Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.

Résumé

L’expression hétérologue des connexines et des innexines dans les ovocytes xenopus est une approche puissante pour étudier les propriétés biophysiques des jonctions lacunaires (GJ). Cependant, cette approche est techniquement difficile car elle nécessite une pince de tension différentielle de deux ovocytes opposés partageant un terrain d’entente. Bien qu’un petit nombre de laboratoires aient réussi à exécuter cette technique, pratiquement tous ont utilisé des amplificateurs faits maison ou des amplificateurs commerciaux conçus pour les enregistrements à un seul ovocyte. Il est souvent difficile pour d’autres laboratoires de mettre en œuvre cette technique. Bien qu’un mode de mesure de courant latéral élevé ait été incorporé dans un amplificateur commercial pour les enregistrements à double tension ovocytaire, il n’y avait eu aucun rapport pour son application jusqu’à notre étude récente. Nous avons rendu l’approche de mesure du courant latéral élevé plus pratique et pratique en introduisant plusieurs modifications techniques, notamment la construction d’une plate-forme d’enregistrement magnétique qui permet un placement précis des ovocytes et de diverses électrodes, l’utilisation de la solution de bain comme conducteur dans les électrodes différentielles de tension, l’adoption d’une électrode KCl commerciale à faible fuite comme électrode de référence, fabrication d’électrodes de courant et de tension à partir de capillaires en verre à paroi mince et positionnement de toutes les électrodes à l’aide de dispositifs magnétiques. La méthode décrite ici permet des enregistrements pratiques et robustes du courant jonctionnel (I_j) entre deux ovocytes Xenopus opposés.

Introduction

Les GJ sont des canaux intercellulaires qui peuvent permettre le flux de courant et l’échange de petites molécules cytosoliques entre les cellules voisines. Ils existent dans de nombreux types de cellules et remplissent diverses fonctions physiologiques. Les GJ chez les vertébrés sont formés par les connexines, tandis que ceux chez les invertébrés par les innexines. Chaque GJ se compose de deux hémicanaux juxtaposés avec 6 ou 8 sous-unités par hémicanal, selon qu’il s’agit de connexines ou d’innexines ^1,2,3. Les humains ont 21 gènes^de connexine 4, tandis que les modèles d’invertébrés couramment utilisés C. elegans et Drosophila melanogaster ont 25 et 8 gènes d’innexine, respectivement ^5,6. L’épissage alternatif des transcriptions de gènes peut encore augmenter la diversité des protéines GJ, au moins pour les innexines ^7,8.

Les JJ peuvent être divisés en trois catégories en fonction de leur composition moléculaire : homotypique, hétérotypique et hétéromérique. Un GJ homotypique a toutes ses sous-unités identiques. Un GJ hétérotypique a deux hémicanaux homomériques, mais les deux hémicanaux sont formés par deux protéines GJ différentes. Un GJ hétéromérique contient au moins un hémicanal hétéromérique. Les diversités moléculaires des MJ peuvent conférer des propriétés biophysiques distinctes qui sont importantes pour leurs fonctions physiologiques. Les propriétés biophysiques de GJ sont également modulées par les protéines régulatrices⁹. Pour comprendre comment les MJ remplissent leurs fonctions physiologiques, il est important de connaître leurs compositions moléculaires, leurs propriétés biophysiques et le rôle des protéines régulatrices dans leurs fonctions.

