Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle fenêtre d’imagerie mammaire avec un couvercle remplaçable (R.MIW). La microscopie intravitale après implantation du R.MIW permet une imagerie longitudinale et multi-jours de la glande mammaire saine et malade avec une résolution cellulaire au cours des différents stades de développement.

Résumé

La structure ramifiée de la glande mammaire est très dynamique et subit plusieurs phases de croissance et de remodelage après la naissance. La microscopie intravitale en combinaison avec la chirurgie des lambeaux de peau ou l’implantation de fenêtres d’imagerie a été utilisée pour étudier la dynamique de la glande mammaire saine à différents stades de développement. La plupart des technologies d’imagerie mammaire sont limitées à une période de quelques heures à plusieurs jours, alors que la majorité des processus de remodelage de la glande mammaire se produisent dans des périodes de jours à des semaines. Pour étudier le remodelage de la glande mammaire, des méthodes permettant un accès optique au tissu d’intérêt pendant de longues périodes sont nécessaires. Ici, une version améliorée de la fenêtre d’imagerie mammaire en titane avec un couvercle remplaçable (R.MIW) est décrite qui permet une imagerie haute résolution de la glande mammaire avec une résolution cellulaire jusqu’à plusieurs semaines. Il est important de noter que le R.MIW fournit un accès aux tissus pendant toute la durée de l’expérience d’imagerie intravitale et pourrait donc être utilisé pour la manipulation tissulaire locale, le marquage, l’administration de médicaments ou la microdissection guidée par image. Pris ensemble, le R.MIW permet une caractérisation à haute résolution de la dynamique cellulaire pendant le développement de la glande mammaire, l’homéostasie et la maladie.

Introduction

L’épithélium mammaire est un organe sécrétoire unique présent chez les mammifères, qui produit et sécrète du lait pour nourrir la progéniture. Tout au long de la vie, la glande mammaire subit plusieurs cycles de développement et de croissance, qui s’accompagnent de changements structurels et fonctionnels du tissu¹. Selon le stade de développement, les types de cellules contribuant au remodelage des tissus sont différents, ainsi que l’emplacement dans l’arbre canalaire.

La microscopie intravitale multiphotonique (MIV) permet d’étudier la dynamique des cellules mammaires in vivo dans le cadre natif et peu perturbé ^2,3,4. Pour obtenir un accès visuel à la glande mammaire, plusieurs techniques temporaires d’imagerie ex vivo ou des lambeaux de peau ont été publiées à différents stades du développement de la glande mammaire, notamment la puberté ^4,5,6,7, l’âge adulte ^2,8, la lactation ^9,10,11,12 et la dynamique tumorale ^{13,14 ,15}. Bien que ces techniques entraînent une imagerie à résolution spatiale et temporelle élevée de la dynamique des cellules mammaires, le délai est limité à quelques heures alors que la plupart des processus de remodelage des glandes mammaires prennent des jours ou des semaines. Par conséquent, des méthodes permettant un accès optique au tissu d’intérêt pendant de longues périodes sont nécessaires. Au fil des ans, plusieurs fenêtres d’imagerie permanentes ont été développées pour l’imagerie des tumeurs ^{mammaires 15,16,17,18}, y compris une fenêtre d’imagerie mammaire en titane (MIW)^2,3,19. Bien que très utile pour étudier la croissance tumorale mammaire, la visualisation de la structure saine de la glande mammaire est restée limitée à quelques jours. Récemment, une fenêtre d’imagerie en silicium flexible a été développée, qui permet de visualiser la glande mammaire pubertaire sur plusieurs semaines²⁰. Cependant, la glande mammaire est intégrée dans un coussinet adipeux riche en adipocytaires, ce qui entraîne une diffusion étendue de la lumière et, par conséquent, une visibilité limitée des structures canalaires mammaires. Par conséquent, des conditions d’imagerie supérieures sont nécessaires à tout moment pour visualiser la dynamique des tissus sur des périodes prolongées dans la glande mammaire. Ni le MIW classique, ni la fenêtre en silicium flexible ne permettent la manipulation tissulaire ou l’optimisation de l’emplacement physique des tissus avant l’imagerie, car la fenêtre forme un système fermé après la chirurgie et l’implantation. En conséquence, un accès optique optimal au tissu mammaire sous-jacent est susceptible d’être exclu sur de plus longues périodes. En revanche, la technique du lambeau de peau permet d’optimiser et de repositionner le tissu pendant la séance d’imagerie et un lambeau de peau peut être répété plusieurs fois². Cependant, des séances d’imagerie répétées à travers un lambeau de peau ne sont possibles que lorsque suffisamment de temps (au moins 7 jours) est alloué entre les chirurgies pour permettre la récupération de la peau et est donc principalement adapté à l’étude des processus à des échelles de temps plus longues. De plus, il est conseillé de ne pas effectuer cette procédure plusieurs fois en raison de sa nature invasive et de son grand risque d’infections et de cicatrices lors de la fermeture de la plaie.

Pour surmonter ces limitations, c’est-à-dire pour assurer des conditions d’imagerie optimales pendant une période prolongée à haute fréquence et en même temps permettre la manipulation des tissus, une version améliorée en titane du MIW avec un couvercle remplaçable (R.MIW) a été conçue pour visualiser la glande mammaire saine et malade sur plusieurs jours à plusieurs semaines² (Figure 1A, B). Le R.MIW a été conçu sur mesure pour fournir un accès optimal aux tissus, permettant une manipulation directe des tissus pendant toute la durée de l’expérience IVM, et permet ainsi la visualisation de la glande mammaire au bon moment et au bon endroit sur de longues périodes de temps. Lorsqu’il est fermé, le R.MIW forme un système étanche à l’air comparable au MIW classique (Figure 1C). Lorsqu’il est ouvert dans des conditions aseptiques, le R.MIW permet une manipulation tissulaire locale pour améliorer l’accès optique et permet également l’administration locale de substances, telles que des inhibiteurs de voie ou des agonistes, l’injection de différents types de cellules d’intérêt, telles que des populations de cellules cancéreuses ou immunitaires, ou l’ajout de colorants de marquage tissulaire. Le couvercle peut être ouvert à tout moment entre les séances d’imagerie sans endommager le tissu sous-jacent.

