Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Irina A. Okkelman; Chris Vercruysse; Alina V. Kondrashina; Sergey M. Borisov; Ruslan I. Dmitriev

doi:10.3791/63403

Article de méthode

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

DOI :

10.3791/63403

⸱

6 avril 2022

Irina A. Okkelman^*¹ , Chris Vercruysse^*¹ , Alina V. Kondrashina² , Sergey M. Borisov³ , Ruslan I. Dmitriev¹

¹Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, ²Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, ³Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.

Résumé

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Les sphéroïdes multicellulaires sont des outils importants pour étudier la physiologie des tissus et du cancer en 3D et sont fréquemment utilisés en génie tissulaire comme unités d’assemblage de tissus pour la biofabrication. Alors que la principale puissance du modèle sphéroïde consiste à imiter les gradients physico-chimiques à l’échelle microchoirique des tissus, l’environnement physiologique réel (y compris la dynamique de l’activité métabolique, de l’oxygénation, de la mort cellulaire et de la prolifération) à l’intérieur des sphéroïdes est généralement ignoré. Dans le même temps, les effets de la composition du milieu de croissance et de la méthode de formation sur le phénotype sphéroïde résultant sont bien documentés. Ainsi, la caractérisation et la normalisation du phénotype sphéroïde sont nécessaires pour assurer la reproductibilité et la transparence des résultats de la recherche. L’analyse de l’oxygénation moyenne des sphéroïdes et de la valeur_{des gradients} d’O2 en trois dimensions (3D) peut être un moyen simple et universel de caractériser le phénotype sphéroïde, en indiquant leur activité métabolique, leur viabilité globale et leur potentiel de récapitulation du microenvironnement tissulaire in vivo . La visualisation de l’oxygénation 3D peut être facilement combinée à l’analyse multiparamétrique de paramètres physiologiques supplémentaires (tels que la mort cellulaire, la prolifération et la composition cellulaire) et appliquée à la surveillance continue de l’oxygénation et / ou aux mesures de point final. Le chargement de la sonde O₂ est effectué pendant la phase de formation des sphéroïdes et est compatible avec divers protocoles de génération de sphéroïdes. Le protocole comprend une méthode à haut débit de génération de sphéroïdes avec des nanocapteurs fluorescents_O2 émettant des rapports rouges et proche infrarouges introduits et la description de l’évaluation multiparamétrique de l’oxygénation des sphéroïdes et de la mort cellulaire avant et après la bioimpression. Les exemples expérimentaux montrent une analyse comparative des gradients O₂ dans les sphéroïdes homo- et hétérocellulaires ainsi que dans les constructions bioimprimées à base de sphéroïdes. Le protocole est compatible avec un microscope à fluorescence conventionnel ayant plusieurs filtres de fluorescence et une diode électroluminescente comme source de lumière.

Introduction

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L’oxygène moléculaire (_O2) est l’un des métabolites clés régulant la viabilité, la fonction et la mort des cellules et des tissus. Dans des conditions physiologiques, l’oxygénation tissulaire locale est régulée dynamiquement par la vascularisation tissulaire, le flux sanguin et le métabolisme cellulaire, conduisant dans certains cas à la formation de gradients_D’O2, de microenvironnement hypoxique et/ou de stress oxydatif ^1,2. Les cellules détectent les gradients_O2 par l’implication directe de l’O2 moléculaire dans la fonction de signalisation (via la signalisation médiée par le facteur inductible d’hypoxie (HIF), l’histone lysine déméthylase KDM, et par d’autres moyens), les changements dans le potentiel redox cellulaire (détection réactive des espèces O₂par signalisation Nrf2 / Keap1 ou protéines régulatrices du fer), et peuvent ensuite ajuster leur métabolisme, leur prolifération, puissance et différenciation³. Ainsi, l’hétérogénéité de l’oxygénation cellulaire et tissulaire, ses gradients et les phénomènes associés sont des acteurs importants du développement tissulaire et de l’homéostasie. Différents tissus et types de cellules nécessitent souvent différents niveaux physiologiques « normaux » d’O₂, qui définissent l’architecture tissulaire spéciale avec des cellules positionnées en fonction des microgradients tissulaires O₂ ⁴. Certains types de cellules sont sensibles à la diminution de l’O2 (p. ex., neurones, hépatocytes, cellules desîlots pancréatiques ou cellules musculaires)^5,6, tandis que d’autres peuvent résister à une hypoxie extrême et former des gradients d’O2 abrupts (p. ex., dans l’épithélium intestinal et du côlon)⁷. Avec les progrès de la bio-ingénierie tissulaire et de la biofabrication, la nécessité de la quantification de l’O2 dans les microagrégés et les constructions tissulaires 3D sphéroïdes devient importante. L’une des préoccupations est la normalisation des paramètres physiologiques du modèle sphéroïde multicellulaire, qui dépendent de la méthode de génération des sphéroïdes et des conditions de culture⁸. En outre, l’application incontrôlée de biomatériaux_libérant de l’O2 ou de perfusion d’O2 dans des microtissus dépourvus de vascularisation fonctionnelle peut être toxique pour les cellules, entraîner une reprogrammation de leur métabolisme et une diminution de la survie dans la période post-transplantation ^9,10. La crédibilité de l’approche de mesure de l’O₂ et de l’optimisation de l’environnement d’oxygénation pour atteindre la culture efficace de microagrégés physiologiquement pertinents a récemment été prouvée par la modélisation mathématique de sphéroïdes hépatiques dérivés de cellules souches pluripotentes utilisée comme exemple¹¹. Un autre domaine où la connaissance des niveaux d’O₂ tissulaire est reconnue est le traitement du cancer^12,13. L’hypoxie tumorale hétérogène peut nuire à la réussite du traitement anticancéreux. La mesure et le contrôle des niveaux exacts d’oxygénation pendant le traitement du patient ou la modélisation de l’hypoxie tumorale permettraient d’améliorer les stratégies thérapeutiques individuelles et personnalisées¹⁴. Ainsi, la surveillance quantitative de l’oxygénation dynamique dans les constructions biofabriquées et les modèles tumoraux 3D est un outil de premier plan pour l’analyse physiologique de leur activité respiratoire, leur métabolisme et l’optimisation de la culture tissulaire, des conditions de fabrication ou des études de base de la réponse thérapeutique médiée par l’hypoxie.

Un certain nombre de méthodes permettent une analyse multiplexée (ou multiparamètre) de l’oxygénation cellulaire dans les constructions tissulaires sphéroïdes et microagrégées. Pionnière avec les neurosphères et les sphéroïdes tumoraux 15,16,17, l’approche basée sur la microscopie d’imagerie à vie de phosphorescence (PLIM) permet de quantifier directement l’oxygénation cellulaire dans des microtissus vivants et d’établir sa corrélation avec la viabilité, la prolifération ou la distribution cellulaires des types de cellules fonctionnelles. Malgré la puissance de l’approche, la mise à niveau de la microscopie PLIM n’est toujours pas largement disponible, même parmi les fournisseurs de microscopie populaires^18,19. Heureusement, un bon nombre de sondes à nanoparticules sensibles à l’O₂ pénétrant dans les cellules peuvent également être utilisées pour le mode de mesure ratiométrique basé sur l’intensité de fluorescence ^{15,17,20,21,22,23,24}. En règle générale, la sonde affiche deux longueurs d’onde d’émission, c’est-à-dire sensibles à l’O₂ et insensibles (référence), qui peuvent être mesurées sur un microscope à fluorescence, un imageur de criblage à haute teneur ou un lecteur de microplaques. De telles nanoparticules de détection de l’O₂ peuvent être produites par technique de précipitation avec les polymères biocompatibles, la détection de l’O₂ et les colorants de référence couvrant les spectres visible et proche infrarouge, ou elles peuvent être achetées commercialement ^2,25. Étant donné que l’analyse de microtissus 3D épais bénéficierait de l’utilisation de colorants fluorescents décalés vers le rouge, la sonde à nanoparticules ratiométriques À détection O₂ de numéro infrarouge multimodal numéro 1 (MMIR1), composée de PtTPTBPF²⁶ à_{détection O} 2 et de colorants de référence aza-BODIPY²⁷ imprégnés dans un copolymère à base de polyméthacrylate chargé positivement a été construite²⁸. Avec cette conception, un signal sensible à O₂ (proche infrarouge, excitation (exc.) = 635 nm, émission (em.) = 760 nm; I_sens) est affectée par la concentration [_O2] par le processus de trempe par phosphorescence, tandis que l’intensité du colorant de référence rouge (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; I_réf. n’est pas affecté (figure 1A). Ainsi, le rapport I_ref / I_sens (R) dans les cellules colorées peut permettre l’étalonnage O₂ ²².

Nous décrivons ici une approche semi-quantitative pour surveiller l’oxygénation des cellules vivantes dans les sphéroïdes et les constructions bioimprimées, aidant à estimer les gradients d’O₂ dans les mesures finales et cinétiques. Une telle imagerie O₂ peut être réalisée avec d’autres types de sondes ratiométriques O₂ (Figure 1B) et, en fonction du nombre de sources lumineuses disponibles et de filtres de fluorescence, peut être utilisée avec d’autres colorants pour obtenir des informations sur les cellules vivantes / mortes, la fonction mitochondriale et le traçage d’autres types de cellules. Des modes de mesure avancés tels que la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) peuvent également être utilisés¹⁹. Le plus grand défi avec l’utilisation de colorants cellulaires et de nanoparticules sensibles à l’O₂ est l’optimisation du protocole de coloration. Dans le cas de la sonde MMIR1 et des nanoparticules associées, les cellules sont soit pré-colorées, soit co-incubées pendant le processus de formation des sphéroïdes. Dans le protocole décrit,_des sphéroïdes colorés par sonde O 2 ont été générés sur la surface d’agarose peu adhérente 29,30,31,32 (Figure 1C), ce qui permet une bioimpression ultérieure à base de sphéroïdes et une analyse multiparamétrique de l’O₂ et de la mort cellulaire. Pour illustrer l’applicabilité de l’approche, les niveaux d’oxygénation dans les sphéroïdes homo- ou hétérocellulaires (formés avec l’ajout de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, HUVEC) des cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) ont été comparés avant et après la bioimpression, à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel.