Les systèmes d’expression hétérologues sont souvent utilisés pour étudier les propriétés biophysiques des canaux ioniques, y compris les GJ, et les effets des protéines régulatrices sur eux. Parce que les systèmes d’expression hétérologue permettent l’expression de protéines spécifiques, ils sont généralement plus aptes à disséquer les fonctions protéiques que les tissus natifs où les protéines avec des fonctions redondantes peuvent compliquer l’analyse, et l’enregistrement de I_j peut être inaccessible. Malheureusement, les lignées cellulaires les plus couramment utilisées, à l’exception de la cellule Neuro-2A, sont inappropriées pour étudier les propriétés biophysiques du GJ en raison de complications par les connexines endogènes. Même les cellules Neuro-2A ne sont pas toujours appropriées pour ce type d’analyse. Par exemple, nous n’avons pu détecter aucun I_j dans les cellules Neuro-2A transfectées avec les innexines UNC-7 et UNC-9 en l’absence ou la présence d’UNC-1 (non publié), ce qui est nécessaire pour la fonction des UNC-9 GJs dans C. elegans ^9,10. D’autre part, les ovocytes Xenopus sont un système alternatif utile pour les analyses électrophysiologiques des JJ. Bien qu’ils expriment une protéine GJ endogène, la connexine 38 (Cx38)¹¹, les complications potentielles peuvent être facilement évitées en injectant un oligonucléotide antisens spécifique¹². Cependant, les analyses de GJ avec des ovocytes Xenopus nécessitent une pince de tension différentielle de deux cellules juxtaposées, ce qui est techniquement difficile. Les premiers succès de la pince à double tension des blastomères de grenouille ont été rapportés il y a environ 40 ans^13,14. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé cette technique pour enregistrer I_j dans des ovocytes Xenopus appariés. Cependant, pratiquement toutes les études précédentes ont été réalisées avec des amplificateurs faits maison ^12,15,16 ou des amplificateurs commerciaux conçus pour des enregistrements sur des ovocytes simples (GeneClamp 500, AxoClamp 2A ou AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Parce que même les amplificateurs commerciaux ne fournissent pas d’instructions pour la pince de tension à double ovocyte, il est souvent difficile pour les laboratoires électrophysiologiques nouveaux ou moins sophistiqués de mettre en œuvre cette technique.

Un seul amplificateur commercial a été développé pour la pince à double tension ovocytaire, l’OC-725C de Warner Instruments (Table des matériaux, Figure 1A). Cet amplificateur peut être utilisé en mode standard (pour les ovocytes simples) ou en mode de mesure à courant latéral élevé (pour les ovocytes simples ou doubles) selon que deux prises de sa sonde de tension sont connectées (Figure 1B, C). Cependant, jusqu’à notre récente étude⁷, il n’y avait pas eu une seule publication décrivant l’utilisation de cet amplificateur dans son mode de mesure à courant latéral élevé. Bien que l’amplificateur ait été utilisé par un autre laboratoire pour les enregistrements à double ovocyte, il a été utilisé dans le mode standard plutôt que dans le mode côté haut^21,22. Ce manque de rapports utilisant l’amplificateur dans son mode de mesure de courant latéral élevé peut être dû à des difficultés techniques. Nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des enregistrements stables à double ovocyte en utilisant le mode côté haut en suivant les instructions du fabricant. Au fil des ans, nous avons essayé trois approches différentes pour les enregistrements à double ovocyte, notamment en utilisant deux amplificateurs OC-725C en mode de mesure à courant latéral élevé, deux amplificateurs OC-725C en mode standard et deux amplificateurs d’un autre fabricant. Nous n’avons finalement réussi à obtenir des enregistrements stables qu’avec la première approche après de nombreux essais et erreurs. Cette publication décrit et démontre les procédures que nous utilisons pour exprimer les protéines GJ dans les ovocytes Xenopus, enregistrer I_j en utilisant le mode de mesure du courant latéral élevé et analyser les données électrophysiologiques à l’aide de logiciels commerciaux populaires. Des informations supplémentaires sur la technique de la double tension-pince peuvent être trouvées dans d’autres publications^19,23.

Protocole

Les chirurgies sont effectuées selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soins aux animaux de la faculté de médecine de l’Université du Connecticut.