Figure 1: Conception de la fenêtre d’imagerie mammaire avec un couvercle remplaçable. (A) Vue de dessus et vue latérale du couvercle remplaçable de la fenêtre d’imagerie mammaire avec un verre de couverture de 10 mm collé à l’anneau. (B) Vue de dessus et vue latérale de la fenêtre d’imagerie mammaire, qui se compose d’un anneau extérieur et d’un anneau intérieur avec une rainure entre les deux pour fixer la fenêtre dans la peau de la souris à l’aide d’une suture de cordon de la bourse. L’anneau extérieur a une petite rainure qui s’adapte aux quatre projections (bras) du couvercle. (C) Dessin animé et images démontrant les mécanismes d’ouverture et de fermeture du couvercle. Les projections inclinées permettent de s’assurer que le couvercle est fixé à l’intérieur du cadre de la fenêtre. Cette figure a été modifiée à partir de Messal et al. ². Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Ce protocole décrit la procédure de conception et d’implantation du R.MIW, ainsi qu’une stratégie longitudinale de MIV pour revoir les mêmes canaux mammaires et leur visualisation à une résolution cellulaire. Le R.MIW permet de suivre les divisions cellulaires et les changements morphologiques au cours des différentes phases de développement de la glande mammaire dans divers modèles murins rapporteurs fluorescents. Pris ensemble, le R.MIW facilite la caractérisation à haute résolution de la dynamique cellulaire pendant le développement de la glande mammaire, l’homéostasie et la maladie.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce document ont été effectuées conformément aux directives de l’IACUC et de la KU Leuven et ont été effectuées dans le cadre de la demande de projet approuvée P160/2020. Avant d’exécuter ce protocole, veuillez examiner la stratégie d’analgésie avec le vétérinaire de l’établissement et administrer l’analgésie préopératoire et postopératoire conformément aux directives de l’établissement.

1. Préparation du R.MIW (délai estimé : 2 h)

REMARQUE: Pour la construction du R.MIW, il est conseillé de trouver un fabricant local spécialisé dans le travail avec des matériaux durs tels que le titane, car cela nécessite des outils et une expertise spéciaux. Les ateliers spécialisés dans la conception et la fabrication de prothèses en titane disposent généralement de la machinerie et de l’expertise nécessaires pour produire les pièces R.MIW.

1. Placez le couvercle du R.MIW sur une surface stérile avec l’extérieur du couvercle orienté vers le haut (et les bras du couvercle inclinés vers le bas; Figure 1A).
2. Appliquez de la colle adhésive cyanoacrylate sur tout le bord du couvercle et placez soigneusement un couvercle en verre rond de 10 mm sur le dessus du couvercle.
   REMARQUE: Préparez toujours un couvercle de rechange avec un couvercle en verre comme sauvegarde pendant l’intervention chirurgicale.
3. Utilisez un bâton en bois stérile pour positionner le couvercle en verre et appliquez une certaine force pour le pousser vers le bas afin d’assurer une étanchéité à l’air entre le couvercle en verre et le cadre du couvercle. Assurez-vous que les trous dans les bras du couvercle ne sont pas recouverts par le verre.
4. Désinfectez les couvercles et le R.MIW en les immergeant dans de l’éthanol à 80% pendant au moins 30 min dans une boîte de Pétri fermée.
   REMARQUE: Ne laissez pas les couvercles plus de 1 h dans de l’éthanol à 80% pour éviter la dissolution de la colle adhésive cyanoacrylate.
5. Retirez l’excès de colle adhésive cyanoacrylate du couvercle en verre à l’aide d’une pointe en coton imbibée d’acétone.
6. Conservez les couvercles et le R.MIW dans un environnement stérile jusqu’à une utilisation ultérieure.
   REMARQUE: Le cadre et les couvercles R.MIW peuvent être conservés dans un tube ou un sac stérile pendant un maximum de 1 semaine. Lors de la reprise de l’expérience, vérifiez toujours si le couvercle en verre est toujours correctement fixé au couvercle avant de poursuivre le protocole.

2. Préparation à la chirurgie (durée estimée : 15 min)

REMARQUE: Pour la procédure d’implantation R.MIW, des souris femelles (âgées de >3,5 semaines) de n’importe quelle souche peuvent être utilisées.

1. Maintenez la stérilité en utilisant des gants stériles et stérilisez tous les articles qui entreront en contact avec la souris. Lavez les outils chirurgicaux avec de l’eau et du savon doux, séchez-les à l’air, enveloppez-les dans du papier d’aluminium sans coins ou bords exposés et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave pendant un cycle de 20 minutes à 120 ° C avant la chirurgie.
2. Préparez une plate-forme chirurgicale stérile et stérilisez les surfaces avec 80% d’éthanol.
   REMARQUE: Pour assurer la stérilité, la chirurgie peut être effectuée dans une armoire de flux.
3. Allumez le coussin chauffant et couvrez le tapis avec un drap stérile. Disposez les instruments stériles sur le drap stérile et placez le R.MIW et au moins deux couvercles recouverts de verre dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri (fermez le couvercle pour éviter toute contamination externe).
4. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction à l’aide d’un mélange isoflurane/_{O2 à} 3 %. Assurez-vous que l’animal est suffisamment détendu pour être facilement manipulé et transféré au masque nasal sans aucune lutte.
5. Transférer la souris de la chambre d’induction à un masque nasal d’anesthésie et réduire le niveau d’isoflurane à 1,5% - 2% d’isoflurane / O₂ mélange. Vérifiez l’anesthésie complète en effectuant un test de retrait de la patte.
6. Pour effectuer le test de retrait de la patte, pincez fermement la patte de l’animal à l’aide d’ongles ou de pinces émoussées. En l’absence de tout réflexe musculaire, considérez l’animal comme inconscient et procédez à une préparation chirurgicale. Effectuez ce test avant la manipulation de l’animal et répétez régulièrement pendant les procédures anesthésiques et chirurgicales pour confirmer l’anesthésie.
7. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la déshydratation de la cornée.
8. Raser la zone autour de la 4^e glande mammaire à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 2A). Utilisez le 4^ème mamelon comme point de repère. Enlevez les poils lâches à l’aide de ruban adhésif.
   REMARQUE: Alternativement, la crème dépilatoire peut être utilisée pour enlever les poils.
9. Désinfectez la peau exposée avec de l’éthanol à 80% ou de la povidone-iode et placez la souris dans la zone chirurgicale stérile sur le dos avec le museau dans un masque nasal d’anesthésie en utilisant un mélange d’isoflurane / O_{2 à} 1,5%.
10. Fixez les membres avant et postérieurs de la souris à l’aide de ruban adhésif en papier.
    REMARQUE: Laissez la souris anesthésiée et récupératrice sur le coussin chauffant autant que possible, pendant et après la chirurgie.
11. Utilisez un drap chirurgical stérile prédécoupé ou de la gaze pour couvrir la souris tout en laissant la zone chirurgicale exposée.

