCBI¹⁵.
   REMARQUE : Des oligonucléotides antisens modifiés par Morpholino (MO) pour le gène hand2 du poisson-zèbre sont disponibles et ont déjà été publiés. main2 Séquence^{MO 9,10,11} : 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', les séquences MO utilisées dans l’étude sont énumérées dans la table des matériaux.
4. Obtenez un contrôle négatif à partir d’un MO non apparié ou brouillé (séquences similaires avec des changements aléatoires de paires de bases) à partir des outils génétiques¹⁶ à injecter. Cela permettrait d’attester de la spécificité du ou des phénotypes observés dans des injections spécifiques de MO et de minimiser le risque que les effets observés proviennent d’un artefact de la procédure d’injection.

2. Préparation de l’injection de morpholino

1. Préparation de la pâte
   1. Dissoudre les stocks d’MO avec du jdH₂O ; Le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) peut endommager les MO et être toxique pour les embryons. Par conséquent, utilisez du ddH₂O sans DEPC. Lors de la commande, les MO sont livrés dans un flacon à une concentration de 300 nM.
      REMARQUE : Bien que Gene Tools recommande des solutions mères de 1 mM (~8 ng / nL), cela peut être trop faible, surtout si le morpholino nécessite une dose élevée ou est mélangé avec d’autres MO. Par conséquent, il est idéal pour réaliser différentes concentrations de solutions mères de MO (2 ou 3 mM).
   2. Préparez une solution de travail de 0,2 mM en sous-diluant la solution de travail (c’est-à-dire pour une solution mère de 2 mM, dilution 1:10). Préparez 10 μL de solution de travail en ajoutant la solution de Danieleaux (7 μL), le morpholino (1 μL) et le rouge de phénol (2 μL de 10 fois le stock). Le rouge de phénol donne à la solution une couleur rouge foncé pour aider à retracer la matière injectée dans l’embryon.
   3. Conservez les MO à température ambiante (RT) dans des contenants hermétiques pour éviter l’évaporation. Ne laissez pas les MO sur la glace sur la paillasse, car la solution pourrait précipiter. La manipulation RT est la plus appropriée.
      REMARQUE : Gene Tools recommande l’une ou l’autre des deux méthodes de stockage des MO : la solution de travail peut être conservée à -20 °C (pendant plusieurs mois à des années) ou RT dans un tube scellé pour un stockage à long terme. S’il est conservé à -20 °C, chauffer la solution d’oligonucléotides à 65 °C pendant 10 min et agiter pour dissoudre complètement le morpholino avant utilisation (pas besoin de le réchauffer s’il est conservé à RT).
2. Transcription in vitro de l’ARNm
   REMARQUE : La transcription in vitro a été utilisée pour générer l’ARNm de Hand2 à partir du clone ORF marqué humain du plasmide HAND2 (NM_021973) à micro-injecter dans des embryons de poisson-zèbre pour sauver le phénotype dû à l’abattage du poisson-zèbre hand2 à l’aide de morpholinos, les détails du plasmide utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
   1. Linéariser l’ADN plasmidique à l’aide d’une enzyme de restriction appropriée et le purifier à l’aide d’un kit de purification de l’ADN (Table des matériaux). Utilisez l’ADN linéarisé purifié comme matrice pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm pour injection conformément aux instructions du fabricant (Table des matériaux).
   2. Enfin, injectez 250 pg d’ARNm humain pour le gène d’intérêt afin d’effectuer le sauvetage du phénotype afin de tester si l’absence d’un phénotype provient effectivement de la perte du gène du poisson zèbre par MO.
3. Préparation à l’injection
   1. Tirez une aiguille à l’aide d’un extracteur de micropipette (Table des matériaux), en suivant les étapes 2.3.2 à 2.3.6.
   2. Utilisez des tubes capillaires de 1 mm avec des filaments et un extracteur de micropipette. Allumez la machine et ouvrez le couvercle
   3. Tournez le bouton de sélection de mode sur NO.2 Heater. À l’aide d’un appareil de chauffage NO.2 , ajustez le bouton pour amener la chaleur à 68 °C
