Technique modifiée pour l’utilisation de cœurs murins néonatals dans la préparation de Langendorff

Résumé

Le présent protocole décrit la canulation aortique et la perfusion rétrograde du cœur murin néonatal ex-vivo . Une stratégie à deux personnes, utilisant un microscope à dissection et une aiguille de petit calibre émoussée, permet une canulation fiable. La quantification de la tension contractile longitudinale est réalisée à l’aide d’un capteur de force relié à l’apex du ventricule gauche.

Résumé

L’utilisation du cœur perfusé rétrograde ex-vivo a longtemps été une pierre angulaire de l’étude de l’ischémie-reperfusion depuis son développement par Oskar Langendorff il y a plus d’un siècle. Bien que cette technique ait été appliquée à des souris au cours des 25 dernières années, son utilisation chez cette espèce a été limitée aux animaux adultes. La mise au point d’une méthode efficace pour canuler de manière cohérente l’aorte murine néonatale permettrait l’étude systématique du cœur perfusé rétrograde isolé pendant une période critique de développement cardiaque chez une espèce génétiquement modifiable et peu coûteuse. La modification de la préparation de Langendorff permet la canulation et l’établissement d’une reperfusion dans le cœur murin néonatal tout en minimisant le temps ischémique. L’optimisation nécessite une technique à deux personnes pour permettre une canulation réussie de l’aorte de la souris nouveau-née à l’aide d’un microscope à dissection et d’une aiguille modifiée disponible dans le commerce. L’utilisation de cette approche établira de manière fiable une perfusion rétrograde en 3 minutes. Parce que la fragilité du cœur néonatal de la souris et de la taille de la cavité ventriculaire empêche la mesure directe de la pression intraventriculaire générée à l’aide d’un ballonnet, l’utilisation d’un transducteur de force relié par une suture à l’apex du ventricule gauche pour quantifier la tension contractile longitudinale est nécessaire. Cette méthode permet aux chercheurs d’établir avec succès une préparation isolée du cœur murin néonatal à flux rétrograde et perfusé, permettant l’étude de la biologie cardiaque du développement de manière ex vivo . Il est important de noter que ce modèle sera un outil puissant pour étudier les réponses physiologiques et pharmacologiques à l’ischémie-reperfusion dans le cœur néonatal.

Introduction

Les préparations cardiaques ex vivo sont un aliment de base des études physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques depuis plus d’un siècle. Issu des travaux d’Elias Cyon dans les années 1860, Oskar Langendorff a adapté le modèle de grenouille isolée pour la perfusion rétrograde, pressurisant la racine aortique pour fournir un flux coronaire avec un perfusat oxygéné¹. En utilisant son adaptation, Langendorff a pu démontrer une corrélation entre la circulation coronaire et la fonction mécanique². Le cœur perfusé rétrograde ex-vivo, plus tard surnommé la technique de Langendorff, est resté une ....

Protocole

Les approbations du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center ont été obtenues pour toutes les méthodes décrites. Des souris mâles de type sauvage C57Bl/6 de jour postnatal 10 ont été utilisées pour l’étude.

1. Préparation de l’appareil Langendorff

1. Pour minimiser la complexité, utilisez du perfusat oxygéné non recirculant dans l’appareil de Langendorff (voir tableau des matériaux) via un débit constant ou une pression constante.
   1. Utiliser le tampon Krebs-Henseleit (KHB), contenant 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmo....

Résultats

Des souris P10 ont été utilisées pour modéliser un point temporel dans la petite enfance humaine^26,27. Quinze cœurs de souris nouveau-nés isolés en C57Bl/6 ont été récoltés et canulés avec succès. Les cœurs ont été perfusés avec un flux continu de 2,5 mL ^min-1 de KHB oxygéné réchauffé. Les paramètres métaboliques, y compris l’extraction du glucose, la consommation d’oxygène, la production de lactate et les paramètres physiologiques tels que la fréquenc.......

Discussion

Le présent travail décrit la canulation aortique réussie et la perfusion rétrograde dans le cœur isolé de souris nouveau-né. Fait important, il permet aux chercheurs de surmonter les obstacles que le jeune âge murin et la petite taille du cœur présentaient auparavant⁸. Bien qu’elle ne soit pas complexe dans sa conception, l’approche nécessite un degré important de compétences techniques. Les étapes clés qui mettront inévitablement au défi même les enquêteurs les plus compétents techniquement seron.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rongeur Langendorff Appareil	Radnoti	130102EZ
24 G Cathéter	BD	381511
26 G Aiguille sur seringue 1 mL combo	BD	309597
5-0 Suture en soie	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulation d’eau chaude Bain	Haake	DC10
ciseaux à iris incurvés	Medline	MDS10033Z
microscope de dissection	Nikon	SMZ-2B
trouver ciseaux à ressort	Kent
Force Transducteur	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
Tube haute pression	Edwards Lifesciences	50P184
pansement pour iris	Kent	INS650915-4
Courbée de style bijoutier pince fine	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Pompe à rouleaux	Gilson	Minipuls 3
ciseaux de dissection droits	Kent	INS600393-G
Fil de stimulation cardiaque temporaire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A