3. Implantation de R.MIW (durée estimée : 30 min)

1. Vérifiez si l’animal est adéquatement anesthésié en effectuant un test de retrait des pattes. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une pince Graefe fine et faites une incision de 10 à 15 mm de diagonale à l’aide de petits ciseaux à ressort dans la peau sur le dessus du 4^ème coussinet graisseux mammaire en utilisant le 4^ème mamelon comme point d’orientation (Figure 2A). Assurez-vous de ne pas couper ou endommager le péritoine ou la glande mammaire.
2. Définissez la région d’intérêt (ROI) en fonction des caractéristiques macroscopiques du tissu mammaire, y compris l’emplacement du ganglion lymphatique ou d’une lésion tumorale, et essayez de garder le ROI central en ce qui concerne l’incision.
3. Séparez la peau du coussinet adipeux mammaire et des couches tissulaires sous-jacentes à l’aide d’une dissection émoussée allant jusqu’à 5-8 mm tout autour de la ligne d’incision pour créer une poche adaptée au cadre R.MIW (Figure 2BI).
4. Prenez le R.MIW à l’aide de pinces stériles et vérifiez si l’incision est assez grande pour insérer la fenêtre. Si nécessaire, agrandissez légèrement l’incision jusqu’à ce que le R.MIW s’insère.
5. Retirez le R.MIW et placez une suture de cordon de bourse tout autour de l’incision à l’aide d’une suture en soie 5-0 (tressée, non résorbable). Placez la suture à 1-2 mm du bord de l’incision de l’extérieur vers l’intérieur de la peau, en commençant par l’extrémité caudale de l’incision.
6. Déplacez-vous d’environ 5 mm le long de l’incision et passez le fil de suture à travers la peau de l’intérieur vers l’extérieur. Répétez cette procédure le long du bord de l’incision, créant ainsi une suture circulaire composée de 5 à 6 boucles (Figure 2BII). La sortie finale du fil de suture doit être située à environ 2-5 mm de la première entrée.
   REMARQUE: Veillez à ne pas placer la suture trop près du bord de l’incision, car cela augmente le risque de déchirure de la peau. Placer la suture trop loin du bord de l’incision augmente le risque d’infection entre l’excès de peau et le sillon du R.MIW.
7. Insérez le R.MIW à l’intérieur de l’incision et utilisez les pinces Graefe pour placer soigneusement la peau dans la rainure du R.MIW. Assurez-vous de laisser les boucles de la suture à l’extérieur.
8. Tirez sur les boucles de la suture du cordon de la bourse et resserrez la suture dans la rainure du R.MIW en tirant doucement sur les deux extrémités de la suture (Figure 2BIII). Attachez-vous avec des nœuds chirurgicaux et coupez l’excès de fil.
9. Appliquez de la vaseline sur le bord intérieur du R.MIW à l’aide d’un cure-dent, tout en vous assurant d’éviter le tissu sous-jacent. Poussez doucement le cadre de la fenêtre vers le bas avec des pinces stériles ou deux doigts, puis placez le couvercle dans le cadre R.MIW (Figure 1B). Cela évitera un volume d’air entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle R.MIW.
10. Placez les extrémités des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et serrez le couvercle en tordant le couvercle dans le sens des aiguilles d’une montre (environ 5°) (Figure 1C et Figure 2BIV).
11. S’il reste un peu d’air après avoir resserré le couvercle du R.MIW, utilisez une aiguille à insuline stérile pour éliminer l’excès d’air. Introduisez l’aiguille à travers la peau dans la cavité entre le tissu mammaire et la paupière et retirez lentement le piston, créant ainsi un vide entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle R.MIW.
12. Administrer, après la chirurgie, une analgésie telle que la buprénorphine (0,1 mg/kg dilué dans du NaCl stérile à 0,9 %) par injection sous-cutanée. Répéter l’injection sous-cutanée de buprénorphine à 8 h et 16 h après la chirurgie.
13. Remettez la souris dans la cage pour récupérer et surveiller de près jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée, ou passez à l’étape 4 pour une imagerie immédiate.
14. À ce stade post-chirurgical, surveillez de près les souris pour détecter tout signe d’inconfort ou de complications en fonction de paramètres vitaux, tels que la respiration, la réactivité, le comportement, la posture et le poids corporel. Surveillez attentivement la peau entourant la fenêtre pour détecter tout signe d’inflammation et de nécrose. Si aucune complication ne se produit, le R.MIW permettra des séances répétées de MIV sur plusieurs semaines après l’implantation.

Figure 2: Aperçu de l’intervention chirurgicale et de l’implantation de la fenêtre. (A) Une incision diagonale est pratiquée près du 4 e mamelon d’une souris femelle et la peau et le tissu sous-jacent sont déconnectés par dissection contondante. (B) Le ganglion lymphatique inguinal et la forme du coussinet adipeux peuvent être utilisés pour la bonne orientation du tissu (I). Une suture de cordon de bourse est placée dans la peau autour de l’incision (II), et après ajustement dans le cadre de la fenêtre, la suture est serrée dans la rainure pour sécuriser le cadre de la fenêtre et sécurisée par des nœuds chirurgicaux (III). La dernière étape est l’insertion et le verrouillage du couvercle dans le cadre de la fenêtre (IV). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Microscopie intravitale répétée à travers le R.MIW

REMARQUE: La stratégie IVM répétée décrite ici a été optimisée pour un système confocal multiphoton inversé équipé d’un étage motorisé et d’une chambre climatique sombre à 35,8 ° C.