1. Chirurgie de la grenouille et préparation d’ovocytes défollicués

1. Anesthésier une grenouille africaine à griffes femelle adulte (Xenopus laevis) (Table des matériaux) en l’immergeant dans une solution de tricaïne fraîche (avec de la glace) (~300 mg/L).
2. Attendez (~ 15 min) jusqu’à ce que la grenouille montre peu ou pas de réponse à serrer ses pieds palmés. Posez la grenouille sur une table d’opération avec son ventre tourné vers le haut.
3. Après une incision longitudinale (8-10 mm de long) sur la région abdominale inférieure gauche ou droite, retirez doucement un petit morceau de tissu ovarien avec une paire de pinces et coupez le tissu ovarien avec une paire de petits ciseaux.
4. Immergez immédiatement le tissu ovarien libre dans une solution de ND96 sans Ca²⁺ (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) à l’intérieur d’une boîte de Petri de 60 mm.
5. Après avoir fermé l’incision par de simples sutures interrompues à l’aide d’une suture en soie 5-0 (table des matériaux), remettez la grenouille dans un réservoir d’eau peu profonde pour la récupération.
   REMARQUE: L’incision est fermée en deux étapes: d’abord les couches péritonéale et musculaire, puis la couche cutanée. Chaque grenouille est soumise à 5 chirurgies avec un intervalle d’au moins 4 semaines entre deux chirurgies consécutives.
6. Transférer le tissu ovarien isolé dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de solution de ND96 sans Ca²⁺ avec 20 mg de collagénase (Table des matériaux) et 20 mg de hyaluronidase (Table des matériaux).
7. Agiter le tube sur un agitateur orbital à température ambiante (RT) jusqu’à ce que tous les ovocytes soient isolés (solitaires).
8. Par la suite, transférez 30 à 50 ovocytes dans une boîte de Pétri à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et examinez fréquemment les ovocytes sous un stéréomicroscope (≥25x puissance de grossissement la plus élevée) pour déterminer s’ils sont défolliculés.
   REMARQUE: La pipette Pasteur doit être « coupée » à une ouverture de pointe plus large à l’aide d’un scriber en diamant (Table des matériaux) et flammée pour lisser le bord de coupe.
9. Dès que 70% à 80% des ovocytes sont défolliculés, décantez la solution enzymatique en inclinant doucement le tube. Lavez les ovocytes 5 fois en remplissant le tube avec une solution de ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1,8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) et décantation de la solution.
10. Après le lavage final, transférer les ovocytes dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de ND96. Cueillir et transférer des ovocytes gros et d’apparence saine dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de ND96 complétée par du pyruvate de sodium (2 mM) et de la pénicilline-streptomycine (100 U / mL) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre propre.
    REMARQUE: Les « ovocytes gros et d’apparence saine » sont ceux des stades V et VI ne montrant aucun signe de digestion excessive par les enzymes.
11. Placer la boîte de Petri contenant les ovocytes prélevés à l’intérieur d’une chambre environnementale (15-18 °C).