Protocole

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1. Génération à haut débit de sphéroïdes avec sonde sensible à l’O₂ incorporée

Préparation d’une plaque de culture tissulaire recouverte d’agarose à micro-motifs
REMARQUE: Les plaques de culture tissulaire revêtues d’agarose à micro-motifs sont utilisées pour la génération simultanée d’un grand nombre de sphéroïdes (1585 par timbre PDMS, voir Tableau des matériaux) pour la bioimpression et d’autres applications, où plusieurs répliques expérimentales ou un grand nombre de sphéroïdes sont nécessaires.
1. Préparer tous les matériaux et instruments stériles (spatules et pinces) par autoclavage si possible ou par stérilisation par filtre. Nettoyez les tampons PDMS^{recyclables 33} de l’agarose et stockez-les aseptiquement dans de l’éthanol à 70%. Faites-le au moins 1 jour avant la génération de sphéroïdes.
2. Transférez les tampons PDMS à micro-motifs d’un flacon de stockage vers une boîte de Petri stérile et séchez-les à l’air avec la surface lisse dans les conditions de flux d’air laminaire stérile pendant 10 minutes.
3. Placez chaque tampon avec une surface à micro-motifs vers le haut (et la surface lisse vers le bas) au milieu du puits d’une plaque de culture de tissu stérile de 12 puits. Sécher à l’air libre pendant 1-2 min avec un couvercle ouvert.
  REMARQUE: Il est très important d’évaporer l’excès de liquide car seuls les tampons secs adhèrent parfaitement à la surface en plastique et restent attachés pendant la procédure.
4. Peser 1,5 g d’agarose dans une bouteille en verre propre de 200 mL, ajouter 50 mL d’eau distillée stérile, couvrir avec un couvercle et faire fondre au micro-ondes pour obtenir 50 mL de solution homogène d’agarose à 3%.
  ATTENTION: La solution d’agarose est extrêmement chaude et doit être manipulée avec prudence. Si elle est agitée immédiatement après la procédure de fusion, la solution d’agarose chaude peut commencer à bouillonner et éclater hors du récipient. Pour éviter des traumatismes occasionnels, utilisez des vaisseaux suffisamment grands remplis d’un maximum de 50% du volume avec la solution d’agarose.
5. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, ajoutez immédiatement environ 2 mL de solution d’agarose chaude à chaque puits des plaques de culture cellulaire à 12 puits pour recouvrir complètement le tampon PDMS inséré. Laissez l’agarose se solidifier pendant 20 min en incubant sous le flux d’air stérile avec le couvercle de la plaque ouvert.
  REMARQUE : La couche d’agarose doit être au moins deux fois plus épaisse que le tampon PDMS pour assurer l’intégrité des micropuits d’agarose après le retrait du tampon PDMS (Figure 1C).
6. À l’aide d’une petite spatule stérile, tournez avec précision l’agarose avec le tampon PDMS intégré à l’envers dans chaque puits pour obtenir la surface lisse du tampon. Ajouter ~ 200 μL d’eau stérile sur la face supérieure lisse du tampon, détachez-le doucement de l’agarose avec une spatule et retirez-le du puits. Évitez d’endommager les micropuits.
7. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire stérile correspondant aux tampons d’agarose pour une utilisation directe. Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber toute la nuit à 4 °C. Utilisez une solution PBS (au lieu d’une solution moyenne) pour un stockage à long terme (jusqu’à 2 semaines à 4 °C). Ne laissez pas l’agarose sécher. Avant utilisation, chauffer les plaques à micro-motifs d’agarose pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à CO₂ .
  REMARQUE: L’incubation est nécessaire pour équilibrer et éliminer les bulles d’air des micropuits d’agarose. Passez à l’étape de protocole 1.2.
Préparation O₂sphéroïdes chargés par sonde
1. Utilisation α milieu essentiel minimal (MEM) complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et de facteurs de croissance complétés par le milieu de croissance des cellules endothéliales 2 pour la culture des lignées cellulaires hDPSC et HUVEC, respectivement. Préparer le milieu de croissance des sphéroïdes hétérocellulaires hDPSC / HUVEC en ajoutant des milieux de croissance HUVEC et hDPSC dans un rapport de 1: 1.
2. Préparer une culture cellulaire confluente à 70% à 90% (~ 3-4 jours de préparation). Pour la génération de sphéroïdes hétérocellulaires, préparez respectivement des cultures hDPSC et HUVEC.
  REMARQUE: Le nombre de passage de HUVEC et hDPSC ne doit pas dépasser 8. Pour assurer une croissance rapide des cultures cellulaires, toujours divisées à 1/3 de la culture cellulaire totale (à 70% -80% de confluence) à l’aide d’une nouvelle fiole tous les 3 à 4 jours.
3. Rincer la culture cellulaire confluente à 70 % à 90 % avec du PBS préavertissé (37 °C) (10 mL par flacon^de 75 cm 2). Ajouter une solution enzymatique dissociante (0,05 % de trypsine et 1 mM d’EDTA ; 1 mL par flacon^de 75 cm 2) et incuber pendant 3 à 5 min à 37 °C dans 5 % de CO₂, 95 % d’humidité pour le détachement cellulaire et vérifier le détachement cellulaire au microscope. Une fois cela fait, neutraliser la trypsine avec un milieu de culture cellulaire complet contenant 10 % de FBS (5 mL de milieu pour 1 mL de solution de dissociation).
  REMARQUE: Prévenir la surexposition des cellules à la solution enzymatique dissociante, car cela peut affecter leur viabilité.
4. Pour HUVEC cultivé dans un milieu à faible FBS, effectuer la neutralisation de la trypsine en ajoutant 0,5 mL de FBS à 100% à la culture cellulaire traitée à la trypsine, suivie d’une centrifugation pour transférer les cellules dans leur milieu de croissance.
  REMARQUE: La ou les suspensions cellulaires obtenues doivent contenir environ 1 million de cellules par 1 mL. Si nécessaire, une étape de centrifugation supplémentaire peut être ajoutée au protocole pour concentrer la suspension cellulaire.
5. Dissocier les agrégats cellulaires par pipetage à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL sur le dessus d’une pipette sérologique de 10 mL pour obtenir une suspension à cellule unique. Utilisez une chambre de comptage (hémocytomètre de type Neubauer ou alternatives) pour compter le nombre de cellules par 1 mL de la suspension cellulaire³⁴. Diluer la suspension cellulaire à 500 000 cellules par mL. Pour les hDPSC / HUVEC hétérocellulaires dans un rapport sphéroïde de 1:1, ajouter des volumes égaux de suspensions cellulaires correspondantes pour obtenir une concentration cellulaire finale de 500 000 cellules par mL.
  REMARQUE: La variation de la concentration cellulaire en suspension ajoutée à un tampon d’agarose à micro-motifs permet de modifier la taille moyenne des sphéroïdes produits, qui dépend d’un nombre de cellules par micropuit d’un tampon d’agarose. Dans la configuration décrite, des sphéroïdes d’environ 300 cellules sont générés à partir de 1 mL contenant 500 000 cellules sur un tampon d’agarose avec 1585 micropuits.
6. Ajouter la solution concentrée de sonde O₂ (nanoparticules, stock de 1 mg/mL) à la suspension cellulaire préparée à une concentration finale de 5 μg/mL.
  REMARQUE: La formation de sphéroïdes en présence de nanoparticules de détection O₂ permet une coloration efficace, qui est conservée pendant au moins 5 jours (Figure 1D). En revanche, la coloration des sphéroïdes multicellulaires préformés avec des nanoparticules sera moins efficace¹⁵.
7. Échangez 1 mL de milieux anciens dans un puits à micromotifs de plaques de culture cellulaire recouvertes d’agarose à 12 puits (voir étape 1.1.7) contre 1 mL de la suspension cellulaire préparée (500 000 cellules par 1 mL, avec sonde O₂ de 5 μg/mL). Cultivez les sphéroïdes dans un incubateur à CO₂ pendant 2 à 5 jours en présence continue de la sonde_O2pour assurer sa charge lors de la formation et du compactage des sphéroïdes.
  REMARQUE: Évitez l’évaporation excessive du milieu dans la culture sphéroïde. Si nécessaire, ajoutez soigneusement (ne pas déranger les sphéroïdes dans les micropuits) 0,2 à 0,5 mL de milieu de culture avec la dilution supplémentaire de la sonde O₂ .
8. Après la formation du sphéroïde, échangez le milieu de croissance avec un nouveau sans la sonde. La coloration de la sonde sera conservée dans les sphéroïdes générés pendant 7 à 14 jours ou plus, ce qui permettra une surveillance à long terme de ses signaux dans les sphéroïdes.

2. Bioimpression des sphéroïdes

REMARQUE: Les sphéroïdes sont bioimprimés dans une bioencre à base de gélatine modifiée par méthacrylamide (GelMA). Vous trouverez ci-dessous une description des ingrédients bioink, de la procédure de préparation bioink et de la bioimpression.