1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction à l’aide d’un mélange isoflurane/_{O2 à} 3 %. Vérifiez la perte de conscience en effectuant un test de retrait de la patte (décrit à l’étape 2.6). Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la déshydratation de la cornée pendant la séance d’imagerie.
2. Inspectez l’état du cadre et du couvercle R.MIW, y compris la stabilité des sutures ou tout dommage potentiel au couvercle. En cas d’endommagement du couvercle, le couvercle peut être remplacé comme décrit à l’étape 5.
3. Transférez la souris dans une boîte d’imagerie préchauffée (37 °C) (Figure 3A) et placez la souris avec la tête dans le cône du nez. La boîte d’imagerie se compose d’un cadre qui s’insère dans l’étage automatisé du microscope. Le cadre est conçu pour contenir une incrustation sur mesure avec un trou du diamètre du R.MIW (Figure 3A).
4. Une entrée avec un cône de nez est connectée à l’avant de la boîte et fixée à une station de vaporisateur d’isoflurane en utilisant un mélange isoflurane/_{O2 à 2 % à} 2 %. Une sortie est reliée à une unité de piégeage anesthésique pour assurer la circulation et empêcher l’accumulation d’isoflurane dans la boîte. La boîte d’imagerie peut être fermée à l’aide d’un couvercle transparent.
5. Positionnez la souris sur l’incrustation de manière à ce que le R.MIW tombe dans le trou de l’incrustation de la boîte d’imagerie (Figure 3A). Appliquez un parafilm et du ruban adhésif en papier sur le dos de la souris pour stabiliser la souris et réduire le mouvement des tissus dû à la respiration.
6. Fermez la boîte d’imagerie avec le couvercle et insérez la boîte d’imagerie dans la scène du microscope.
7. Réduire progressivement la dose d’isoflurane au cours de la séance d’imagerie pour maintenir une anesthésie stable mais superficielle (généralement entre 1,5% et 0,8% d’isoflurane / O₂ mélange).
8. Fournir une nutrition adéquate pendant l’imagerie comme décrit ci-dessous.
   1. Pour les séances d’imagerie <3 h, injecter à la souris par voie sous-cutanée 200-300 μL de PBS stérile pour l’hydratation.
   2. Pour les séances d’imagerie >3 h, suivez les étapes décrites ci-dessous.
      1. Pour l’imagerie à long terme, infuser la souris avec des nutriments. Pour cela, utilisez un mélange d’infusion stérile disponible dans le commerce contenant des acides aminés et du glucose. Placez une aiguille flexible par voie sous-cutanée dans le cou de la souris et fixez-la avec du ruban adhésif en papier.
      2. Fixez une seringue de 10 ml avec le mélange de nutriments préparé à un tube de silicium flexible et poussez le mélange de nutriments jusqu’à ce qu’il ait atteint l’extrémité du tube.
      3. Connectez le tube de silicone à l’aiguille flexible. Prenez l’extrémité du tube et placez-le à travers l’un des trous de la boîte d’imagerie (de l’intérieur vers l’extérieur, en laissant le côté de fixation de l’aiguille dans la boîte).
      4. Injecter 50 μL de solution d’infusion toutes les 30 minutes.
9. Fixez la boîte d’imagerie dans la scène du microscope et définissez la zone d’intérêt en utilisant le mode d’épifluorescence du microscope.
10. Appliquez les paramètres de microscope souhaités en fonction du modèle de souris (Figure 3B). Les structures des vaisseaux, les modèles de collagène (visualisés par la deuxième génération harmonique) et d’autres structures anatomiques stables, y compris le ganglion lymphatique inguinal, peuvent être utilisés comme points de repère. Obtenez des images à l’aide d’un microscope confocal multiphoton inversé à une profondeur de 12 bits et d’un objectif d’eau 25x utilisant une taille de pas Z allant de 1,0 à 4,0 μm (pile z totale allant de 150 à 800 μm). Appliquez les paramètres standard suivants : format 1024 x 1024, vitesse de numérisation de 600 Hz, mode bidirectionnel.
11. Visualisez les fibres de collagène I en effectuant une deuxième génération harmonique en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 860 nm et une détection à 425-435 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et de détection des différents fluorophores sont indiquées dans le tableau 1.

Tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

12. Utilisez la fonction Spirale en mode navigateur du logiciel d’imagerie pour générer un grand aperçu de tilescan afin de créer une carte de référence du tissu (Figure 3B). Définissez les retours sur investissement dans la vue d’ensemble en spirale, définissez les plans Z supérieur et inférieur pour déterminer la pile Z. Appuyez sur Démarrer pour obtenir des piles Z tridimensionnelles (xyz) ou quadridimensionnelles (xyzt) détaillées du tissu.
    REMARQUE: Pendant toute l’expérience d’imagerie, la souris doit être étroitement surveillée. Pour les longues séances d’imagerie, un oxymètre de pouls et une sonde de température sont recommandés. La respiration de la souris doit être régulière et au même rythme. Si la souris commence à montrer des signes de halètement, la quantité d’isoflurane doit être réduite.
13. À la fin de chaque séance d’imagerie, gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée. Si la souris montre des signes d’inconfort ou de mobilité réduite, gardez la cage plus longtemps sur le coussin chauffant et fournissez des gels nutritifs au lieu du chow régulier.
    REMARQUE: Entre les séances d’imagerie, la souris doit être étroitement surveillée pour détecter des signes d’inconfort tels qu’une diminution de la consommation de nourriture et d’eau, une respiration rapide, une diminution des mouvements, des tremblements, une posture corporelle anormale ou une fourrure non entretenue. En cas de signes évidents d’inconfort, suivez les directives institutionnelles concernant le bien-être des animaux et mettez fin à l’expérience lorsque le critère d’évaluation sans cruauté est atteint.
14. Répétez les étapes 4.1 à 4.12 pour chaque session d’imagerie répétée et utilisez le tilescan de vue d’ensemble pour retracer la ou les mêmes positions sur plusieurs points temporels (Figure 3B). La fréquence d’imagerie dépendra de la question de recherche et du moment du processus étudié, et varie généralement de séances d’imagerie deux fois par jour à une fois par semaine.
15. À la fin de la période expérimentale souhaitée, euthanasier les animaux avec un R.MIW implanté en utilisant une anesthésie profonde à l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Si vous le souhaitez, disséquez les organes d’intérêt pour d’autres analyses ex vivo .
16. Alternativement, gardez l’animal en vie pour de futures analyses in vivo . Dans ce cas, retirez la suture de la poche qui maintient le R.MIW en la coupant avec des ciseaux à ressort et détachez soigneusement l’anneau de fenêtre de la peau de la souris à l’aide de pinces émoussées. Nettoyez les bords de la peau qui tenait auparavant la fenêtre et procédez à une simple suture continue (matériau résorbable, tel que l’acide polyglycolique).
17. Une fois la peau fermée, attachez les fils de suture de début et de fin avec deux nœuds carrés (4 lancers). Pour minimiser l’ischémie tissulaire, les nœuds doivent être suffisamment lâches pour permettre la circulation sanguine au bord de la peau. Désinfectez la plaie avec de la povidone-iode pour prévenir l’inflammation et favoriser la cicatrisation de la peau.