2. Expression de la protéine GJ

1. Synthétiser l’ARN complémentaire (ARNc) d’une connexine ou d’une innexine spécifique in vitro à l’aide d’un kit de transcription de l’ARN (Table des matériaux) suivant le protocole du fabricant.
2. Précipiter l’ARNc à l’aide d’une méthode au chlorure de lithium décrite dans le manuel d’utilisation du kit de transcription de l’ARN.
3. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, dissolvez-la dans 20 μL de_H2Osans nucléase et ajoutez 1 μL d’inhibiteur de ribonucléase (40 U, Table des matières).
4. Mesurer la concentration de l’ARNc à l’aide d’un spectrophotomètre (Table des matériaux).
5. Mélanger l’ARNc avec un oligo antisens Cx38 de sorte que les concentrations finales soient de 200 à 1 000 ng/μL d’ARNc et de 100 ng/μL d’oligo.
   NOTE: La séquence oligo est 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, qui correspond aux nucléotides de -5 à +25 dans l’ARNm Xenopus laevis Cx38 (accession NCBI: NM_001088018)¹¹. L’oligo est conservé sous forme de solution mère (2,0 mg/mL) avant d’être mélangé avec l’ARNc.
6. Éliminer les particules dans l’ARNc en tournant dans une microcentrifugeuse (~16 000 x g) pendant 2 min, et transférer rapidement le surnageant entier dans un nouveau tube par pipetage (éviter de perturber le fond du tube de microcentrifugation).
7. Diviser l’ARNc en aliquotes (2,5 μL/flacon) et conserver les aliquotes dans un congélateur à -80 °C.
8. Préparez un plat d’injection d’ovocytes en collant un petit morceau (~1 cm x 1 cm) de maille de nylon (table des matériaux) au fond d’une boîte de Petri de 35 mm à l’aide d’un adhésif époxy à durcissement rapide.
   REMARQUE: Le plat d’injection d’ovocytes est réutilisable. Lavez-le avec de l’éthanol à 70% après chaque utilisation.
9. Remplissez le plat d’injection d’ovocytes à peu près à mi-chemin avec une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine).
10. Placez 25 à 30 ovocytes en rangées à l’intérieur de la boîte de Pétri.
11. Préparez les micropipettes en verre pour les injections d’ovocytes en suivant les instructions du manuel d’utilisation de l’injecteur automatisé de nanolitres (Table des matériaux).
    REMARQUE: L’utilisation d’un biseau à microélectrode (Table des matériaux) peut aider à produire des micropipettes d’injection tranchantes qui causent un minimum de dommages aux ovocytes.
12. Remplissez une micropipette d’injection avec de l’huile minérale légère et insérez-la dans le support de micropipette de l’injecteur.
13. Transférez l’ARNc de l’une des aliquotes stockées à la surface intérieure d’un couvercle ou d’un fond de boîte de Pétri par pipetage.
14. Aspirer la gouttelette d’ARNc dans l’extrémité de la micropipette en appuyant sur le bouton FILL du contrôleur de l’injecteur.
15. Injectez l’ARNc (~50 nL/ovocyte) en appuyant sur le bouton INJECT .
    REMARQUE: Le volume d’injection peut être réglé par les commutateurs dip dans le contrôleur de l’injecteur.
16. Transférer les ovocytes injectés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine) et les conserver à l’intérieur de la chambre environnementale (15-18 °C) pendant 1 à 3 jours (en fonction de la vitesse et du niveau d’expression de la protéine GJ). Remplacez la solution quotidiennement en transférant les ovocytes dans une nouvelle boîte de Pétri.

3. Appariement d’ovocytes

1. Transférer quelques-uns des ovocytes injectés dans une boîte de Petri de 35 mm contenant une solution de ND96.
2. Utilisez deux pinces fines (Table des matières) pour décoller doucement la membrane transparente de vitelline qui enveloppe l’ovocyte.
   REMARQUE: Il peut être nécessaire d’affûter les embouts de la pince avant la première utilisation et de temps en temps, en utilisant un morceau de papier de verre fin (600 Grit).
3. Placer 2 ovocytes par puits dans une chambre d’appariement d’ovocytes (Figure 1D) contenant une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine).
   REMARQUE: La chambre d’appariement des ovocytes est construite en collant un petit morceau d’un Minitray Microwell (Table des matériaux) au fond d’une boîte de Pétri de 35 mm (Table des matériaux) à l’aide d’un adhésif époxy à durcissement rapide. Le Minitray est coupé en petits morceaux à l’aide d’un coupe-fil chaud (Table des matériaux). L’utilisation du Minitray pour l’appariement des ovocytes a été décrite à l’origine par d’autres²⁴. Bien qu’une protéine GJ puisse se distribuer de manière non uniforme dans la membrane cellulaire des ovocytes en fonction des propriétés de charge des résidus d’acides aminés dans ses domaines cytosoliques²⁵, l’appariement aléatoire (sans discrimination entre les pôles animal et végétal de l’ovocyte) semble être suffisant en général.
4. Conservez la boîte de Petri contenant des ovocytes appariés à TA sur la table d’isolement à utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques.
   REMARQUE: La durée de l’appariement peut varier de quelques heures à une journée. Une pratique pratique consiste à apparier les ovocytes en fin d’après-midi et à les enregistrer le lendemain.