   4. Remettez le bouton de sélection de mode sur la position Étape 1 . Utilisez quatre poids (2 types légers / 2 types lourds)
   5. Placez le capillaire sur le support et fermez le couvercle. Appuyez sur le bouton Start pour obtenir l’aiguille tirée.
      REMARQUE : Cela générera des aiguilles capillaires avec un long cône
   6. Coupez brièvement la pointe des aiguilles à l’aide d’une pince. Aiguisez la pointe de l’aiguille tirée pour une pénétration facile dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un biseauteur capillaire pendant environ 30 s, ce qui permet d’obtenir des pointes d’un diamètre d’environ 15 à 25 μm.
   7. Calibrez l’aiguille pour estimer la quantité d’injection en suivant les étapes 2.3.8 à 2.3.13.
   8. Mélangez brièvement la solution d’ARNm/morpholino avant de la charger dans l’aiguille pour dissoudre les particules qui pourraient obstruer complètement l’aiguille.
   9. Ajouter ~3-4 μL de solution de MO dans la partie arrière de l’aiguille d’injection à l’aide d’une pointe de pipette à pointe micronique. Les aiguilles d’injection sont équipées d’une petite tranchée pour faciliter le remblayage capillaire.
   10. Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles dans l’aiguille d’injection. Montez l’aiguille sur le micro-injecteur.
   11. Vérifiez que la pointe de l’aiguille n’est pas bouchée et que la solution de MO peut s’écouler de l’aiguille en appuyant sur la pédale d’injection.
   12. Calibrez le volume d’injection en mesurant la taille des gouttelettes. Placez la pointe de l’aiguille dans de l’huile minérale sur une lame micrométrique. Appuyez sur la pédale d’injection et ajustez la pression d’injection (éjection) et/ou le temps d’injection (ms) jusqu’à ce que le diamètre de la gouttelette éjectée soit de 0,1 mm, ce qui correspond à 0,5 nL.
   13. Assurez-vous que le volume d’injection est d’environ 0,5 à 1 nL. Ajustez le volume en modifiant la pression d’injection (éjection), la pression (psi) ou le temps (ms).
   14. Pour le protocole de configuration de l’injecteur picolier, suivez les étapes 2.3.15-2.3.16
   15. Utilisez un injecteur de picoliter pour les injections de poisson-zèbre. Allumez la pompe d’alimentation de l’injecteur.
   16. Préparez l’injecteur selon les exigences indiquées ci-dessous :
       1. Balance P : Assurez-vous que l’équilibre P est autour de 0. Assurez-vous qu’il est légèrement négatif pour éviter que le jaune ne reflue dans l’aiguille, en diluant la solution de MO dans l’aiguille. À l’inverse, si la contre-pression est trop élevée, le MO s’écoulera constamment de l’aiguille même sans exercice de pression sur la pédale, ce qui entraîne une variabilité et des incohérences dans la dose injectée et les phénotypes observés.
       2. P-inject : 20-25 psi est idéal ; Modifiez-le pour ajuster le volume d’injection. Cela peut varier de 10 à 30 psi, mais commencez par ~20 psi pour vérifier s’il fournit le volume souhaité.
       3. Temps d’injection : Assurez-vous de réduire le temps d’injection à 300 ms. Avant d’ajuster le volume d’injection, ajustez le moment de l’injection.
   17. Pour l’injection de morpholino, suivez les étapes 2.3.18 et 2.3.19.
   18. Préparez la chambre d’injection comme suit : Préparez 2 % d’agarose à partir de 0,6 g d’agarose et de 30 ml de milieu E3. Versez l’agarose dans une boîte de Pétri et placez un moule d’injection sur l’agarose à l’aide d’un moule d’injection TU-1. Une fois refroidis dans un congélateur, des sillons se formeront pour la mise en place et la stabilisation des embryons (figure 1A).
       REMARQUE : La recette de solution mère E3M 60x se compose de 5,0 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,16 mM de MgSO₄·7H₂O, 0,4 mM de CaCl₂·2H₂O dans 1 L ddH₂O avec un pH final de 7,6.
   19. Transférez les embryons collectés dans les sillons à l’aide d’une pipette de transfert, retirez tout excès de milieu E3 autour des embryons pour éviter que les embryons ne flottent (Figure 1B).