Préparation Bioink
1. Préparer une solution de GelMA à 10 % (p/v) (2 mL) dans un milieu sous un flux d’air laminaire³⁵ comme suit : peser 0,2 g de GelMA stérile avec un degré de substitution de 78 dans un tube de 15 mL, ajouter 1,9 mL de α-MEM et laisser dissoudre en mélangeant sur un agitateur rotatif à 37 °C (~2 h).
  REMARQUE: N’ajoutez pas la quantité totale de milieu, car d’autres composés tels que les sphéroïdes et le photo-initiateur Li-TPO-L seront ajoutés ultérieurement.
2. Remettre en suspension les sphéroïdes dans les puits à micromotifs par pipetage et les recueillir dans un tube de 15 mL. Effectuez un rinçage supplémentaire avec du PBS pour vous assurer que tous les sphéroïdes sont collectés dans les micropuits d’agarose. Évitez de toucher ou d’endommager les micropuits d’agarose, car des flocons d’agarose peuvent bloquer l’aiguille pendant la bioimpression.
3. Recueillir les sphéroïdes par centrifugation dans un tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant avec une pipette, ajouter 50 μL de milieu aux sphéroïdes et les remettre en suspension par pipetage doux.
4. Ajouter le mélange sphéroïde à la solution chaude de GelMA et mélanger par pipetage doux. Maintenir la concentration de sphéroïdes à 6340-12860 sphéroïdes (de 4-8 micromotifs) par mL de bioencre pour la bioimpression. Évitez les concentrations plus élevées de sphéroïdes car cela provoque facilement le blocage de l’aiguille d’impression.
5. Ajouter la solution mère li-TPO-L photo-initiatrice stérilisée par filtre (32 mg/mL) à une concentration finale de 2 mol% par rapport au nombre de doubles liaisons et mélanger par pipetage doux^36,37.
  REMARQUE: La quantité de Li-TPO-L peut être calculée selon l’équation:
  Volume du photoinitiateur (PI) = (0,000385 mol NH₂- groupes / g de GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / mL x 0,2 g GelMA = 0,0107 mL Li-TPO-L stock
Procédure de bio-impression
1. Reportez-vous aux étapes du Protocole additionnel 1 pour la conception de l’échafaudage en CAO. Pour bioimprimer le design, suivez les étapes ci-dessous.
2. Fermez l’extrémité d’une cartouche stérile de 3 cc avec un bouchon de pointe (verrou luer) et remplissez-la de bioink par pipetage. Insérez un piston dans la cartouche. Tenez la cartouche à l’envers et retirez le capuchon de pointe, poussez le piston vers la bioencre jusqu’à ce que tout l’air de la cartouche soit retiré.
  REMARQUE: Évitez le contact entre GelMA bioink et les côtés de la cartouche, car cela pourrait inhiber le mouvement du piston en raison de la gélification de la bioink.
3. Laissez la bioencre refroidir dans le manteau chauffant de la bioimprimante à 23 °C (20-30 min). Vissez un adaptateur de pression sur le dessus de la cartouche. Fermez le clip sur le tube d’entrée pour éviter les fuites de la bioencre, montez une aiguille PE conique de 22 G sur la cartouche. Adaptez la taille et le diamètre de l’aiguille à la conception de l’échafaudage, ainsi qu’au diamètre et à la concentration des sphéroïdes.
  REMARQUE: Portez un masque buccal et des gants pulvérisés pour éviter toute contamination.
4. Vaporisez la bioimprimante avec 70% d’éthanol et essuyez-la avec du papier absorbant. Installez la cartouche dans le manteau chauffant sur la tête d’impression à base d’extrusion. Branchez l’entrée de pression et ouvrez le clip sur l’entrée. Chargez le fichier G-code de votre conception dans le logiciel d’impression.
5. Commencez la mesure de la longueur de l’aiguille. Régulez la pression d’impression en distribuant un peu de bioencre dans une boîte de Petri stérile. Une pression d’impression de 0,025-0,045 MPa est typique pour l’impression de bioencres à base de GelMA³⁸.
6. Installez une plaque à 6 puits, ouvrez la plaque de puits, fermez le capot et commencez l’impression. Après l’impression, laissez les échafaudages être physiquement réticulés pendant 10 min à 5 °C et irradiez les échafaudages imprimés pendant 60 s avec une lampe LED UV (365 nm ; 500 mW selon le fabricant).
  REMARQUE: Le temps de réticulation UV dépend des propriétés de la lumière UV, du type et de la concentration de photo-initiateur, du degré de réticulation de l’échafaudage souhaité, du gonflement et du module d’élasticité.
7. Ajouter immédiatement le milieu de croissance correspondant contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (P/S) à tous les puits avec des grilles bioimprimées (2 mL par puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits).
8. Culture dans un incubateur à CO_{2 à} 37 °C jusqu’à ce que vous commenciez la microscopie. Pour la microscopie de construction bioimprimée, transférez une grille de gaufres imprimée dans une boîte de microscopie, couvrez-la avec un support d’imagerie et passez aux étapes 3.2 et 3.3.
  REMARQUE: Dans le cas de constructions bioimprimées flottantes, elles doivent être fixées dans la boîte de microscopie sans effet sur la viabilité cellulaire, par exemple avec de la colle cytocompatible. Pour le transfert de microscope inversé, la bioimpression dans une boîte à fond de verre de microscopie et le couvercle avec un support d’imagerie (~ 200-500 μL, voir la note à l’étape 3.1 pour la composition du support d’imagerie) pour éviter le flottement indésirable de l’échantillon. La coloration avec des sondes fluorescentes supplémentaires peut être effectuée dans la boîte de culture cellulaire avant le transfert des constructions bioimprimées dans des boîtes de microscopie (voir étape 3.1.6).

3. Microscopie vivante à fluorescence ratiométrique de l’oxygénation sphéroïde dans le tissu biofabriqué

REMARQUE: Pour convertir la réponse d’intensité ratiométrique (R) de la sonde O₂ en niveaux d’hypoxie réels, la réponse de la sonde doit être étalonnée à l’aide des procédures décrites au^{point 24}. Cependant, comme l’étalonnage ratiométrique est spécifique à l’instrument et nécessite l’installation d’un incubateur contrôlé T/O₂/CO₂ (pas toujours disponible), l’utilisation de la détection semi-quantitative des rapports est l’option privilégiée.