4. Préparation du système d’acquisition

1. Configurez deux amplificateurs à pince à ovocytes OC-725C (Table des matériaux) sur le mode de mesure du courant latéral élevé en ajustant un interrupteur de trempage interne (Figure 1B).
2. Mettez les amplificateurs à la terre en interconnectant d’abord les prises de circuit de terre sur les panneaux arrière, puis en les connectant à la cage de Faraday et à la lumière à fibre utilisée pour éclairer la chambre d’enregistrement.
3. Connectez les amplificateurs à un convertisseur de signal analogique-numérique (Table des matériaux) et configurez-les dans le module Clampex du logiciel pClamp (Table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant de l’amplificateur.
4. Testez le système d’acquisition avec la cellule modèle fournie avec l’amplificateur.
   1. Connectez la sonde DIFF V et les câbles de courant (I) à la cellule modèle, connectez les prises rouge et noire de la sonde _DIFF V avec le cavalier inclus, connectez l’une ou l’autre jambe du cavalier à l’une ou l’autre broche de la cellule modèle et connectez le fil de terre de la cellule modèle au câble à partir de la prise GROUNDS CIRCUIT de l’amplificateur (Figure 1E).
   2. Mettez à zéro les compteurs d’électrode de tension (Vm) et d’électrode de bain (Im) de l’amplificateur en tournant les boutons Vm OFFSET et Ve OFFSET , respectivement, passez Clamp de OFF à Fast ou SLOW et tournez le cadran GAIN dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet une serrage de tension appropriée (Figure 1A). L’interrupteur D.C. GAIN peut se trouver en position OUT ou IN .
   3. Exécutez un protocole d’acquisition simple contenant quelques étapes de tension pour confirmer que la tension affichée dans le compteur Vm change en fonction du protocole d’acquisition et que les traces de tension et de courant sont affichées correctement dans Clampex.
      REMARQUE: Un seul amplificateur peut être testé à chaque fois en utilisant cette approche.