Figure 3 : Flux de travail IVM longitudinal. (A) Représentation schématique d’une expérience IVM typique de plusieurs jours. (B) Imagerie d’une région tumorigène dans la glande mammaire adulte. Avant chaque séance d’imagerie, un tilescan de vue d’ensemble à basse résolution (panneau supérieur) peut faciliter l’identification de la ou des régions d’intérêt au cours des jours d’imagerie suivants. Le motif de collagène I (deuxième génération harmonique, magenta), la structure tissulaire et les motifs de cellules marquées différentiellement avec des protéines fluorescentes (représentés en vert, jaune et rouge) peuvent être utilisés pour retracer la même zone tissulaire. Les barres d’échelle représentent 1 mm (vue d’ensemble tilescan) et 100 μm (panneaux inférieurs). (C) Représentation schématique de la construction du rapporteur R26-Confetti. Lors de la recombinaison de la créo-induisant le tamoxifène, les confettis construisent des recombinaisons stochastiques, ce qui entraîne l’expression de l’un des quatre fluorophores (nGFP, YFP, RFP ou mCFP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Ouverture et fermeture du couvercle du R.MIW entre les séances d’imagerie

1. Maintenez la stérilité en utilisant des gants stériles et stérilisez tous les articles qui entreront en contact avec la souris. Outils chirurgicaux autoclaves avant la chirurgie (voir l’étape 2 pour plus de détails).
2. Allumez le coussin chauffant et couvrez le tapis avec un drap stérile et anesthésiez la souris dans une chambre à induction en utilisant un mélange isoflurane/_O2 à 3%. Vérifiez une anesthésie adéquate en effectuant un test réflexe de retrait de la patte.
3. Transférer la souris de la chambre d’induction à un masque nasal d’anesthésie et réduire le niveau d’isoflurane à 1,5%-2% d’isoflurane / O₂ mélange.
4. Placez les pointes des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et desserrez le couvercle en tordant le couvercle dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Si nécessaire, appliquez du PBS stérile préchauffé (37 °C) sur la fenêtre pour faciliter le desserrage du couvercle.
5. Placez le couvercle du R.MIW dans un plat stérile avec du PBS stérile jusqu’à une utilisation ultérieure. Nettoyez le verre de couverture du couvercle avec de la demi-eau et ensuite de l’éthanol à 80%. Gardez le couvercle dans du PBS stérile jusqu’à nouvel emploi.
6. Empêchez les tissus exposés de se dessécher en ajoutant quelques gouttes de PBS stérile à la surface des tissus.
7. Appliquer ou injecter toute substance ou cellules d’intérêt sur le tissu exposé, un volume maximum de 50 μL peut être utilisé. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que le liquide soit absorbé par le tissu. Alternativement, le tissu peut être manipulé ou repositionné à l’aide de pinces stériles et contondantes pour optimiser les conditions d’imagerie pour des retours sur investissement spécifiques.
8. Appliquez de la vaseline sur le bord intérieur du R.MIW, en veillant à éviter le tissu sous-jacent. Placez le couvercle dans le cadre R.MIW comme décrit à l’étape 3.9, placez les extrémités des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et serrez le couvercle en le tordant dans le sens des aiguilles d’une montre (environ 5 °).

Résultats

Pour étudier la dynamique proliférative des cellules épithéliales mammaires au cours des différents stades de développement de la glande mammaire, le protocole décrit a été effectué. La conception du R.MIW est illustrée à la figure 1, et la procédure d’implantation d’un R.MIW est résumée à la figure 2. Le R.MIW est implanté chirurgicalement entre la glande mammaire et la peau. Une suture est utilisée pour maintenir à l’intérieur de l’anneau de fenêtre et empêcher les souris de tirer sur les sutures (Figure 2). Les sutures qui maintiennent le R.MIW sont faites de soie non résorbable, qui a des propriétés hypoallergéniques, une texture douce et est facile à manipuler. L’anneau R.MIW est en titane, l’un des matériaux les plus biocompatibles qui ne favorisent pas l’inflammation ou la nécrose après l’implantation²¹. Si les conditions aseptiques sont suivies et que les sutures sont bien exécutées, l’implantation de la glande mammaire R.MIW présente un faible risque de complications postopératoires. De plus, contrairement à l’implantation de fenêtre d’imagerie abdominale²², l’implantation de R.MIW n’est pas un facteur limitant pour la survie de la souris car la glande mammaire n’est pas un organe vital et permet une imagerie quotidienne jusqu’à la limite spécifiée dans le protocole éthique. Le seul facteur qui limite la durée de l’implantation de la fenêtre est le renouvellement homéostatique de la peau, qui finira par entraîner la chute des sutures après 4 à 6 semaines. Par conséquent, il est important d’inspecter régulièrement la stabilité des sutures. Si vous le souhaitez, les sutures peuvent être retirées et remplacées par une nouvelle suture de cordon de bourse dans des conditions aseptiques (comme décrit aux étapes 3.5 à 3.8) pour rassurer la stabilité de la fenêtre.