Préparation des sphéroïdes pour l’analyse d’imagerie en direct
1. Pour la fixation des sphéroïdes au cours de cette étape, pré-enduire les plats de microscopie stérile avec du collagène IV et / ou de la poly-D-lysine ou utiliser ceux disponibles dans le commerce³⁹. Vérifiez la compatibilité des antennes de microscopie avec la distance de travail et d’autres caractéristiques de l’objectif de votre microscope.
  REMARQUE: Dans le cas de l’imagerie multiparamètre, toutes les procédures de coloration supplémentaires doivent être effectuées dans les boîtes de la plaque de culture avec une quantité suffisante de milieux protégeant les cellules de l’évaporation, du choc osmotique ou d’un autre stress. Préparer et préchauffer le milieu d’imagerie avant utilisation : DMEM complété par du bicarbonate de sodium (1,2 g/L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pyruvate de sodium (1 mM), L-glutamine (2 mM) et glucose (5 mM), sans rouge phénol.
2. À l’aide d’une pipette de 1 mL, lavez doucement les sphéroïdes pré-colorés de la sonde O₂ des micropuits d’agarose. Pendant que les sphéroïdes flottent encore dans le milieu, transférez-les dans un tube inférieur conique de 15 mL.
3. Pour assurer la collecte de tous les sphéroïdes d’un puits à micromotifs, rincez le puits 1 à 3 fois avec le milieu de culture supplémentaire de 1 mL, en combinant toutes les suspensions sphéroïdes dans un seul flacon. Laissez le flacon en position verticale jusqu’à 10 minutes pour laisser les sphéroïdes se déposer sur le fond du flacon formant une pastille visible.
4. Retirez soigneusement le support du tube en laissant les sphéroïdes intacts. Remettez-les doucement en suspension dans la quantité de milieu de culture frais qui sera suffisante pour au moins 20 sphéroïdes par boîte d’échantillon de microscopie. Cela minimisera l’utilisation du milieu de culture et simplifiera la localisation des sphéroïdes pendant l’imagerie.
  REMARQUE: Utilisez la partie en silicium autoclavable de la plaque à 12 puits à chambre μ (voir tableau des matériaux) fixée au verre de couverture comme plat d’échantillon de microscopie (24 x 60 mm, épaisseur n ° 1) avec un volume maximal de support de 300 μL par puits. La partie en silicium de cette chambre de culture peut être stérilisée et réutilisée avec toute autre surface en plastique et en verre lorsqu’elle est collée au plat.
5. Ajoutez immédiatement un volume égal de suspension sphéroïde à chaque boîte / puits de microscopie. Laisser les sphéroïdes pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à CO₂ pour les fixer à la surface de la boîte de microscopie. Pour l’analyse de l’oxygénation couplée à l’utilisation d’autres colorants, passez à l’étape 3.1.6. Pour une analyse d’oxygénation simple, passez à l’étape 3.1.7.
  REMARQUE: Un temps d’incubation insuffisant (<1 h) peut entraîner une élimination et une perte occasionnelles de sphéroïdes pendant l’échange de médias, ce qui avorte votre expérience. Dans le même temps, la sur-incubation (>3 h) peut entraîner la perte partielle ou complète de leur organisation 3D en raison de la migration des cellules des sphéroïdes vers la surface de la boîte de microscopie et affecter leur oxygénation en temps réel.
6. (facultatif) Échangez soigneusement le milieu avec une ou plusieurs sondes fluorescentes contenant diluées à la concentration de coloration et poursuivez l’incubation pendant 1 h supplémentaire pour atteindre une intensité optimale. Pour éviter l’élimination des sphéroïdes lors de l’échange de milieux, aspirez soigneusement le milieu avec une pipette de 200 μL des bords des boîtes de microscopie et effectuez une addition de milieu latéralement dans la boîte de microscopie. Passez à l’étape 3.1.7.
  REMARQUE: Pour une coloration efficace avec des sondes ayant une mauvaise diffusion dans les agrégats multicellulaires, prolongez la concentration de charge et / ou le temps. Avant utilisation, déterminez les paramètres de chargement de sonde facultatifs dans les expériences préliminaires.
7. Retirez le milieu de la boîte de microscopie et rincez une fois avec un support d’imagerie. Ajouter la quantité exacte de milieux d’imagerie à l’échantillon (p. ex., 300 μL par micropuit de μ chambre d’une plaque de culture à 12 puits). Passez à l’étape 3.2.
Acquisition d’images
1. Allumez le microscope et les appareils connectés (c.-à-d. source de lumière d’excitation, caméra, ordinateur, incubateur et autres blocs électroniques de fonctionnement) 30 minutes avant l’imagerie pour vous réchauffer et s’équilibrer aux conditions de mesure (température, valeurs différentes de O₂, 5% de CO₂, humidité si nécessaire). Démarrez le logiciel d’exploitation de la microscopie fourni avec la configuration exacte du microscope.
  REMARQUE : Le protocole décrit est adapté pour le logiciel CellSens Dimension v.3.
2. Sélectionnez les filtres d’excitation (source, puissance) et d’émission appropriés ainsi que le temps d’exposition des sondes fluorescentes (ou phosphorescentes) choisies. Pour les analyses de microscopie multiparamétrique, 3D et time-lapse, écrivez le(s) protocole(s) de séquence de mesure automatisé(s) dans le logiciel de microscope opératoire.
3. Déterminer empiriquement les paramètres d’imagerie optimaux pour chaque sonde, modèle expérimental et lignée cellulaire dans des expériences préliminaires. Assurez-vous que les paramètres ont un minimum de photoblanchiment dans les canaux de référence (I_ref) et de détection O₂ (I_sens) et un effet minimal sur le rapport d’intensité (R = I_ref / I_sens), en particulier dans les expériences de mesure 3D et time-lapse.
4. Installez la boîte de microscopie avec des sphéroïdes colorés au stade de la microscopie. À l’aide de l’objectif à faible grossissement, prévisualisez l’échantillon en lumière de transmission, faites une mise au point préliminaire sur les sphéroïdes et localisez-les au centre de l’image.
  REMARQUE: Les objectifs d’air à grossissement standard de 4x à 10x suffiront pour la pré-mise au point, tandis que pour la mesure réelle, nous recommandons des objectifs de 20x à 40x avec une ouverture numérique (NA) de 0,6 ou plus (immersion dans l’air ou l’eau) ayant une distance de travail suffisante pour les sphéroïdes attachés à la parabole.
5. Apportez l’objectif avec le grossissement élevé requis à la position de travail. Concentrez-vous sur le mode de lumière de transmission dans la section transversale centrale (équatoriale) du sphéroïde. L’oxygénation dans les objets 3D dépend directement de la profondeur de la section d’imagerie. Pour ce faire, analysez des sections transversales similaires dans et entre les groupes, par exemple, les sections médianes et supérieures / inférieures des sphéroïdes.
  REMARQUE: Pour une analyse et une reconstruction détaillées et précises des gradients O₂ , nous vous recommandons de scanner et de produire des piles Z à l’aide de microscopes confocaux, à feuilles lumineuses ou à deux photons (meilleure option). Pour la microscopie conventionnelle à grand champ, où le signal de toutes les sections transversales sera collecté simultanément, une estimation moyenne par la section transversale moyenne plutôt qu’une analyse exacte des gradients O₂ peut être effectuée. Dans ce cas, la section médiane est définie comme une section focale, où les sphéroïdes ont un diamètre maximal avec une mise au point nette sur leurs bordures.
6. Ajuster les paramètres de collecte des signaux de fluorescence/phosphorescence des canaux spectraux de référence et sensibles de la sonde O₂ et d’autres sondes de fluorescence appliquées à l’imagerie multiparamétrique.
7. Pour la comparaison quantitative basée sur l’intensité, appliquez les mêmes paramètres d’imagerie choisis pour le temps d’exposition, la puissance de la source lumineuse d’excitation, la résolution, la vitesse de balayage et la taille du sténopé pour tous les objets mesurés en groupes.
  REMARQUE: De nombreuses versions de logiciels de microscopie fournies par le fournisseur permettent des calculs automatiques du rapport d’intensité. Appliquer la fusion de fonction aux mesures d’intensité des canaux de référence et sensibles de la sonde_O2 , lors de l’écriture du programme d’acquisition d’imagerie dans le gestionnaire expérimental du logiciel d’imagerie utilisé ici.
8. Collectez des images de la même section optique pour les canaux spectraux de référence et sensibles de la sonde O₂ et, si nécessaire, des canaux de fluorescence supplémentaires. Pour ce protocole, utilisez la sonde MMIR1 avec les spectres de référence rouge (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) et proche infrarouge O₂ sensible (exc. = 635 nm, em. = 760 nm).
9. Répétez les étapes 3.2.5 à 3.2.8 pour recueillir un nombre suffisant de points de données à des fins d’analyse statistique. Pour l’analyse dynamique des réponses cellulaires en évolution rapide lors d’un traitement avec différents médicaments, découplés mitochondriaux ou inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons et d’autres composés à action rapide, utilisez le mode de mesure time-lapse (étape 3.2.10).
10. Effectuer les mesures dans des milieux d’imagerie, à 37 °C avec un éclairage périodique de l’échantillon et recueillir les signaux des fluorophores d’intérêt (p. ex., canaux de référence et de détection de la sonde_O2 ), p. ex., toutes les 10 s pendant plus de 2 min.
11. Effectuez une vérification de la mise au point pour chaque sphéroïde une fois la mesure périodique effectuée pour vous assurer qu’il n’y a pas eu de dérive de mise au point pendant l’imagerie. Répétez l’opération si nécessaire. Passez à l’étape 3.3 pour l’analyse des données.
  REMARQUE: Sans stimulation cellulaire et ajout de médicament, une mesure en accéléré peut être effectuée pour évaluer la photostabilité, par rapport au colorant de référence, par exemple la fluorescéine, le vert de calcéine AM ou l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine.
Présentation de l’image
REMARQUE: Ici, nous décrivons comment calculer automatiquement O₂ rapport d’intensité de la sonde (R) dans les sphéroïdes à l’aide de la fonction d’analyse de rapport dans le logiciel d’imagerie et appliquer le calcul pixel par pixel R pour générer des images de distribution R fausse couleur de la section de microscopie sphéroïde. R peut également être calculé manuellement à partir des données d’intensité des canaux spectraux de référence et sensibles collectées à partir de la même région d’intérêt (ROI) de l’image sphéroïde par application de la formule simple R = I_ref/I_sens²⁴^,³⁴. S’il n’est pas possible d’extraire les données d’intensité de l’image brute dans le logiciel de microscopie correspondant, les données d’intensité peuvent être obtenues en utilisant des programmes tels que ImageJ ou Fiji (voir Discussion).
1. Ouvrez le fichier .vsi avec les données d’intensité de la sonde O₂ provenant de canaux spectraux de référence et sensibles en mode fusionné. Ouvrez la fenêtre de la fonction d’analyse de rapport dans le menu de mesure. Choisissez l’intensité du canal de référence comme numérateur et l’intensité du canal sensible comme dénominateur pour le calcul R.
  REMARQUE: Le rapport inversé des signaux de référence et sensibles pour le calcul de R est également possible, mais dans ce cas, R diminuera avec l’augmentation de O₂.
2. Appliquez les paramètres de seuil d’intensité correspondants à chaque canal spectral pour soustraire l’arrière-plan de l’image d’intensité fusionnée. Continuez à augmenter les valeurs de seuil jusqu’à ce que l’arrière-plan de l’image soit uniformément noir. Appliquez le paramètre de seuil de manière égale à toutes les images sphéroïdes de l’ensemble de données utilisé dans l’analyse comparative.
  REMARQUE: Utilisez la fenêtre d’aperçu pour optimiser les paramètres de seuil en observant l’image R en fausse couleur calculée préliminaire des sphéroïdes. Tous les pixels dont l’intensité est inférieure à la valeur actuelle dans le champ de seuil seront supprimés de l’analyse R et présentés sous forme de points noirs. Après l’application du seuil, seule la zone correspondant à la fluorescence sphéroïde doit être visualisée. L’estimation préliminaire de l’intensité moyenne de fond (zones sans sphéroïdes) des canaux spectraux indépendants simplifie le choix d’un seuil approprié à l’image. En outre, l’application de bordures de retour sur investissement sphéroïde, identifiées à partir de l’image sphéroïde de lumière de transmission correspondante à l’image de fluorescence fusionnée, aide à déterminer avec précision les paramètres de seuil afin d’éviter une soustraction excessive des intensités de signal hors fond.
3. Conservez les paramètres d’arrière-plan pour les intensités du numérateur et du dénominateur à 0, car l’arrière-plan a déjà été soustrait avec l’application du seuil.
4. Ajustez le facteur de mise à l’échelle (échelle) à l’image de ratio jusqu’à ce que l’image d’aperçu fournisse la résolution souhaitée du dégradé R. Appliquez le paramètre de mise à l’échelle de manière égale à toutes les images sphéroïdes de l’ensemble de données utilisé dans l’analyse comparative.
  REMARQUE : Le paramètre de mise à l’échelle doit être suffisamment grand (au moins 1 000) pour garantir que l’image R contient autant d’informations que possible et peut être considérée comme un facteur de résolution pour les données numériques R.
5. Appliquez les paramètres ajustés à l’image sphéroïde, en appuyant sur Appliquer. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image dans la fenêtre d’affichage Ajuster à partir du menu des fenêtres d’outils.
6. Déterminez manuellement les limites de liaison et de dissociation d’un histogramme de distribution de rapport à l’aide de l’option de mise à l’échelle fixe de la fenêtre Ajuster l’affichage. Cela déterminera la plage de la barre de fausses couleurs pour la présentation du paramètre R.
  REMARQUE: Pour comparer les images sphéroïdes entre différents groupes, il est important de conserver une plage de barres de couleur similaire pour tous les échantillons analytiques. Comme une plage de modifications du paramètre R peut être différente d’un groupe à l’autre, la plage de barres de fausses couleurs choisie doit être universelle pour les histogrammes de distribution dans tous les groupes analytiques.
7. Les sphéroïdes ne sont pas souvent idéalement sphériques, supposons que le diamètre du sphéroïde est la plus longue ligne tracée à travers le centre (souvent un noyau hypoxique) du sphéroïde. À l’aide de la fonction de règle linéaire du menu de mesure, déterminez le diamètre du sphéroïde. Exportez les données sous forme de fichier de table de feuille de calcul.
8. Choisissez le retour sur investissement d’une taille (aussi petite que possible) et d’une forme requises (par exemple, rond) et appliquez-le à la périphérie et au noyau hypoxique du sphéroïde. Transformez le ROI en objet de mesure pour analyser le R moyen (périphérique R-R_p et noyau R-R_c) à l’intérieur du ROI choisi. Exportez les données dans un format de tableau compatible avec les feuilles de calcul.
  REMARQUE: Les sphéroïdes n’ont pas de distribution_O2identique parmi le groupe et les noyaux hypoxiques ne colocalisent pas parfaitement avec les centres sphéroïdes. Pour simplifier et normaliser l’analyse, nous supposons que les zones les plus hypoxiques correspondent au noyau idéal au centre du sphéroïde. R_cmesuré dans ces zones est appliqué pour les calculs de la plage de gradient O₂ (R_p-R _c) et de la pente (R_p-R _c) / r, où r (idéalement, une distance entre la périphérie et le noyau hypoxique ROI) est un rayon approximatif du sphéroïde en μm calculé à partir des mesures de diamètre. En option, les gradients sphéroïdes O₂ peuvent être présentés sous forme de profils linéaires de modification du paramètre R (fenêtre de profil de ligne dans le menu de mesure) effectués le long du diamètre sphéroïde. Ces données peuvent également être exportées sous forme de fichier de table de feuille de calcul.
9. Appliquer des mesures à chaque section microscopique des sphéroïdes pour obtenir l’ensemble de données des diamètres des sphéroïdes, R_c et R_ppour effectuer d’autres calculs et comparaisons statistiques. Combinez toutes les données dans un seul fichier de feuille de calcul.
10. Pour l’analyse en accéléré du photoblanchiment ou des réponses dynamiques à différents stimuli, appliquez le retour sur investissement choisi aux mêmes coordonnées sur chaque image d’un ensemble. Pour comparer les paramètres R, présentez-les sous forme de pourcentage à partir du R du premier cycle dans un ensemble d’images time-lapse.
11. Pour l’analyse du photoblanchiment, utilisez R de plusieurs ROI pour calculer le R moyen en pourcentages pour chaque cycle time-lapse et suivre les changements.
12. Supposons que l’effet de photoblanchiment n’est pas critique s’il y a eu une diminution de moins de 5% de l’intensité initiale après 12 cycles d’éclairage continu. Comparez toujours les changements dynamiques avec une courbe de photoblanchiment comme contrôle pour assurer l’importance de la réponse temps-lapse ratiométrique (voir Figure 2A, B).
13. À partir des paramètres obtenus, calculer r, (R_p-R _c) et (R_p-R _c) / r pour les sphéroïdes individuels dans un ensemble de données. Analyser la normalité de la distribution des données par les tests Kolmogorov-Smirnov ou pertinents. Choisissez la méthode statistique appropriée pour l’analyse des données et procédez aux chiffres de présentation des données.
  NOTE: Les données présentées ici ont été normalement distribuées et un test t indépendant à p = 0,05 a été mis en œuvre pour la comparaison statistique entre les groupes sphéroïdes.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La production à haut débit de sphéroïdes pré-colorés de sonde O₂ à l’aide de la méthode de l’agarose à micromoulus est illustrée schématiquement à la figure 1C montrant des exemples de micropuits d’agarose sans et avec les sphéroïdes pré-colorés. L’efficacité de la formation de sphéroïdes sur le revêtement d’agarose et leur forme / sphéricité peuvent être spécifiques à la cellule. Par exemple, les cellules HCT116 du côlon humain n’ont jamais formé de structures sphériques idéales en utilisant la méthode des micropuits d’agarose, contrairement à la surface¹⁷ recouverte de lipides, alors que les hDPSC seuls et co-cultivés avec HUVEC ont toujours produit des sphéroïdes de forme et de taille hautement reproductibles proportionnelles à la composition cellulaire, au nombre de cellules initiales et à la durée de formation / croissance des sphéroïdes. Tous les types de cellules testés ont accumulé efficacement des nanoparticules de sonde O₂ lors de la formation de sphéroïdes (Figure 1B) et ont préservé cette coloration pendant au moins 5 jours, permettant leur utilisation pour la bioimpression et la surveillance ultérieure de l’oxygénation des tissus bioimprimés (Figure 1D).