3. Injection d’une solution de MO et d’ARNm dans le jaune d’œuf

1. Insérez l’aiguille à travers le chorion, injectez près de la limite de la cellule/jaune du côté de l’embryon et appuyez sur la pédale d’injection (Figure 1C).
   REMARQUE : La solution de MO/rouge de phénol injectée ne diffusera pas immédiatement dans le jaune. Une tache rouge sera observée dans le jaune qui se dissipe progressivement. Le matériel injecté ne doit pas dépasser plus de 10 % de la taille de l’embryon. Les MO peuvent être micro-injectés dans le jaune d’œufs de poisson-zèbre nouvellement pondus jusqu’au stade 8 cellules, car les MO peuvent facilement être absorbés dans le flux cytoplasmique du sac vitellin par les cellules en développement^17,18. Dans les injections de plasmide ou d’ARNm coiffé, l’injection doit être effectuée dans un seul blastomère d’un embryon au stade unicellulaire.
2. Transférez les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu E3 et incubez-les à 28 °C jusqu’à 3 dpf, avec un réapprovisionnement quotidien en milieu E3. À ce stade, effectuez l’évaluation phénotypique à l’aide d’un microscope.
   REMARQUE : Les solutions d’OM doivent être soigneusement diluées pour chaque investigation afin d’établir la concentration la plus faible nécessaire pour induire un phénotype spécifique. La létalité embryonnaire pour chaque MO doit également être déterminée. À des concentrations plus élevées (supérieures à 4-10 ng, selon l’MO), les MO ont tendance à provoquer des effets non spécifiques, tels que la mort cérébrale ou cellulaire générale.
3. Co-injecter MO avec 250 pg d’ARNm de la main humaine2 de la même manière pour confirmer le sauvetage du phénotype induit par la perte du gène hand2 du poisson zèbre par MO.

4. Western blot pour vérifier le succès du morpholino knockdown

1. Prélever les embryons à des moments précis (48 hpf, 72 hpf) et déchorionner si nécessaire à l’aide de l’enzyme Pronase.
2. Décoir les embryons pour éliminer la vitellogénine à l’aide d’une méthodologie déjà connue¹⁹.
   REMARQUE : La vitellogénine est une phospholipo-glycoprotéine qui sert de source de nutriments pour l’embryon en croissance. L’électrophorèse sur gel 2D à haute résolution et le western blot considérablement amélioré sont rendus possibles par le déhouxage des embryons et l’élimination de la vitellogénine.
3. Effectuez le western blot comme décrit précédemment²⁰.

5. Évaluation de la structure et de la fonction cardiaques :