Un défi majeur lors de l’utilisation de l’approche d’imagerie multijournalière consiste à retracer un retour sur investissement sur des jours consécutifs. À cette fin, une analyse rapide de la vue d’ensemble peut être incluse avant de sélectionner le(s) retour(s) sur investissement (Figure 3B). Plusieurs repères tissulaires peuvent être utilisés pour retracer la même région du tissu, y compris le signal du réseau de collagène (visualisé par la deuxième génération harmonique), la structure tissulaire, ainsi que les modèles locaux de cellules marquées différentiellement ou stochastiquement avec des colorants ou des protéines fluorescentes (Figure 3B). Dans cet exemple représentatif, un R.MIW a été implanté sur la 4ème glande mammaire d’un MMTV-PyMT; R26-CreERT2^het; R26-Confetti^het souris femelle au début de la formation de tumeurs palpables. Par la suite, une recombinaison stochastique a été induite par injection de 1,5 mg de tamoxifène, entraînant une recombinaison de la construction confetti dans certaines cellules (Figure 3C). Les cellules tumorales recombinées ont été suivies pendant une période de 20 jours (Figure 3B,C). Si l’imagerie de la même région de la glande mammaire sur des jours consécutifs est exclue, la fenêtre peut être ouverte dans un environnement aseptique (comme décrit à l’étape 5.1) pour éclaircir davantage et repositionner le tissu pour améliorer la visibilité et l’acquisition d’images (Figure 3A).

En utilisant cette méthode, la glande mammaire en développement pendant la puberté a été suivie au niveau unicellulaire. Une IVM répétée à travers un R.MIW a été réalisée à l’aide de R26-CreERT2^het; R26-mTmG^het souris femelles âgées de 4 à 6 semaines, chez lesquelles toutes les cellules sont marquées avec une membrane tdTomato (Figure 4A)²³. Des souris ont reçu une faible dose de tamoxifène (0,2 mg/25 g de poids corporel), ce qui a entraîné une recombinaison sporadique de la construction mTmG, provoquant un passage du rouge au vert dans certaines cellules de tous les tissus, y compris la glande mammaire (figure 4B). Les mêmes ROI ont été revus sur plusieurs jours pour visualiser les changements morphologiques dans la glande mammaire, y compris l’allongement canalaire et la ramification canalaire (Figure 4C) à une résolution cellulaire. Il est important de noter que cette combinaison de marquage cellulaire stochastique et de MIV de plusieurs jours permet également de visualiser les changements dynamiques de l’environnement canalaire, tels que la dynamique des cellules individuelles dans le stroma entourant les canaux allongés et ramifiés (Figure 4D) ainsi que la dynamique cellulaire au sein du ganglion lymphatique inguinal (Figure 4E).

Figure 4 : IVM de plusieurs jours de morphogenèse ramifiée pubertaire. (A) Pubertal R26-CreERT2; Des souris R26-mTmG âgées de 4 à 6 semaines ont reçu une faible dose de tamoxifène entraînant une recombinaison médiée par cre de l’allèle R26-mTmG et ont été photographiées aux jours 1, 3 et 5 pour suivre les changements dynamiques dans le développement de la glande mammaire. (B) Représentation schématique de la construction de la souris R26-mTmG qui, dans des conditions non recombinées, entraîne l’expression omniprésente de la membrane tdTomato (mT). Lors de la recombinaison médiée par Cre, mT est commuté pour l’expression membranaire eGFP (mG). (C) rendu 3D d’un conduit mammaire allongé et ramifié sur plusieurs jours imagé à travers un R.MIW dans un R26-CreERT2; R26-mTmG souris femelle à l’âge de 6 semaines. (D) Images uniques du plan Z de la pointe ramifiée (panneaux supérieurs) et de la branche allongée (panneaux inférieurs). mT est représenté en rouge, et mG en cyan, les barres d’échelle représentent 100 μm (A et B). Les cellules individuelles du stroma sont mises en évidence par des astérisques blancs. Notez que l’intensité du signal a été augmentée manuellement pour mettre en évidence les cellules individuelles dans le stroma, ce qui a conduit à une apparence légèrement surexposée des cellules épithéliales mammaires. (E) Images représentatives du ganglion lymphatique inguinal d’un R26-CreERT2; Souris femelle R26-mTmG imagée via un R.MIW, montrant un balayage de tuiles de vue d’ensemble (panneau de gauche), des images de zoom (panneaux de droite) d’un seul plan Z (en haut) et un rendu 3D (en bas). La deuxième génération harmonique (collagène I) est représentée en vert, mT en rouge et mG en cyan. Les barres d’échelle représentent 500 μm (vue d’ensemble tilescan) et 100 μm (zoom des images). Les panneaux de figure C et D sont modifiés à partir de Messal et al. ². Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

De même, dans la glande mammaire adulte, l’approche R.MIW proposée permet de visualiser les mêmes structures canalaires sur plusieurs jours avec une visibilité sans compromis. Même l’utilisation de modèles rapporteurs fluorescents²⁴ moins brillants, tels que le modèle murin Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), permet de visualiser la stabilité canalaire et les changements morphologiques subtils à une résolution cellulaire (Figure 5). Notez que la visibilité entre le jour 3 et le jour 5 s’est considérablement améliorée après le repositionnement des tissus (Figure 5).