figure-results-1
Figure 1 : Principe de la fonction de sonde_O2 et son application pour la coloration sphéroïde et la bio-impression. (A) Un diagramme de Yablonski simplifié, expliquant le principe de la détection de l’O2 par les sondes à nanoparticules phosphorescentes (NP). Le transfert d’énergie à_o2 moléculaire pendant l’état excité du triplet interdit (T) entraîne une diminution de l’intensité de phosphorescence inversement proportionnelle à la durée de vie de la phosphorescence tau, τ (passe de τ₁ à 0%_O2 à τ₂ à 21% O₂), qui est le temps entre l’excitation à l’état singulet (S₁) et son retour à l’état fondamental (G₀)⁴². La mesure quantitative de l’O2 peut être effectuée par mesure ratiométrique ou par mesure τ (mesures de la durée de vie de la phosphorescence). (B) Un exemple de coloration des sphéroïdes de cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) colorés avec différents types de sondes de nanoparticules O₂, montrés dans la lumière de transmission, la référence et les canaux de fluorescence des colorants sensibles à L’O₂. La barre d’échelle est de 100 μm. (C) Schémas de génération de sphéroïdes pré-colorés à haut débit de sonde O₂à l’aide de la méthode de l’agarose micromotif. De gauche à droite : tampon de silicium PDMS placé dans un puits de la plaque de culture, exemple de motif de micropuit dans l’agarose (grossissement 4x), et exemple de sphéroïdes pré-colorés MMIR1 produits à partir de cellules cancéreuses du côlon humain HCT116 le jour 2 après ensemencement sur agarose micromotif (grossissement 4x). La barre d’échelle est de 100 μm. (D) De gauche à droite: une analyse bio-imprimée de la gaufre et de la microscopie de la construction bio-imprimée de sphéroïde pré-coloré MMIR1 les jours 1 et 5 après la bioimpression. Le signal de fluorescence correspond au colorant phosphorescent sensible à l’O2 dans les nanoparticules MMIR1 (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). La barre d’échelle est de 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Sur la configuration microscopique décrite (microscope à fluorescence à grand champ conventionnel équipé de la diode électroluminescente (LED) comme source lumineuse), la sonde MMIR1 rouge / proche infrarouge a été trouvée comme la meilleure en termes de photostabilité de ses colorants de référence et sensibles avec une diminution de moins de 5% de la luminosité de leur rapport d’intensité initial (R = I_ref / I_sens ) après 12 cycles d’éclairage continu. Cela a permis d’utiliser la sonde MMIR1 pour l’étude dynamique en temps réel de la réponse respiratoire rapide dans les sphéroïdes hDPSC lors d’un traitement par découpleur mitochondrial (FCCP) et inhibiteur du complexe I de la chaîne de transport d’électrons (roténone) (Figure 2A, B). Nous avons constaté que dans les sphéroïdes dérivés de cellules souches, le FCCP n’a montré qu’un léger effet de découplage avec une légère diminution de la respiration cellulaire dans les ~ 80 s après l’ajout de ce médicament, en accord avec les caractéristiques métaboliques précédemment rapportées de DPSC⁴⁰. D’autre part, la roténone a fortement inhibé la respiration, ce qui a entraîné la réoxygénation des sphéroïdes (reflétée par l’augmentation du rapport R_p - périphérie sphéroïde et du rapport R_c - noyau sphéroïde) et la dissipation des gradients périphérie-noyau O₂ dans les ~80 s après la stimulation (Figure 2A). Le semi-étalonnage en deux points du rapport de sonde MMIR1 (R) à haut (atmosphérique) et faible (en présence de sulfite de sodium et de glucose oxydase dans les milieux d’imagerie) O₂ a confirmé la diminution de R, liée à la diminution de l’oxygénation dans les sphéroïdes avec respiration préliminaire inhibée par un traitement cocktail antimycine A/roténone (Figure 2C ), illustrant comment la mesure de la sonde MMIR1 R peut être appliquée pour la surveillance semi-quantitative des réponses à long terme à l’état d’équilibre et à l’oxygénation rapide en 3D.