1. Imagerie en direct du poisson-zèbre : imagerie du ventricule
   REMARQUE : Plusieurs paramètres de fonction cardiaque/hémodynamique peuvent être calculés en visualisant le cœur battant de l’embryon de poisson-zèbre^21,22. Ces paramètres comprennent le débit cardiaque (CO), la fraction d’éjection (EF), le volume systolique (SV), le raccourcissement fractionnel (FS) et le changement de surface fractionnée (FAC) (veuillez consulter les articles précédents impliquant des protocoles détaillés pour l’évaluation de la fonction cardiaque pour l’évaluation de la fonction cardiaque pour les embryons de poisson-zèbre^22,23). Les étapes suivantes expliquent brièvement comment calculer ces paramètres pour les embryons de poisson-zèbre à ~3 dpf, un stade où la peau de ces organismes est transparente, permettant une visualisation par microscopie à fond clair.
   1. Mettez une goutte de solution de méthylcellulose (RT) à 3 % dans la lame d’imagerie du puits concave.
   2. Placez l’embryon de poisson-zèbre dans le puits à l’aide d’un compte-gouttes en plastique adapté (Figure 2A, B)
      REMARQUE : Un remplissage excessif du puits peut entraîner le déplacement des poissons hors du puits.
   3. Mélangez délicatement la goutte de méthylcellulose à 3 % avec le milieu E3 pour stabiliser l’embryon éclos.
      REMARQUE : Pour préparer une solution de méthylcellulose à 3 %, dissoudre 3 g de poudre de méthylcellulose dans 100 mL de PBS, ou un autre milieu de montage, dans une fiole. Placez un aimant d’agitation dans la fiole du mélange et placez la fiole sur une plaque d’agitation magnétique. Réglez la vitesse sur « faible » et maintenez-la à 4 °C pendant ~1 jour pour dissoudre tous les grumeaux. Une fois que la méthylcellulose est complètement dissoute, aliquote dans de petits tubes et stockez-la à -20 °C.
   4. Placez le poisson sur sa gauche, le côté droit vers le haut et la pointe antérieure vers la gauche, afin de faciliter l’imagerie sans ambiguïté du ventricule (figure 2C).
   5. Au microscope, zoomez sur le cœur de l’embryon avec un grossissement de 100x et commencez à enregistrer pendant ~5 s. Assurez-vous que les bords du ventricule se trouvent à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie (Figure 2D).
   6. Enregistrez des vidéos en accéléré à l’aide d’une caméra haute vitesse et d’un stéréomicroscope à environ 100 images par seconde (ips) de l’embryon entier (Figure 2C), du ventricule battant (Figure 2D) et des globules rouges en mouvement (GR) dans les principaux vaisseaux, tels que l’aorte dorsale ou la veine cardinale postérieure (Figure 2E), pour l’analyse de la fonction cardiaque.
   7. Enregistrez le film au format vidéo AVI ou au format de séquences d’images TIFF (ou JPEG).
2. Calculer la fréquence cardiaque
   1. Calculez le temps nécessaire pour enregistrer deux images consécutives. Pour 100 ips, l’intervalle de temps est égal à 0,01 s.
   2. Choisissez un point connu dans n’importe quel cycle cardiaque enregistré (c’est-à-dire fin de diastole ou fin de systole). Calculez le nombre d’images nécessaires pour répéter le cycle.
   3. Multipliez l’intervalle de temps de l’étape 5.2.1 par le nombre d’images de l’étape 5.2.2. Le résultat est la durée (en secondes) d’un battement de cœur.
   4. Pour calculer les battements par minute, divisez 60 par le nombre obtenu à l’étape précédente. Pour les embryons normaux de 3 dpf, cela devrait être d’environ 150 bpm (2,5 Hz).
      REMARQUE : De nombreuses applications logicielles peuvent calculer automatiquement la fréquence cardiaque à partir d’enregistrements de battements cardiaques tels que ViewPoint²⁴ et DanioVision²⁵.
   5. Analysez la structure cardiaque à l’aide d’un film time-lapse à environ 100 ips pour vérifier l’ensemble du cœur afin de détecter la présence d’un œdème cardiaque ou de tout autre défaut structurel.
      REMARQUE : La figure 3A montre un cœur embryonnaire normal de 3 dpf, et la figure 3B montre un cœur de 3 dpf avec œdème cardiaque et défaut d’anse cardiaque (ventricule allongé).
3. Calculez la variation fractionnaire de surface (FAC) :
   REMARQUE : Le changement de surface fractionnée (FAC) est un paramètre utilisé pour comparer les zones ventriculaires de fin de diastole et de fin de systole afin d’évaluer la contractilité du ventricule.
   1. Utilisez une vidéo time-lapse d’environ 100 ips pour déterminer les images qui représentent un cycle cardiaque. Extrayez les images qui montrent la fin de la systole et la diastole finale.
   2. Calculez à la fois la surface de fin de diastole (EDA) et la surface de fin de systole (ESA) à l’aide d’ImageJ ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire.
   3. Utilisez la formule suivante pour calculer les FAC 22,26,27 :