5. Enregistrement I_j entre ovocytes appariés

1. Créer des protocoles d’acquisition pour _{l’enregistrement I j} dans le logiciel pClamp.
   REMARQUE : Créez deux protocoles d’acquisition. Dans l’un d’eux, l’amplificateur n° 1 est utilisé pour produire une série d’étapes de tension membranaire (V_m) (par exemple, -150 à +90 mV à des intervalles de 10 mV), tandis que l’amplificateur n° 2 est utilisé pour maintenir un V_{m constant} (par exemple, -30 mV). Dans l’autre protocole, l’amplificateur #2 est utilisé pour produire les pas V_m , tandis que l’amplificateur #1 est utilisé pour maintenir la constante V_m. Les étapes V_m positives et négatives doivent être appliquées alternativement (par exemple, -150, +90, -140, +80 ......), qui peuvent être programmées dans Clampex à l’aide de la fonction User List du protocole d’acquisition.
2. Configurer l’étape d’enregistrement
   1. Déposer une boîte de Petri contenant des ovocytes appariés dans le récipient de la boîte de Petri dans la plate-forme d’enregistrement (Figure 2A)
   2. Sélectionnez une paire d’ovocytes et faites pivoter la boîte de Pétri si nécessaire pour que les deux ovocytes soient dans les directions gauche et droite, et verrouillez la scène en position par sa base magnétique.
   3. Fixez les supports magnétiques qui maintiennent les sondes de courant et de tension aux endroits appropriés sur la table d’isolement.
      REMARQUE : Assurez-vous que les sondes de courant et de tension d’un amplificateur sont situées sur le côté gauche, tandis que celles de l’autre amplificateur sont sur le côté droit, et que la sonde de tension se trouve devant la sonde de courant de chaque côté (Figure 2B, C).
3. Configurer l’électrode de référence
   1. Placez une électrode de référence (Table des matériaux) près du bord de la boîte de Petri vers le côté utilisateur (Figure 2B, C).
   2. Connectez l’électrode de référence à la douille noire (Circuit Ground) dans une seule des deux sondes _DIFF V.
4. Configurer les électrodes DIFF V
   1. Tirez une paire de micropipettes en verre, détachez un peu de la pointe avec le scriber en diamant (Table des matériaux) et lissez le bord de la pointe par polissage au feu.
      REMARQUE: La résistance de la pointe doit être inférieure à 150 kΩ (mesurée avec ND96 dans la pipette). On utilise généralement des micropipettes avec une résistance de pointe de 20 à 150 kΩ.
   2. Tenez la micropipette au-dessus de la flamme d’un brûleur à alcool pour la plier à un angle lisse (~130°) à une position ~1 cm de la pointe.
      REMARQUE: Les micropipettes fabriquées sont réutilisables. Rincez-les à l’eau après chaque utilisation.
   3. Remplissez complètement la pipette en verre avec une solution ND96, insérez-la dans un porte-microélectrode prérempli (avec ND96) (table des matériaux, figure 2D) et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le système.
   4. Insérez la broche de 2 mm du support de microélectrode dans la douille de 2 mm d’un fil de connexion d’électrode DIFF V (Figure 2D).
   5. Serrez la douille de 2 mm sur un pince magnétique (Figure 2D) et dirigez l’extrémité de l’électrode DIFF V vers l’un des deux ovocytes (Figure 2E).
      REMARQUE: Ajustez la position et l’angle de la pince de sorte que la pointe de l’électrode soit très proche de l’ovocyte
   6. Insérez la broche de 1 mm du fil de connexion de l’électrode V_DIFF dans la prise rouge (entrée V_DIFF ) de la sonde V_DIFF du même côté.
   7. Préparez et connectez une électrode DIFF V pour l’autre ovocyte et l’amplificateur en suivant des procédures similaires.
      REMARQUE: Une vue rapprochée d’une paire d’ovocytes et de toutes les électrodes est illustrée à la figure 2E.
5. Configurer les électrodes de courant et de tension
   1. Préparez les électrodes de tension et de courant à partir de capillaires en verre, remblayez-les (environ à mi-chemin) avec une solution KCl (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 avec KOH) et insérez-les dans les porte-électrodes fournis avec les amplificateurs.
      REMARQUE: Les électrodes doivent avoir une résistance d’environ 1 MΩ. Des électrodes appropriées peuvent être obtenues à partir d’un type de capillaires en verre à paroi mince (table des matériaux) en utilisant un ensemble spécifique de paramètres de traction (tableau 1). De telles pointes peuvent facilement pénétrer dans la membrane cellulaire de l’ovocyte sans avoir besoin d’appuyer sur le bouton Vm ou Ve BUZZ de l’amplificateur.
   2. Abaissez les électrodes dans la solution de bain, mettez à zéro les compteurs Vm et Im en tournant les cadrans Vm OFFSET et Ve OFFSET et vérifiez la résistance des électrodes en appuyant sur Vm Electrode Test et Ve Electrode Test.
   3. Insérez les électrodes de courant et de tension dans les ovocytes et observez les potentiels membranaires négatifs (généralement -20 à -50 mV).
      REMARQUE: Les compteurs Vm et Im du même amplificateur doivent afficher deux valeurs identiques ou très similaires.
6. Acquisition de données
   1. Dans la section Clamp de l’amplificateur, vérifiez que D.C. GAIN est en position IN , tournez le bouton GAIN dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet une serrage de tension appropriée (généralement un tiers à la moitié de la plage complète) et tournez l’interrupteur Clamp de OFF à FAST.
      REMARQUE: Lors de l’allumage de la pince, les compteurs Vm et Im afficheront respectivement la tension de maintien et le courant de maintien. Bien que le courant de maintien puisse varier quelque peu en fonction des conditions ovocytaires, il est généralement faible et stable à la station V_m (p. ex., -30 mV).
   2. Exécutez un protocole d’acquisition.
      REMARQUE: Quatre traces seront affichées à l’écran. Les traces de tension et de courant d’un amplificateur indiquent les pas Vm appliqués à l’ovocyte #1 et le courant nécessaire pour produire les pas Vm , tandis que ceux de l’autre amplificateur indiquent la constante Vm (-30 mV) de l’ovocyte #2, et le courant injecté pour maintenir cette constante Vm. Le courant injecté dans l’ovocyte #2 représente le I_j.