figure-results-2
Figure 2 : Analyse cinétique de la réponse de la sonde_O2 à différents stimuli. (A) Résultat représentatif de l’imagerie de l’oxygénation sphéroïde hDPSC au repos et en réponse aux traitements FCCP et roténone. La barre d’échelle est de 100 μm. (B) Réponse cinétique du rapport d’intensité MMIR1 au traitement FCCP et roténone par rapport à la cinétique initiale du rapport d’intensité de photoblanchiment (%). (C) Changements dans les images de rapport d’intensité de la sonde MMIR1 dans les sphéroïdes hDPSC aux états oxygénés (ajout d’antimycine A + roténone) et désoxygénés (ajout de glucose oxydase). La barre de couleur représente le rapport d’intensité de la sonde O₂ (R = I_ref / I_sens) répartis sur l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour illustrer l’application de la sonde MMIR1 pour l’imagerie métabolique vivante, l’analyse comparative des gradients O₂ dans les sphéroïdes hDPSC homocellulaires par rapport aux sphéroïdes hDPSC/HUVEC hétérocellulaires (1:1) a été effectuée. En tirant parti de la disponibilité de canaux spectraux de fluorescence bleus et verts libres, la co-coloration avec Hoechst 34580 (HXT) et SYTOX Green (SYTOX) a été réalisée pour démontrer l’application de la sonde O₂ pour les études multiparamétriques (Figure 3). À l’aide du protocole automatisé de calcul du rapport d’intensité pixel par pixel fourni par le logiciel d’imagerie, des images de rapport de fausses couleurs de la distribution R dans les sphéroïdes ont été produites, visualisant les gradients O₂ périphériques-core détectés en temps réel dans tous les types de sphéroïdes: avec la périphérie oxygénée et les niches hypoxiques au centre (Figure 2 et Figure 3A). Cependant, les valeurs R_p et R_c , ainsi que la pente du gradient_O2 dans les sections transversales moyennes variaient pour différents types de sphéroïdes : voir les profils linéaires des sections médianes dans les sphéroïdes hDPSC par rapport aux sphéroïdes hDPSC/HUVEC et les sphéroïdes hDPSC bioimprimés (Figure 3B, C). Comme il n’y avait pas de façon largement acceptée de décrire les gradients O₂ , nous avons introduit plusieurs paramètres permettant une comparaison facile et une description détaillée de l’oxygénation générale des sphéroïdes: R_p et R_c, et des caractéristiques des gradients O₂ comme une différence entre les zones oxygénées et hypoxiques comme (R_p-R _c), et les changements moyens d’oxygénation par μm comme (R_p-R _c) / r, où r est une distance entre la périphérie et le noyau hypoxique, corrélée dans la section médiane avec le rayon sphéroïde (Figure 3D). La comparaison statistique de ces paramètres ainsi que les données des cellules mortes nécrotiques visualisées par SYTOX dans les sphéroïdes nous ont aidés à tirer des conclusions préliminaires sur l’origine des gradients de distribution O₂spécifiques au type de cellule sphéroïde.

figure-results-3
Figure 3 : Analyse comparative des gradients d’oxygénation dans les sphéroïdes. (A) Exemples représentatifs de microscopie vivante de l’oxygénation (microscopie à fluorescence ratiométrique de MMIR1) et de la coloration des cellules vivantes/mortes (Hoechst 34580, HXT, bleu et SYTOX Vert, SYTOX) dans les sphéroïdes hDPSC homocellulaires avant et après l’impression, et les sphéroïdes hétérocellulaires hDPSC/HUVEC (1:1). Les hDPSC dans tous les types de sphéroïdes provenaient de la même culture cellulaire. Les sphéroïdes ont été pré-colorés avec 5 μg/mL de sonde MMIR1 pendant 2 jours pendant leur formation, puis utilisés soit pour l’imagerie ou la bio-impression (uniquement les sphéroïdes hDPSC), avec une analyse d’imagerie ultérieure le jour 1 après la bioimpression. Les images en fausses couleurs du rapport d’intensité (I_ref/I_sens) des sphéroïdes colorés MMIR1 correspondent à leurs gradients O₂périphérique-noyau. La barre d’échelle est de 100 μm. La barre de couleur représente la distribution du rapport d’intensité de la sonde O₂ (R = I_ref/I_sens) sur l’image. Les numéros 1 et 2 des sections transversales de diamètre correspondent aux profils d’intensité indiqués dans B et C. (B,C) Comparaison des profils de rapport d’intensité entre les sphéroïdes hDPSC homogènes par rapport aux sphéroïdes hétérogènes hDPSC/HUVEC (B) et aux sphéroïdes hDPSC homogènes avant et après la bioimpression (C). Les profils ont été mesurés pour les coupes transversales des sphéroïdes indiquées sur (A). (D) Représentation schématique des paramètres utilisés pour la description des gradients O₂ de la périphérie au noyau dans les sphéroïdes, où r est un rayon de sphéroïde et R_p et R_c sont des rapports d’intensité de la périphérie et de la région centrale du sphéroïde en conséquence. La barre de couleur représente schématiquement la distribution du gradient_O2des niveaux élevés (rouge) à bas (bleu) dans un sphéroïde idéalement sphérique. (E,F) Analyse comparative des gradients O₂ de la périphérie au noyau (R_p-R _c) / r dans les sphéroïdes hDPSC/HUVEC et hDPSC (E) et dans les sphéroïdes hDPSC avant et le jour 1 après la bioimpression (F). Une analyse statistique a été effectuée pour une répétition expérimentale (n = 18-23). Les cases correspondent à des écarts-types. Les astérisques indiquent la différence statistique entre les groupes (à p = 0,05); ** = p < 0,0005. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Par rapport aux sphéroïdes hDPSC homocellulaires, les sphéroïdes hDPSC/HUVEC avaient des gradients significativement plus raides : valeurs plus élevées de (R_p-R _c) / r paramètre et plage (R_p-R _c; Figure 3F). En même temps, ils ont montré une oxygénation plus élevée de la périphérie (R_p) et du noyau (R_c) (figure 4A, tableau 1). Fait intéressant, ils étaient également statistiquement plus importants (figure 4A, tableau 1), ce qui suggère que de telles différences d’oxygénation étaient causées par leurs différents profils bioénergétiques cellulaires. Ces données sont en accord avec les caractéristiques métaboliques bien connues des cellules HUVEC ayant généralement une activité respiratoire plus faible des cellules avec une forte dépendance à la glycolyse et aux voies pentose-phosphate comme principales sources bioénergétiques d’ATP et de NAD(P)H⁴¹. Dans le même temps, le gradient_O2 périphérique-noyau prononcé formé dans les sphéroïdes hétérogènes est probablement généré par hDPSC dans leur composition, caractérisé par des mitochondries hyperpolarisées et une chaîne de transport d’électrons active⁴⁰ et, selon les résultats sur l’oxygénation des sphéroïdes hDPSC, ayant une forte activité respiratoire (Figure 3, Figure 4A et Tableau 1 ). Ainsi, une viabilité généralement plus élevée des sphéroïdes hDPSC/HUVEC confirmée par la faible intensité de leur coloration des cellules mortes avec SYTOX (Figure 3A) est potentiellement liée à leurs niveaux d’oxygénation plus élevés.

Pour illustrer l’applicabilité de l’imagerie microscopique vivante de l’oxygénation des sphéroïdes dans la biofabrication, des sphéroïdes précolorés MMIR1 O₂ ont été utilisés pour la bioimpression dans gelma bioink avec la comparaison suivante des gradients_O2 dans les sphéroïdes hDPSC avant et le jour 1 après la bioimpression (Figure 3A, C, F, Figure 4B et Tableau 2). Les sphéroïdes hDPSC bioimprimés avaient une périphérie significativement oxygénée (R_p plus élevé) par rapport aux sphéroïdes, mesurés avant la bioimpression, tandis que leur oxygénation du noyau avait des valeurs similaires (Figure 4B). Les changements dans leur oxygénation périphérique affectent la plage (une augmentation de (R_p-R _c) et la pente (augmentation (R_p-R _c)/r) de leurs gradients O₂ de la périphérie au noyau, qui étaient statistiquement différents des sphéroïdes hDPSC mesurés avant la bioimpression (Figure 3F et Figure 4B). La coloration des cellules mortes était généralement plus brillante dans les sphéroïdes bioimprimés, ce qui suggère que la diminution de la viabilité des sphéroïdes est impliquée dans l’altération de l’oxygénation des sphéroïdes (Figure 3A).

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Figure 4 : Analyse comparative du diamètre et du rapport d’intensité des sphéroïdes colorés par MMIR1. (A) Comparaison entre les sphéroïdes hétéro- hDPSC/HUVEC et les sphéroïdes hDPSC homocellulaires. (B) Comparaison des sphéroïdes hDPSC homocellulaires avant et après la bioimpression. R_p et R_c - rapport d’intensité à la périphérie et au noyau des sphéroïdes en conséquence; (R_p-R _c) - la différence de rapport d’intensité, correspondant à la plage de gradient_O2 dans les sphéroïdes. Une analyse statistique a été effectuée pour une réplique expérimentale (n = 18-23). Les cases correspondent à des écarts-types. Les astérisques indiquent la différence statistique entre les groupes (à p = 0,05), où * = p < 0,005 et ** = p < 0,0005. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Type de sphéroïde (N)	Diamètre [μm]	R_p [a.u.]	R_c [a.u.]	R_p-R _c [a.u.]	(R_p-R _c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18)	113,2 ± 10,6	0,779 ± 0,034	0,398 ± 0,055	0,982 ± 0,051	0,00677 ± 0,00091
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0,00520 ± 0,00090
valeur de p	1,5 x ^10-8 *	1,5 x ^10-21 *	1,3 x ^10-4 *	1,4 x ^10-12 *	9,2 x ^10-6 *

Tableau 1. Diamètre des sphéroïdes, rapport d’intensité au cœur (R_c) et à la périphérie (R_p) des sphéroïdes, différence de rapport d’intensité (R_p-R _c) et (R_p-R _c) / r dans les sphéroïdes hDPSC/HUVEC hétérogènes et homogènes. La valeur p d’un test t sur N sphéroïdes démontre une différence statistique et est également indiquée par un astérisque.