      FAC
4. Calculez le raccourcissement fractionnaire (FS) :
   REMARQUE : Le raccourcissement fractionné (FS) est un autre paramètre utilisé pour évaluer la contractilité du ventricule ; pour déterminer le FS, les diamètres diastolique et systolique des ventricules doivent être mesurés^{à 21}.
   1. Répétez l’étape 5.3.1
   2. À l’aide d’ImageJ ou de tout autre programme d’analyse d’images équivalent, vous pouvez mesurer les diamètres des parois ventriculaires_{aux points de} fin de diastole D_d et de systole finale D. Dans la plupart des cas, des diamètres d’axe court sont utilisés pour déterminer le lissage fractionnel (FS) (Figure 4).
   3. Utilisez la formule suivante pour calculer FS^22,27 :
      FS
5. Calcul du volume systolique (SV) :
   REMARQUE : Pour chaque battement cardiaque, le SV est la quantité de sang pompée par le ventricule, qui est facilement calculée à partir des volumes de fin de diastole et de fin de systole des ventricules²⁸.
   1. Répétez les étapes 5.3.1 et 5.3.2.
   2. Mesurez les diamètres de fin de diastole (D_L) et d’extrémité de systole (D_S) comme indiqué à la figure 4.
      REMARQUE : En supposant que les ventricules des cœurs de poisson-zèbre ont la forme d’un sphéroïdal prolate^21,22, le volume ventricule est calculé à l’aide de la formule suivante.
      Volume
      La SV peut être calculée en suivant la formule²⁷ ci-dessous. La plage SV normale est de 0,15 à 0,3 nL pour 2 à 6 embryons dpf²⁹. Ici, EDV est le volume de fin de diastole et ESV est le volume de fin de systole.
      SV = (EDV - ESV)
6. Calculez la fraction d’éjection (FE) :
   REMARQUE : La FE est définie comme la fraction de sang éjectée du ventricule à chaque battement de cœur^{de 28}.
   1. À partir des formules ci-dessus, extrayez EDV et ESV pour le poisson.
   2. Calculez FE comme suit^22,27 :
      FE ( %)
7. Calculez le débit cardiaque (CO) :
   REMARQUE : CO est le volume de sang pompé par le cœur²⁸. CO a une valeur de 10-55 nL/min pour 2-6 embryons dpf²⁹.
   1. Calculez les SV et les FC comme il est mentionné aux sous-sections 5.5 et 5.2 précédentes.
   2. Utilisez la formule suivante pour calculer le CO ^22,27 :
      CO (nL/min) = SV (nL/battement) x HR (battements/min).
8. Mesurez les vitesses des globules rouges :
   REMARQUE : La détermination de la vitesse des cellules est essentielle pour évaluer le débit, le diamètre du vaisseau et calculer la contrainte de cisaillement exercée sur les cellules endothéliales du vaisseau (c’est-à-dire que la contrainte de cisaillement, quant à elle, est la force de frottement imposée aux cellules endothéliales par le sang en mouvement). Pour les embryons de 2 à 5 dpf, la vitesse moyenne des globules rouges (GR) est d’environ 300 à 750 μm/s²⁹. Pour mesurer les vitesses des globules rouges :
   1. Au microscope, zoomez sur la queue de l’animal à un grossissement de 100x. Le mouvement des globules rouges devrait être visible à ce grossissement (figures 5A, B).
   2. Démarrez l’enregistrement pendant environ 8 s. Assurez-vous que l’aorte dorsale (DA) et la veine cardinale postérieure (PCV), les deux artères axiales les plus importantes, sont à 100-120 fps à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie. Suivez des cellules individuelles à partir de trames séquentielles (Figure 5A, B).
   3. Extrayez plusieurs images à l’aide d’ImageJ ou d’un autre logiciel d’analyse d’images similaire.
   4. Calculez la différence de distance parcourue par un globule rouge (Δx).
   5. Déterminez la différence de temps entre les images consécutives (Δt).
   6. Utilisez la formule suivante pour la vélocité RBC^22,27 :
      Vitesse des globules rouges (μm/s)
      REMARQUE : La vitesse maximale et moyenne peut être extraite de la répétition d’images consécutives pour des cellules individuelles²¹. La vitesse des globules rouges représente également la vitesse du flux sanguin. Alternativement, une variété d’applications logicielles disponibles dans le commerce peuvent être utilisées pour mesurer automatiquement la vitesse des globules rouges. ViewPoint²⁴, ainsi que DanioVision²⁵, ont de telles applications (Figure 5C). De plus, il existe peu de plugins disponibles avec ImageJ, tels que TrackMate³⁰ et MTrackJ³¹, compatibles avec les vidéos enregistrées au-dessus de 100 fps.
9. Calcul de la contrainte de cisaillement à partir des vitesses cellulaires mesurées
   Les vitesses mesurées des globules rouges dans les vaisseaux sanguins représentent également les vitesses de flux sanguin (figure 5C). À partir de ces mesures, calculez la contrainte de cisaillement τ dans un récipient d’intérêt comme suit avec l’hypothèse d’écoulement de Poiseuille^22,27 :
   