6. Analyse des données

1. Analyse avec Clampfit.
   1. Ouvrez un fichier abf enregistré dans le module Clampfit de pClamp.
   2. Utilisez les curseurs 1 et 2 pour entourer un segment de la ligne de base avant les traces I_j .
   3. Cliquez sur l’icône Ajuster la ligne de base pour afficher une fenêtre de configuration. Sélectionnez Soustraire la moyenne des curseurs 1..2 pour Méthode et vérifiez que Tous les signaux visibles et Toutes les traces visibles sont sélectionnés pour Sélection de trace.
   4. En cliquant sur OK, la fenêtre Ligne de base se ferme, les lignes de base de toutes les traces de courant et de tension convergent vers le niveau zéro. Notez que les pas de tension passent à de nouveaux niveaux qui sont égaux à la tension d’origine moins la tension de maintien (par exemple, -30 mV).
   5. Pour tracer la relation I_j et V_j à l’aide de l’état stable I_j, entourez un segment souhaité des traces I_j représentant l’état stable I_{j avec les} curseurs 1 et 2, placez le curseur 3 n’importe où dans la fenêtre de temps des pas de tension.
   6. Allez dans Analyser / Graphique rapide / I-V pour ouvrir une fenêtre I-V .
   7. Sous Axe X (tension), sélectionnez Curseur 3 dans Signal, spécifiez le signal de pas de tension (par exemple, Tension 1) dans le menu déroulant, puis cochez la case Inverser.
      REMARQUE: La case Inverser est cochée pour convertir le V_m en valeurs équivalentes à V_j, qui est défini comme V_m de l’ovocyte #2-V_m de l’ovocyte #1.
   8. Sous Axe Y (Courant), sélectionnez la source du signal I_j (par exemple, Courant 0) dans le menu déroulant en regard de Signal, définissez Région comme Curseurs 1..2 dans le menu déroulant, puis sélectionnez Moyenne.
      REMARQUE: Pour tracer les relations de pic I_j et V_{j, les} curseurs 1 et 2 doivent entourer le segment des traces I_j contenant le pic I_j à l’étape 6.1.5 et sélectionner Pic (au lieu de Moyenne) à l’étape 6.1.8.
   9. Sous l’option Destination , sélectionnez Remplacer ou Ajouter.
   10. Lorsque vous cliquez sur OK dans la fenêtre I-V , une relation I_j - V_{j s’affiche} à l’écran et les valeurs I_j et V_j correspondantes peuvent être trouvées en cliquant sur Fenêtre/Résultat.
2. Tracer et ajuster la relation G_{j-V j} dans OriginPro (Table des matériaux)
   1. Copiez les deux colonnes contenant les valeurs V_j et I_j de la fenêtre Résultats de Clampfit (étape 6.1.10) dans un nouveau classeur dans Origin. Assurez-vous que les valeurs V_j et I_j se trouvent respectivement sous les colonnes X et Y.
   2. Ajoutez quatre nouvelles colonnes dans le classeur en cliquant sur Colonne/Ajouter de nouvelles colonnes.
   3. Nommez la première nouvelle colonne G_j, remplissez-la en entrant l’équation « colonne I_j/colonne V_j * 1 000 » dans la fenêtre Définir les valeurs de colonne et créez un nuage de points de la relation G_{j-V j}.
      REMARQUE: La multiplication par 1 000 (facultatif) permet d’éviter l’inconvénient de traiter de très petits nombres dans les étapes suivantes.
   4. Ajuster les points de données G_j sur les plages V_j négative et positive indépendamment de la fonction de Boltzmann. Calculez G_j à V_j = 0 mV en entrant les valeurs G_jmax, G_jmin, A et V₀ à partir de l’ajustement dans l’équation de Boltzmann, ce qui peut être fait dans une feuille de calcul. Le G_j ainsi obtenu sera utilisé comme G_jmax à l’étape suivante.
      REMARQUE: L’équation pour ajuster la fonction de Boltzmann est: G_j = (G_{jmax-G jmin})/{1 + exp[A(V_{j-V 0})]} + G_jmin, dans lequel V₀ est le V_j où la conductance est demi-maximale, G_jmax est la conductance maximale, G_jmin est le V_j-insensible conductance résiduelle²³. Pour effectuer le raccord, ajoutez d’abord l’équation de Boltzmann en tant que nouvelle fonction d’ajustement dans OriginPro, puis sélectionnez cette fonction pour le raccord. Entrez les valeurs initiales approximatives pour G_jmax, G_jmin, V₀ et A avant d’exécuter la fonction d’ajustement. Assurez-vous que le paramètre G_jmax n’est pas fixe pour ce raccord.
   5. Nommez les deuxième et troisième nouvelles colonnes nGj-L et nGj-R (« n » pour « normalisé »), et remplissez-les en divisant la colonne G_j par les valeurs G_jmax dérivées des courbes G_j - V_j gauche et droite, respectivement (étape 6.2.4).
   6. Nommez la quatrième nouvelle colonne nGj-LR et remplissez-la en copiant les valeurs des plages V_j négatives et positives des colonnes nGj-L et nGj-R, respectivement.
   7. Créez un nuage de points pour nGj-LR sur V_j et ajustez indépendamment les points de données sur les plages V_j négative et positive à la fonction de Boltzmann. Assurez-vous que le paramètre G_jmax est fixé à 1,0 pour le raccord.
   8. Conservez des enregistrements des résultats d’ajustement (par exemple, le graphique ajusté et les valeurs G_jmin, V₀ et A ).