Type de sphéroïde (N)	Diamètre [μm]	R_p [a.u.]	R_c [a.u.]	R_p-R _c [a.u.]	(R_p-R _c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0,00520 ± 0,00090
HDPSC bioimprimé (23)	80,9 ± 12,5	0,584 ± 0,023	0,323 ± 0,038	0,261 ± 0,039	0,00658 ± 0,00144
valeur de p	0.054	0.0024 *	0.46	9,9 x ^10-4 *	6,3 x ^10-6 *

Tableau 2. Diamètre des sphéroïdes, rapport d’intensité au cœur (R_c) et à la périphérie (R_p) des sphéroïdes, différence de rapport d’intensité (R_p-R _c) et (R_p-R _c) / r valeur dans les sphéroïdes hDPSC homogènes avant et après la bioimpression. p-valeur de l’analyse statistique (N sphéroïdes). La différence statistique est indiquée par un astérisque.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Importance. La mesure de l’oxygénation des tissus donne un aperçu du métabolisme cellulaire et tissulaire spécifique, de la croissance et du développement des tissus, de la viabilité, de la tumorigenèse et de la migration cellulaire, ainsi que de l’interaction avec les microbes et autres agents pathogènes. La méthode présentée donne un nouvel outil pour mieux comprendre la physiologie des cultures sphéroïdes multicellulaires: analyse de l’oxygénation avec des sondes ratiométriques de nanoparticules O₂ et fournit des moyens d’évaluer l’hypoxie, de visualiser la dépendance à des voies de production d’énergie particulières et complète les études de modélisation et les approches alternatives d’imagerie métabolique^43,44 sur un microscope à fluorescence à faible coût largement disponible. Les mesures ratiométriques peuvent être effectuées sur un large champ de fluorescence (excitation LED pulsée de préférence), des microscopes confocaux à balayage laser, à feuille de lumière et à deux photons, idéalement équipés de chambres d’incubateur T et O₂. Il est important de noter que la mesure microscopique O₂ présentée peut être facilement combinée avec l’analyse multiparamétrique en direct de divers paramètres physiologiques et traceurs cellulaires (dans le cas de cultures hétérocellulaires de sphéroïdes), la viabilité (coloration vivante / morte), le métabolisme des lipides (sondes fluorescentes à détection de lipides), la dynamique du pH (colorants, nanoparticules et protéines fluorescentes) ou [Ca²⁺ ], réalisée dans les canaux spectraux de fluorescence disponibles ou en parallèle, donnant une vue élargie de la fonction cellulaire en temps réel dans les sphéroïdes, les constructions bioimprimées et les greffes de tissus potentielles.

Les cultures de sphéroïdes sont utilisées dans les études sur les cellules cancéreuses, le microenvironnement de niche des tumeurs et des cellules souches, les tumoroïdes, l’efficacité des médicaments et le dépistage de la toxicité, ainsi que comme éléments constitutifs des tissus pour la biofabrication et l’auto-assemblage des tissus⁴⁵. Ils peuvent être générés à partir de plusieurs types de cellules par une variété d’approches différentes⁴⁶. La popularité du modèle sphéroïde nécessite leur normalisation du point de vue de l’intégrité de la recherche et de l’amélioration de l’analyse des données, ce qui a été récemment tenté par le développement de la première base de données sphéroïde⁸.

Notre protocole devrait aider à mieux comprendre le métabolisme des sphéroïdes vivants, à normaliser ce modèle expérimental et, par la suite, à améliorer leur stabilité, leur reproductibilité et leur viabilité à long terme dans les matériaux bioimprimés et implantables.

Modifications. Ce protocole décrit l’utilisation d’une surface d’agarose à faible adhérence à micromoulus (formation à base de micromoulage²⁹) pour la génération à haut rendement de sphéroïdes chargés par sonde O₂pour l’analyse de l’oxygénation. Les méthodes alternatives de production de sphéroïdes telles que la goutte suspendue, l’application de plaques de fixation ultra-faibles, le revêtement lipidique ou la formation flottante sont également compatibles avec le protocole de chargement de sonde O₂ suggéré. Le protocole présenté a été optimisé pour les sphéroïdes hDPSC et les sphéroïdes de co-culture de hDPSC avec HUVEC (1:1). D’autres lignées cellulaires sont certainement applicables ^15,17,47,48; cependant, une certaine optimisation du protocole peut être nécessaire en raison des différentes propriétés d’adhésion cellulaire, des conditions de culture, des exigences du substrat métabolique et de la compatibilité cellulaire avec la coloration des nanoparticules. Le choix d’une sonde ratiométrique appropriée à base de_{nanoparticules O 2} sensibles doit être fait en fonction du modèle de cellule spécifique et des propriétés de photoblanchiment de la sonde à la configuration microscopique utilisée (intensité et type de la source lumineuse, sensibilité spectrale de la caméra) et de la disponibilité de filtres d’excitation/émission appropriés pour les canaux spectraux de référence et sensibles à O₂ correspondants de la sonde.

Certaines sondes ratiométriques O₂ sont disponibles dans le commerce². Alternativement, ils peuvent être préparés en interne par co-précipitation de colorants de référence et sensibles à l’O2 avec un polymère tel que décrit ailleurs 24,25,49. Pour chaque modèle individuel, les essais préliminaires doivent être effectués afin de déterminer la sonde appropriée et les conditions de microscopie optimales et de minimiser l’effet du photoblanchiment de la sonde ou de la consommation photoinduite d’O₂ lors des mesures ratiométriques. Des études antérieures sur les nanoparticules de détection de l’O₂ ont démontré leur faible toxicité cellulaire, permettant une application dans une large gamme de concentrations de coloration (1-20 μg / mL). Comme certaines nanoparticules cationiques peuvent s’auto-agréger pendant le stockage, nous recommandons de maintenir leur concentration de charge aussi faible que possible afin de minimiser leur effet potentiel sur la formation de sphéroïdes. En option, la suspension de nanoparticules peut être filtrée (0,2 μm) ou éliminée par centrifugation (10 000 x g, 5 min) avant utilisation pour retirer tous les agrégats de la suspension.

Bien que les logiciels BioCAD et HMI soient spécifiques à la bioimprimante présentée, ce protocole s’applique à d’autres bioimprimantes, car la préparation de la bioencre, l’assemblage, le remplissage d’une cartouche standard et la conception d’un échafaudage en hydrogel poreux sont fournis. En outre, les paramètres de bio-impression tels que la vitesse d’impression et la température doivent être comparables pour différentes bioimprimantes à base d’extrusion. La pression d’impression et le diamètre de la jambe de force dépendent du type et du diamètre de l’aiguille, de la composition de la bioencre, de la température et de la viscosité résultante, mais ils peuvent être un point de départ pour optimiser les paramètres d’impression pour bioimprimer les bioencres à base de GelMA avec différentes bioimprimantes, bien que certaines bioimprimantes utilisent des broches au lieu de la pression d’air pour extruder la bioencre⁵⁰.

Étapes critiques et dépannage. L’une des étapes critiques est le choix de la sonde O₂ , qui repose sur les considérations suivantes: premièrement, la configuration disponible du microscope à fluorescence (c’est-à-dire source lumineuse d’excitation compatible, filtres d’excitation et d’émission, sensibilité de la caméra et transmittance spectrale et ouverture numérique de l’objectif), qui peut limiter le nombre de sondes disponibles en ce qui concerne leur photostabilité, luminosité et phototoxicité potentielle. Il est également important de noter que certains types d’huile d’immersion (dans le cas d’objectifs d’immersion dans l’huile) peuvent interférer avec les signaux de fluorescence rouge et infrarouge. Nous considérons que les tests de photostabilité sont très importants et qu’ils doivent être effectués lors de la configuration initiale et des tests préliminaires. La diaphonie spectrale potentielle entre les canaux fluorescents et les différents colorants doit être prise en compte. En effet, la toxicité potentielle sombre et photoinduite de la sonde_O2 et d’autres colorants sélectionnés, par rapport au modèle cellulaire spécifique, doit être évaluée lors de l’optimisation du protocole⁵¹. Le problème spécifique pour les nanoparticules peut être leur auto-agrégation, qui peut être atténuée en optimisant leur concentration de travail, la composition du milieu de coloration (par exemple, la teneur en sérum), la sonication des nanoparticules avant le mélange avec le milieu ou en utilisant des cellules pré-colorées et lavées à sonde O₂ pour la formation de sphéroïdes au lieu de la charge de sonde pendant la procédure de formation et de compactisation des sphéroïdes.

Nous n’avons pas observé de problèmes associés à la profondeur de pénétration de la lumière avec les modèles sphéroïdes décrits, mais cela doit être pris en compte lors du choix des signaux d’intensité ratiométrique, de la taille des constructions sphéroïdes et biofabriquées (greffes de tissus) et de l’optimisation de la coloration cellulaire avec les colorants respectifs. La sonde MMIR1 ayant des longueurs d’onde d’émission rouges et proche infrarouges étroitement correspondantes devrait fournir le fond le plus bas et la meilleure pénétration de la lumière tissulaire, par rapport aux autres sondes de biocapteurs fluorescents émettant du rouge / bleu ou du vert.

La production et la gestion des images de ratio (et potentiellement le démixage spectral ou la déconvolution) peuvent être effectuées dans un logiciel fourni par le fournisseur ou dans les options opensource telles que ImageJ, Fiji ^52,53, napari (https://napari.org), MATLAB et autres. Une étape critique consistera à soustraire l’arrière-plan et à mesurer les changements d’intensité du signal dans une plage linéaire.