   Où V est la vitesse moyenne du sang (μm/s), μ est la viscosité du sang (dynes/cm²) et D est le diamètre du vaisseau (μm). Pour les embryons de 3 dpf, la contrainte de cisaillement en DA 22,26,27 est d’environ 4 dynes/cm 2.

Résultats

Le graphique de la figure 6 illustre le pourcentage moyen d’embryons survivant à 24, 48 et 72 hpf pour les embryons MO spécifiques de HAND2 et les embryons témoins injectés de MO brouillés. Les embryons injectés de MO dans des doses de 1 mM (8 ng/μL) et de 0,8 mM (6,4 ng/μL) ont montré une réduction significative du pourcentage de survie par rapport aux embryons témoins brouillés injectés de MO. Cela a été observé à chaque point temporel mesuré où une létalité ou une malformation a été obser...

Discussion

La technologie Morpholino (MO) a été largement utilisée chez les poissons-zèbres, les xénopes, les oursins et, plus récemment, dans les systèmes de culture cellulaire. Avec la plupart des méthodes, en plus des avantages, il y a aussi des pièges dont l’expérimentateur doit être conscient. L’un des principaux pièges de la technologie MO est l’inquiétude que les effets phénotypiques observés par l’approche d’inactivation du gène médiée par MO ne sont pas dus à la perte de fonction associée ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrylamide 40 %	Sigma	Sigma, réf. C977M88
Agarose	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich n° de catalogue A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen n° de catalogue 80204.
alpha Tubuline	Abcam	Abcam- ab4074	Lapin polyclonal à alpha Tubuline lot GR3 180877-1 (50 kDa)
Persulfate d’ammonium grade moléculaire	Sigma	Sigma, cat. no C991U65
BV10 chanfreineuse capillaire	Sutter Instruments Produit	Sutter Instruments Catalogue de produits # BV10
Chimiluminescence Imagerie Gnome	SYNGENE	SYNGENE
Cleaver Scientific Blot	CVS10D_OmniPAGEMini	CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no C861C44
Kit d’électrochimiluminescence (ECL) Abcam	Biochemicals	Abcam Biochemicals cat. no ab65623
Glycine	Sigma	Sigma, cat. no C988U91
Chèvre anti Rabbit	Abcam	Abcam-  ; ab6721	Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (HRP) 2nd anticorps lot GR3179871-1
HAND2	Outils géniques	Fabriqués sur mesure pour HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'Hand2
	Abcam	Abcam- ab10131	Anticorps polyclonaux de lapin Anti-HAND2 lot GR143200-9 (24- 26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Humain étiqueté ORF Clone	OriGene Technologies, Inc	RC224436L3	Vecteur : pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI KIT D’EXTRACTION D’ADN/ARN/protéines	IBI Scientific IBI	Scientific cat. no -r IB47702
Système d’imagerie	iBright iBright	CL1000 Système
Isopropanol	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 278475-2L
Tampon de chargement d’échantillons Laemmli (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 70607
Mercaptoethanol	Sigma	Sigma, cat. no M6250-1L
Spectrophotomètre à microplaques avec l’interface du logiciel Gen5 Data Analysis	Epoch	Microscope Ziess SteREO
	Lumar V12 Microscope	fluorescence Ziess SteREO Lumar V12 Microscope
Huile minérale	Fisher Scientific	Fisher Scientific n° de catalogue 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Kit de transcription	Thermo Fisher	Thermo Fisher N° cat. AM1340	pour la génération d’ARNm
Eau sans nucléase	New England Biolabs	New England Biolabs n° de catalogue B1500L
PC-100 Extracteur de micropipettes	NARISHIGE GROUP Produit	NARISHIGE GROUP Catalogue de produits # PC-100
Rouge phénolique	Sigma	Sigma, réf. P-0290
Injecteur de picolitre	Appareil Harvard Catalogue	appareils Harvard # PLI-90A
Pierce Dosage de l’acide bicchoninique (BCA) Kit de dosage des protéines	Thermo Fisher	Thermo Fisher réf. 23227
PMSF, Inhibiteur de protéase comme inhibiteurs de protéase	Thermo Fisher	N° de cat. 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich n° de catalogue 10165921001
Inhibiteur de protéase Cocktail	Thermo Fisher	Thermo Fisher n° de catalogue 88668
Échelle protéique	SMOBiO	SMOBiO cat. no PM2500
Test de radio-immunoprécipitation (RIPA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 89900
Ringer' s solution	Thermofisher	N° de catalogue S25513
SDS	Sigma	Sigma, cat. no 436143
Standard Control	Gene tools	SKU : PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- qui cible une mutation de l’intron de bêta-globine humaine
Tampon de stripping	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. 21059
Temed	IBI scientific	IBI scientific cat. no C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no BP-152-500
Tween	sigma life science	sigma life science cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Chambre système de chenilles avec le logiciel EthoVision XT 11.5	Noldus Information Technology, NL	Noldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5s	Zeiss	Stemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-C	Zeiss	Stemi 2000-C