Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

Yang Ge; Lieke van Roon; H. Sophia Chen; Ruben Methorst; Martin Paton; Marco C. DeRuiter; Szymon M. Kielbasa; Monique R. M. Jongbloed

doi:10.3791/63397

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Article de méthode

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

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DOI :

10.3791/63397

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23 mars 2022

Yang Ge¹^,² , Lieke van Roon¹ , H. Sophia Chen¹^,² , Ruben Methorst¹ , Martin Paton² , Marco C. DeRuiter¹ , Szymon M. Kielbasa³ , Monique R. M. Jongbloed¹^,²

¹Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, ²Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, ³Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Résumé

Le système nerveux autonome cardiaque est crucial dans le contrôle de la fonction cardiaque, comme la fréquence cardiaque et la contractilité cardiaque, et est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Normalement, il y a un équilibre entre ces deux branches pour maintenir l’homéostasie. Cependant, les états pathologiques cardiaques tels que l’infarctus du myocarde, l’insuffisance cardiaque et l’hypertension peuvent induire le remodelage des cellules impliquées dans l’innervation cardiaque, ce qui est associé à un résultat clinique défavorable.

Bien qu’il existe de grandes quantités de données sur la structure histologique et la fonction du système nerveux autonome cardiaque, son architecture biologique moléculaire dans la santé et la maladie est encore énigmatique à bien des égards. De nouvelles technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) sont prometteuses pour la caractérisation génétique des tissus à résolution unicellulaire. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation standardisée de ces techniques. Ici, ce protocole exploite le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes (snRNA-seq), une méthode pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Une approche par étapes est démontrée pour effectuer la séquence d’ARNN des ganglions cervicaux supérieurs bilatéraux (SCG) et stellaires (StG) disséqués à partir de souris adultes.

Cette méthode permet la conservation à long terme des échantillons, en maintenant une qualité d’ARN adéquate lorsque les échantillons de plusieurs individus / expériences ne peuvent pas être collectés tous en même temps dans un court laps de temps. Le codage à barres des noyaux avec des oligos de hashtag (HTO) permet de démultiplexer et de retracer des échantillons ganglionnaires distincts après le séquençage. Des analyses ultérieures ont révélé une capture réussie des noyaux des cellules neuronales, gliales satellites et endothéliales des ganglions sympathiques, validée par snRNA-seq. En résumé, ce protocole fournit une approche par étapes pour l’ARNN-seq des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une application plus large dans les études de l’innervation d’autres organes et tissus.

Introduction

Le système nerveux autonome (SNA) est une partie cruciale du système nerveux périphérique qui maintient l’homéostasie du corps, y compris l’adaptation aux conditions environnementales et à la pathologie¹. Il est impliqué dans la régulation de plusieurs systèmes d’organes dans tout le corps tels que les systèmes cardiovasculaire, respiratoire, digestif et endocrinien. Le SNA est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Les branches vertébrales du système nerveux sympathique synapsent dans les ganglions de la chaîne sympathique, situés bilatéralement en position paravertébrale. Les ganglions cervicaux et thoraciques bilatéraux, en par....