Figure 5 : Imagerie multi-jours de la glande mammaire adulte. Images 3D rendues d’une structure canalaire mammaire d’une souris femelle adulte Cdh1-mCFP (cyan, marquant l’expression des cellules luminales positives à l’écadhérine) sur plusieurs jours consécutifs. Le motif de collagène I (deuxième génération harmonique, magenta) a été utilisé pour retracer le même retour sur investissement, et le signal Cdh1-mCFP a été utilisé pour marquer les cellules canalaires (luminales). Notez que la visibilité après le jour 3 a été améliorée par l’ouverture du couvercle R.MIW et le repositionnement du tissu. Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Pour évaluer l’hétérogénéité proliférative des cellules épithéliales mammaires au cours du cycle hormonal au niveau unicellulaire, le modèle^de souris rapporteur Kikume Green-Red (KikGR) photo-convertible ^25,26 a été utilisé, qui a une expression omniprésente de la protéine KikGR. KikGR est un fluorophore brillant qui subit une conversion vert-rouge lors de l’exposition à la lumière violette et le rapport rouge/vert peut être utilisé comme indicateur de l’activité proliférative d’une cellule² (Figure 6A,B). En utilisant l’approche R.MIW, nous avons suivi les mêmes cellules dans l’arbre canalaire de la glande mammaire adulte pendant plusieurs jours et avons trouvé une hétérogénéité proliférative imprévue dans tout l’arbre canalaire (Figure 6C). Les cellules prolifératives élevées et faibles étaient réparties également sur les différentes zones converties (Figure 6C,D). Fait frappant, au niveau local, les cellules voisines ont montré de grandes différences dans leur rapport rouge/vert (Figure 6C,D). La quantification du rapport rouge/vert de différentes cellules (comme approximation de leur activité proliférative) 10 jours après la photo-conversion, a révélé des taux de dilution très variables de certaines cellules dans le même micro-environnement canalaire (Figure 6E). Ensemble, ces données révèlent une hétérogénéité proliférative locale remarquable au sein de la glande mammaire adulte et, en même temps, un taux de renouvellement uniforme mondial.

Figure 6 : MIV longitudinale de l’hétérogénéité proliférative dans la glande mammaire adulte à l’aide du modèle murin KikGR. (A) Les souris KikGR ont été photographiées au jour 0 avant et après l’exposition à la lumière violette. Les séances d’imagerie ont été répétées les jours 2, 6 et 10 après la conversion. (B) Représentation schématique des résultats hypothétiques lors de la photo-conversion des cellules épithéliales mammaires KikGR après prolifération (panneau de gauche) et absence de prolifération (panneau de droite) en fonction du temps. (C) La même zone de la glande mammaire a été imagée à travers un R.MIW sur une période de 10 jours. Des régions plus petites ont été photo-converties le jour 0 et montrent un taux de dilution similaire du signal rouge kikume au fil du temps, indiquant un taux de renouvellement égal dans tout l’épithélium. (D) Les images zoomées (plans Z simples) des régions indiquées dans le panneau C montrent une hétérogénéité proliférative au niveau cellulaire 6 et 10 jours après la photo-conversion. Les barres d’échelle représentent 100 μm (panneau C) et 10 μm (panneau D). (E) Quantification du rapport rouge/vert des cellules sélectionnées au hasard (n = 48 cellules) dans trois zones photo-converties. Un rapport rouge/vert élevé est révélateur d’un faible taux de dilution et d’une faible activité proliférative, tandis qu’un faible rapport rouge/vert est révélateur d’un taux de dilution et d’une prolifération élevés. Les panneaux de figure C à E ont été modifiés à partir de Messal et al. ². Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le R.MIW permet l’imagerie longitudinale de la glande mammaire saine et malade dans son environnement natif et peu perturbé et permet une visualisation répétée de la glande mammaire à divers stades de développement. La conception R.MIW permet d’ouvrir la fenêtre à tout moment de l’expérience. L’accès visuel à long terme au tissu d’intérêt peut être entravé, par exemple, par l’accumulation de débris cellulaires sur le couvercle. Dans de tels cas, le R.MIW peut être ouvert avant ou immédiatement après une séance d’imagerie pour permettre le nettoyage de toute la zone tissulaire visible et de la paupière. Le couvercle amovible permet également des manipulations du tissu ainsi que l’application locale de substances, telles que des inhibiteurs et des thérapies spécifiques, des colorants de marquage ou des types de cellules spécifiques d’intérêt.

Cette méthode surmonte la limitation des procédures mammaires décrites précédemment ^4,7,8,13, qui sont limitées à une séance d’imagerie, et peut visualiser des processus tels que la morphogenèse ramifiée (Figure 5), le renouvellement tissulaire homéostatique (Figure 6) ou la croissance tumorale au niveau cellulaire (Figure 3B ). Pourtant, dans le même temps, le R.MIW permet la manipulation locale du tissu entre les sessions d’imagerie, ce qui constitue un grand atout du R.MIW par rapport au MIW ^3,18 précédemment publié et à toutes les autres fenêtres d’imagerie^20,22. Lors de l’ouverture du R.MIW, il est important de maintenir des conditions aseptiques en tout temps pour prévenir toute source d’infection. La possibilité d’ouvrir le R.MIW dans un environnement aseptique permet d’optimiser les conditions d’imagerie avant chaque séance d’imagerie, ce qui améliore considérablement l’accès visuel à long terme au tissu d’intérêt. Plus précisément, dans la glande mammaire, qui est intégrée dans un stroma riche en adipocytaires, cela est d’une grande valeur. De plus, le couvercle remplaçable pourrait permettre de manière unique l’administration locale de produits thérapeutiques, de différents types de cellules, de colorants de marquage, de microdissection guidée par image ou de toute autre manipulation locale du tissu sans qu’il soit nécessaire de mettre fin à l’expérience IVM. Par exemple, pour étudier l’initiation tumorale, des populations spécifiques de cellules cancéreuses pourraient être injectées directement dans l’arbre canalaire ou le stroma à un point temporel déterminé de la MIV et à un emplacement précis de la glande mammaire, à condition que ce retour sur investissement soit accessible via l’anneau R.MIW. Pour étudier la progression tumorale, des populations spécifiques de cellules cancéreuses (à un endroit spécifique, dans un micro-environnement spécifique ou avec un comportement spécifique) pourraient être photomarquées pendant la session de MIV et ensuite microdisséquées à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente après l’ouverture du R.MIW. Les cellules isolées pourraient être traitées ultérieurement pour des analyses en aval, telles que le séquençage de l’ARNm (unicellulaire). En utilisant cette approche, on pourrait coupler le comportement cellulaire in vivo aux profils d’expression moléculaire. L’avantage de l’administration locale de médicaments permis par le R.MIW permet d’imager le tissu avant et directement après le traitement. L’intervalle nécessaire pour retirer la souris de la boîte d’imagerie et pour ensuite effectuer l’administration locale de médicaments après l’ouverture du couvercle R.MIW peut être effectué en quelques minutes, ce qui permet la capture de phase immédiate des médicaments à action rapide.

