Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain

Résumé

Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.

Résumé

Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.

Introduction

L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes¹, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello² ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage d....

Protocole

La ligne de P. americana a été initialement fournie par le Dr Huiling Hao. Cette espèce est maintenue avec la consanguinité depuis 30 ans⁹.

1. Éclosion et alimentation de P. americana

1. Recueillir les oothèques fraîches (immédiatement après la ponte) de P. americana et incuber dans l’incubateur sombre à 25 °C et 60 % d’humidité pendant environ 25 jours. Augmentez ensuite la température et l’humidité à 30 °C et 75% 3 jours avant l’éclosion.
2. Utilisez un tamis avec une ouverture de 4 mm pour séparer les nymphes hachées des oothèques.
3. Gardez les nymp....

Résultats

La figure 1 montre une injection réussie. La seringue de micro-injection avec une aiguille de micro diamètre doit être placée horizontalement sur le booster (Figure 1A). L’aiguille est insérée par l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme (Figure 1B). Assurez-vous que le liquide pénètre dans l’abdomen de P. americana . L’angle trop raide de l’aiguille endommagera les organes internes.......

Discussion

Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’élimination^{génique 13}. L’effet résiduel suivant du niveau du gèn.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
701 N 10 et micro ; L Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN :80300	Incubateur d’injection
	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	Pour l’éclosion et l’alimentation des cafards
Micro-pompe d’injection	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	Pour le clonage
de gènes Systèmes quantitatifs de PCR en temps réel	Bio-Rad	CFX Connect	Pour l’analyse qRT-PCR
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Pour la synthèse de dsRNA, qui contient de la Rnase A Solution (4 &mu ; g/&mu ; L), acétate de sodium, 3,0 M (pH 5,2), mélange d’enzymes, T7 Express, eau sans nucléases, tampon Express T7 2x, thermocycleurs DNase sans RNase RQ1
	Bio-Rad	S1000	pour l’amplification de l’ADN