Étalonnage de la sonde_O2: La roténone et l’antimycine A sont des inhibiteurs des complexes I et III de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, respectivement, bloquant la respiration cellulaire ^54,55,15 et induisant la dissipation des gradients O ₂ dans les sphéroïdes et leur équilibrage avec l’environnement O₂. Ainsi, la modification de la concentration d’O2 dans l’environnement (c.-à-d. 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0 % O₂) permettra l’étalonnage de l’intensité ratiométrique ou de la durée de vie de la phosphorescence de la sonde sensible à l’O₂ dans les cellules. En règle générale, les incubateurs contrôlés par O₂ ne sont pas en mesure d’atteindre un taux absolu de 0% O₂ et dans certaines situations, un test rapide de la réponse de la sonde à la désoxygénation est nécessaire. Dans de tels cas, 25-100 μg/mL de glucose oxydase ou de Mélange Na₂SO₃/_K2HPO₄ (50 mg/mL pour chaque composé pour une solution 10x dans de l’eau distillée) doivent être ajoutés à l’échantillon. Il est important de noter que si la lignée cellulaire a un degré significatif de consommation d’O₂ non mitochondriale, tenez-en compte lors de l’exécution d’expériences d’inhibition de la respiration et d’étalonnage.

Limites et recherches futures. La principale limite de la méthode proposée et de la détection ratiométrique en général est l’étalonnage et la conversion des niveaux de rapport observés en niveaux réels d’O₂ , ce qui, en raison des différences intrinsèques dans les paramètres d’acquisition d’images du matériel et de l’utilisateur, rendrait l’étalonnage du ratio spécifique à l’instrument et à la cellule. Il est important de noter que pour un microscope à fluorescence à grand champ et une configuration décrite, les images de rapport reflètent des projections combinées plutôt que des sections optiques idéales et l’étalonnage O₂ n’aurait pas de sens. D’autre part, nous montrons que les mesures de ratio semi-quantitatives fournissent un phénotypage comparatif statistiquement significatif et facile à mesurer des sphéroïdes produits à partir de diverses sources et présentant des différences d’oxygénation.

Les recherches futures visant à rendre les approches de microscopie plus accessibles et abordables conçues pour les objets 3D vivants tels que SPIM, feuille de lumière, thêta, imagerie à vie à deux photons et luminescence, combinées à l’apprentissage automatique ^{56,57,58,59,19}, aideront à apporter l’imagerie multiparamétrique O₂ à des applications encore plus quantitatives.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la subvention du Fonds spécial de recherche de l’Université de Gand (BOF/STA/202009/003) et le programme ITN du 7e PC de l’UE « Chebana », convention de subvention n° 264772 (pour AVK). Les données sont disponibles sur demande. Le code G pour la bio-impression est disponible pour le partage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % Trypsine-EDTA	Gibco	25300-054	Également disponible chez Sigma Plaques de
culture cellulaire à 12 puits, stériles	Greiner bio-one	665-180	Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning et d’autres sociétés.
Lame de chambre à 12 puits, amovible	Ibidi	81201	Également disponible chez Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific et autres
Tubes à centrifuger de 15 mL	Nerbe plus	02-502-3001	Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Cartouche 3cc, sécurité UV, luer lock	RegenHU	C-033CC-UV	Également disponible chez CelIink et autres
3D Discovery Bio-imprimante	RegenHU	N/A	Bio-imprimante équipée d’une tête d’impression par extrusion, d’un manteau chauffant, d’une lampe de séchage UV-LED, d’un logiciel IHM 3D Discovery (logiciel CAD/CAM avec contrôle direct de la machine) et d’un logiciel BioCAD (version 1.1-12)
Plaques de culture cellulaire à 6 puits, stériles	Greiner bio-one	657160	Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Antimycine A de Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG	Utilisé comme inhibiteur du complexe III de la chaîne de transport d’électrons mitochondrial, bloquant la respiration cellulaire
B-Braun Tip Cap, luer lock	RegenHU	TC-BB-B	Également disponible chez Regemat, Cellink et autres
Boîte de culture cellulaire à vue cellulaire, PS, 35/10mm, fond en verre, 1 compartiment, stérile	Greiner bio-one	627861	Pour la microscopie de sphéroïdes
bio-imprimésCollagène du placenta humain, type IV	Sigma	C5533	Pour la préparation de 0,07 mg/mL de collagène et de 0,03 mg/mL de boîtes de microscopie recouvertes de poly-D-D-lysine
D(+)-Glucose	Merck	8342	Préparer une solution mère 1M, 1/100 pour la préparation d’un milieu d’imagerie (concentration finale 10m)
Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), Sigma-Aldrich sans rouge de phénol, sans glucose, sans pyruvate et sans glutamine		D5030-10X1L	Pour la préparation du milieu d’imagerie
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Également disponible chez Lonza et autres
Endothelial Growth SupplementMix	PromoCell	C-39216	Également disponible chez Lonza et autres
FCCP, Carbonyl cyanure 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920-10MG	Utilisé comme découpleur mitochondrial
Sérum fœtal bovin	Gibco	10270-098	Également disponible chez Sigma
	GelMA N/A	N/A	GelMA a été synthétisé par le groupe PBM (Prof Dr Peter Dubruel et Sandra Van Vlierberghe, Université de Gand) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] mais sont également disponibles chez Xpect Inx
Glucose-oxydase d’Aspergillus nige (10000 u)	Sigma-Aldrich	G7141	Utilisé pour tester la réponse de la sonde à la désoxygénation
GlutaMAX 100x Supplément	Gibco	35050-038	Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 2mM)
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 10mM)
Hoechst 34580	Invitrogen (Life Technologies)	H21486	Également disponible chez Sigma, BDBiosciences et d’autres
cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC)	Lonza	PT-5025	Également disponible auprès de l’ATCC ou d’autres fournisseurs
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)	Lonza	CC-2517	Également disponible auprès de l’ATCC ou d’autres fournisseurs
KH2PO4 (dihydrogénophosphate de potassium)	Merck	4873	Pour la préparation d’une solution de sulfite de sodium (5 mg/mL de Na2SO3 et 5 mg/mL de KH2PO4). Préparez quotidiennement une solution mère concentrée fraîche à partir de 10 fois.
Li-TPO	N/A	N/A	Li-TPO-L a été synthétisé par le groupe PBM (Prof Dr Peter Dubruel et Sandra Van Vlierberghe, Université de Gand) ; [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] mais des photo-initiateurs comparables sont disponibles chez Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium	Gibco	32561-029	Également disponible chez Sigma et autres
Tampons PDMS imprimés en 3D à micro-motifs, puits d’un diamètre 400 & micro ; m, épaisseur, nombre total de puits 1585	par l’auteur		Ces timbres ont été fabriqués par le Centre de technologie des microsystèmes (professeur Jan Vanfleteren, Université de Gand) mais peuvent également être obtenus commercialement auprès de Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed sphéroïde kit)
Na2SO3 (sulfite de sodium)	Sigma-Aldrich	239321-500G	Pour la préparation d’une solution de sulfite de sodium (5 mg/mL de Na2SO3 et 5 mg/mL de KH2PO4). Préparez quotidiennement une solution mère concentrée fraîche à partir de 10 fois.
Sondes O2 : MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+	N/A	N/A	Peut être préparée ' en interne » à l’aide de colorants, de polymères et de méthodes de précipitation disponibles dans le commerce [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Certaines nanoparticules sont disponibles dans le commerce, comme nous l’avons vu dans [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :P énicilline (10 000 U/mL) / streptomycine (10 000 &mu ; g/mL) Solution 100x	Gibco	15140-122	Également disponible chez Sigma . Appliquer en dilution Boîtes de Pétri 1:100
, stériles	Greiner bio-one	633181	Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Piston pour cartouche 3cc	RegenHU	P-03CC-UV	Également disponible chez Cellink, Regemat et autres
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	Pour la préparation de 0,07mg/mL de microscopie enrobée de collagène et 0,03mg/mL de microscopie enrobée de poly-D-lysine paraboles
PVDF filtre seringue 0.22 & micro ; m	Novolab	A35149	Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G	Utilisé comme inhibiteur du complexe I de la chaîne de transport d’électrons mitochondrial, bloquant la respiration cellulaire
Pyruvate de sodium (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 1mM)
SYTOX Green	Invitrogen (Life Technologies)	S7559	Également disponible chez Sigma, Promega et autres
Pointe conique de calibre 22 (aiguille PE conique	Amada Myachi Europe	22K62222	Des produits similaires sont également disponibles chez RegenHU, Cellink, Regemat et autres
Flacon de culture tissulaire (75 cm2)	VWR	734-2313	Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Autres types d’agarose tels que l’agarose à bas point de fusion (A-9414, Sigma), l’agarose à usage courant (A-9539, Sigma)
Microscope inversé à fluorescence à grand champ	Olympus	N/A	Microscope à fluorescence inversée IX81, avec contrôle motorisé de l’axe Z, CoolLED pE4000 (16 canaux, 365-770 nm), caméra cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), plaque chauffante en verre Okolab, logiciel CellSens Dimension v.3 et objectifs aériens 4x/0.13 UPlanFLN et 40x/0.6 LUCPlanFLN. (En option, pour l’imagerie haute résolution) 60x/1.0 LUMPLFLN eau

Fabriqué

Références

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Biofabrication de sph ro des culture cellulaire 3D imagerie du gradient d oxyg ne microscopie fluorescence oxyg nation des sph ro des constructions bio imprim es sonde d oxyg ne ratiom trique caract risation du ph notype des sph ro des

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

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