Nous montrons que la MIV de la glande mammaire à travers le R.MIW est compatible avec de nombreux modèles de souris rapporteurs fluorescents différents. L’environnement riche en adipeux est difficile à imager et, par conséquent, l’utilisation de fluorophores brillants est recommandée. Cependant, comme indiqué ici, même des fluorophores moins brillants tels que la mCFP peuvent être visualisés via le R.MIW dans des conditions d’imagerie optimales. Inévitablement, le coussinet adipeux empêchera l’imagerie des structures canalaires plus profondes et limitera l’imagerie aux canaux plus superficiels. Une image d’ensemble à basse résolution au début de chaque expérience IVM aidera à identifier les structures canalaires d’intérêt qui sont suffisamment superficielles pour l’imagerie à haute résolution. La manipulation tissulaire locale, l’ablation du tissu conjonctif ou le repositionnement du tissu adipeux après l’ouverture du R.MIW peuvent optimiser la MIV pour des ROI spécifiques qui sont superposés par le tissu adipeux. Il s’agit d’un avantage important par rapport à toutes les conceptions de fenêtres précédentes, qui ne permettent pas d’effectuer ces manipulations et nécessiteraient le retrait complet de la fenêtre elle-même. Plus précisément, pour la visualisation du ganglion lymphatique inguinal, il est recommandé d’enlever doucement le tissu adipeux sus-jacent, ce qui réduit la diffusion de la lumière et permet une imagerie à haute résolution. Lorsque vous manipulez le tissu, conservez toujours des conditions aseptiques et évitez les saignements ou les dommages graves au tissu, car ils peuvent affecter les processus étudiés au cours de l’expérience de MIV.

Le R.MIW est fait de titane, un matériau couramment utilisé dans la pratique clinique pour remplacer les tissus durs tels que les articulations ou les plaques osseuses. Le titane présente plusieurs avantages par rapport aux fenêtres en acier, notamment son caractère léger et^{inerte 21}. Récemment, plusieurs autres matériaux ont été utilisés pour générer de nouveaux types de fenêtres d’imagerie, y compris la fenêtre flexible en silicium²⁰. Contrairement au R.MIW, la fenêtre flexible ne nécessite aucune suture pour l’implantation et convient à presque toutes les positions anatomiques, en particulier dans le cas des tissus mous et fragiles. Les fenêtres en silicium ont un impact minimal sur la motilité animale en raison de leur nature légère et déformable et peut-être plus adaptées aux expériences d’étude de l’expansion et de la croissance rapides des tissus²⁰. Un autre avantage par rapport à la version titane est que les fenêtres en silicium sont compatibles avec d’autres modalités d’imagerie, y compris l’imagerie par résonance magnétique^20,27. Cependant, il sera important de garder à l’esprit que les objectifs sont optimisés pour les couvercles en verre de 0,17 mm. De plus, le tissu mammaire est sensible aux mouvements respiratoires, qui sont difficiles à restreindre à l’aide de la fenêtre flexible, en particulier lors de l’utilisation d’un microscope inversé. Les artefacts respiratoires sont minimisés par la conception R.MIW et la fixation du R.MIW dans l’incrustation de la boîte d’imagerie. Par conséquent, les images acquises à l’aide de la configuration R.MIW proposée ne sont pas déformées en raison d’artefacts respiratoires. Cependant, des dérives mineures dans la localisation des tissus peuvent se produire, qui sont généralement progressives et peuvent être corrigées en utilisant un logiciel de correction de mouvement post-acquisition²⁸. Avec la boîte à outils croissante des technologies IVM ^2,20, les exigences spécifiques de chaque expérience détermineront éventuellement la meilleure façon de visualiser in vivo le tissu d’intérêt. Différentes conceptions de fenêtres présentent des avantages et des inconvénients différents et, en fonction de la question de recherche, de la configuration de microscopie disponible, de la résolution spatiale et temporelle requise et de la durée totale du processus étudié, l’approche optimale doit être déterminée.

En résumé, le R.MIW facilite la caractérisation à haute résolution de la dynamique cellulaire pendant le développement de la glande mammaire, l’homéostasie et la maladie sur plusieurs jours à plusieurs semaines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.9 % NaCl	BD	306573	Autres marques disponibles
10 mm rond coverglass	Fisher	scientific 10696365	Autres marques disponibles
5-0 suturs en soie tressée	Ethicon	W580
80 % Ethanol	homemade	NA
Boîte d’induction d’anesthésie	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
Buprénorphine (Vetergesic® ;)	Ecuphar	NA
Embouts en coton (stérile)	Fisher scientific	13113743	Autres marques disponibles
Adhésif cyanoacrylate	Loctite	NA	Autres marques disponibles
Pommade pour les yeux	Duratears	NA
Aiguille papillon flexible	Greiner Bio-One	450120	Autres marques disponibles
Pince Graefe (émoussée)	Fine Science Tools	11051-10
Coussin chauffant	Kentscientific	RightTemp Jr.	Autres marques disponibles
Boîte d’imagerie	NA		Infuse sur mesure
	Braun	Nutriflex special 70/240
Seringues à insuline	BD	324911	Autres marques disponibles
Microscope multiphoton inversé avec platine automatisée	Leica Microsystems	NA
Vaporisateur Isoflurane	Kentscientific	VetFlo-1231K
Porte-aiguille	Fine Science Tools	12510-14
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	semi-transparent
Ruban adhésif tesa	Tesa
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Lames de rasoir	Fisher scientific	11904325	Autres marques disponibles
Tubes en silicone	Solutions Elastomeres	NA	Tous les articles
ménagers Ciseaux à ressort (petits)	Fine Science Tools	15018-10
10010023		stérile PBS	ThermoFisher Scientific
(10 ml)	BD	305482	Autres marques disponibles
Pince fine	Fine Science Tools	11413-11
Couvercle en titane pour fenêtre	d’imagerie mammaire
	sur mesure
NA Bâtonnets en bois cure-dents	Fisher scientific	NC1678836	Autres marques disponibles