Résultats

UNC-7 et UNC-9 sont des innexines de C. elegans. Alors que UNC-9 n’a qu’une seule isoforme, UNC-7 a plusieurs isoformes qui diffèrent principalement par la longueur et la séquence d’acides aminés de leurs terminaux aminés ^7,8. Ces innexines peuvent former des GJ homotypiques et hétérotypiques (d’UNC-7 et UNC-9) lorsqu’elles sont exprimées dans les ovocytes Xenopus ^7,8. Les traces représe...

Discussion

L’optimisation du système semble nécessaire pour les expériences à double tension ovocytaire-pince. Sans cela, les enregistrements peuvent être très instables et les amplificateurs peuvent avoir à injecter une quantité excessive de courant pour atteindre la Vm cible, ce qui entraîne des dommages aux ovocytes et des échecs d’enregistrement. Plusieurs facteurs sont essentiels pour obtenir des enregistrements stables de deux ovocytes avec la méthode de mesure du courant latéral élevé. Tout d’abord, les électrodes d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Support magnétique	Agar Bridge ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	Plus stable que le clamper à tube Narishige en raison de sa base magnétique plus grande, mais il nécessite une modification pour accueillir une prise femelle de 2 mm.
Injecteur automatique de nanolitres	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, États-Unis	Injecteur de nanolitres automatisé	Nanoject II
Collagenase, Type II	Gibco-USA, Langley, OK,	États-Unis 17101-015
Diamond Scriber	Microscopie électronique Sciences, Hatfield, PA, États-Unis	62108-ST
Sonde de tension différentielle	Warner Instruments, Hamden, CT, États-Unis	7255DI
Convertisseur de signal analogique-numérique	Molecular Devices, San Jose, CA, États-Unis	Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers	World Precision Instruments, Sarasota, FL, États-Unis	500341
Capillaires	en verre Drummond Scientific Company, Broomall, PA, États-Unis	3-000-203-G/X
Coupe-fil chaud	Amazon.com	Proxxon 37080	Une alternative est le Hercules 8500 DHWT, qui dispose d’une pédale de commande au pied.
Hyaluronidase, Type I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
Base de support magnétique	Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, États-Unis	MB-L-45
Biseauteur de microélectrodes	Sutter Instrument, Novato, CA, États-Unis	BV-10
Porte-microélectrode	World Precision Instruments, , Sarasota, FL, États-Unis	MEH1S15
Extracteur de micropipettes	Sutter Instrument, , Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	Microwell Minitray
Nylon	mesh Component Supply Company, Sparta, TN, États-Unis	U-CMN-1000
Oocyte Clamp	Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San Jose, CA, USA	Version 10
Reference Electrode	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	Spécifications : https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (inhibiteur de la ribonucléase)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
Suture en soie 5-0	Covidien, North Haven, CT, États-Unis	VS890
Spectrophotomètre NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Capallaires en verre à paroi mince	World Precision Instruments, Sarasota, FL, États-Unis	TW150F-4
Collier	de serrage de tubesNarishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	Prêt à l’emploi mais sa position est sujette à se déplacer en raison de la petite base magnétique.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, États-Unis	IMP-XL-FM