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Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D

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DOI :

10.3791/63430

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31 mars 2022

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1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.

Résumé

Les cellules stromales/souches (ASC) dérivées des adiposes sont une sous-population de cellules présentes dans la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sous-cutané humain reconnu comme une source classique de cellules stromales/souches mésenchymateuses. De nombreuses études ont été publiées avec des ASC pour des approches d’ingénierie tissulaire basées sur des échafaudages, qui ont principalement exploré le comportement de ces cellules après leur ensemencement sur des échafaudages bioactifs. Cependant, des approches sans échafaudage émergent pour concevoir des tissus in vitro et in vivo, principalement en utilisant des sphéroïdes, afin de surmonter les limites des approches basées sur des échafaudages.

Les sphéroïdes sont des microtissus 3D formés par le processus d’auto-assemblage. Ils peuvent mieux imiter l’architecture et le microenvironnement des tissus natifs, principalement en raison du grossissement des interactions de cellule à cellule et de matrice de cellule à extracellulaire. Récemment, les sphéroïdes sont principalement explorés en tant que modèles de maladies, études de dépistage de médicaments et éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Cependant, pour les approches de bio-impression 3D, de nombreux sphéroïdes, de taille et de forme homogènes, sont nécessaires pour biofabriquer des modèles complexes de tissus et d’organes. De plus, lorsque les sphéroïdes sont produits automatiquement, il y a peu de risques de contamination microbiologique, ce qui augmente la reproductibilité de la méthode.

La production à grande échelle de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bioimpression 3D et se termine par la maturation complète de la construction tissulaire dans les bioréacteurs. Cependant, le nombre d’études qui ont exploré la production de sphéroïdes ASC à grande échelle est encore rare, ainsi que le nombre d’études qui ont utilisé des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Par conséquent, cet article vise à montrer la production à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’une technique d’hydrogel micromoulé non adhésif répandant des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs pour les approches de bioimpression 3D.

Introduction

Les sphéroïdes sont considérés comme une approche sans échafaudage dans l’ingénierie tissulaire. Les ASC sont capables de former des sphéroïdes par le processus d’auto-assemblage. La microarchitecture 3D du sphéroïde augmente le potentiel de régénération des ASC, y compris la capacité de différenciation en plusieurs lignées 1,2,3. Ce groupe de recherche a travaillé avec des sphéroïdes ASC pour l’ingénierie du cartilage et des tissus osseux 4,5,6. Plus important encore, les sphéroïdes sont considérés comme des éléments constitutifs de la biofabrication des tissus et des organes, principalement en raison de leur capacité de fusion.

L’utilisation des sphéroïdes pour la formation des tissus dépend de trois points principaux: (1) le développement de méthodes robotiques standardisées et évolutives pour leur biofabrication7, (2) le phénotypage systématique des sphéroïdes tissulaires8, (3) le développement de méthodes pour l’assemblage de tissus 3D9. Ces sphéroïdes peuvent être formés avec différents types de cellules et obtenus par diverses méthodes, y compris la goutte suspendue, la réagrégation, la microfluidique et les micromoules 8,9,10. Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients liés à l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes, à la récupération des sphéroïdes après leur formation, au nombre de sphéroïdes produits, à l’automatisation des processus, à l’intensité de la main-d’œuvre et aux coûts11.

Dans la méthode du micromoulage, les cellules sont distribuées et déposées au fond du micromoulage en raison de la gravité. L’hydrogel non adhésif ne permet pas aux cellules d’adhérer au fond, et les interactions cellule-à-cellule conduisent à la formation d’un seul sphéroïde par récession 8,12. Cette méthode de biofabrication génère des sphéroïdes de taille homogène et contrôlée, peut être robotisée pour une production à grande échelle de manière rapide avec un minimum d’effort, et présente de bons facteurs critiques de rentabilité dans la conception d’une biofabrication de sphéroïde tissulaire 7,8. Cette méthode peut être appliquée pour former des sphéroïdes de n’importe quelle lignée cellulaire afin de préparer un nouveau type de tissu avec des caractéristiques prévisibles, optimales et contrôlables8.

La biofabrication est définie comme « la génération automatisée de produits biologiquement fonctionnels avec une organisation structurelle... »13. Par conséquent, la production automatisée de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bio-impression 3D et se termine par la maturation complète du tissu bioimprimé par fusion sphéroïde. Dans cette étude, pour améliorer l’évolutivité de la biofabrication des sphéroïdes ASC, nous utilisons un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Cet article montre qu’il était possible de produire un grand nombre (des milliers) de sphéroïdes nécessaires aux approches de bio-impression 3D pour biofabriquer des modèles tissulaires plus complexes.

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Protocole

Les ASC utilisés dans cette étude ont déjà été isolés à partir de donneurs humains en bonne santé et cryoconservés comme décrit14 selon le Comité d’éthique de la recherche de l’hôpital universitaire Clementino Fraga Filho, Université fédérale de Rio de Janeiro, Brésil (25818719.4.0000.5257). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux et équipements utilisés dans cette étude.

1. Trypsinisation de la monocouche ASC au passage trois

  1. Ouvrir la culture tissulaire 175 cm2 flacon contenant la monocouche d’ASC à 80% de confluence et jeter le surnageant.
  2. Ajouter 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,01 M) et laver la monocouche deux fois. Ensuite, jetez le liquide.
  3. Ajouter 5 mL de trypsine à 0,125 % avec 0,78 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Ensuite, incuber pendant 5 min à 37 °C.
  4. Ajouter 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM LOW) à faible teneur en glucose de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) à la fiole de culture tissulaire de 175 cm2 et bien mélanger la suspension cellulaire avec une pipette sorologique de 10 mL.
  5. Récoltez la suspension cellulaire avec une pipette sérologique de 10 mL et transférez-la dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Ensuite, centrifuger à 400 × g pendant 5 min pour obtenir la pastille d’ASC. Remettez en suspension la pastille de la cellule en utilisant DMEM LOW contenant 10% de FBS.
  6. Effectuez un comptage de cellules par exclusion de trypan.
  7. Après avoir compté, prenez un total de 1 × 106 ASC dans un tube centrifuge de 15 mL séparé pour ensemencer les 81 récessions micromoulées avec de l’hydrogel non adhérent (un total de 10 000 cellules / mL ensemencées ici). Pour ensemencer 256 récessions d’hydrogel micromoulé non adhérent, prenez un total de 5 × 105 ASC dans un tube centrifuge (un total de 2 500 cellules / mL ensemencées ici).

2. Fabrication d’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé

  1. Préparer 50 mL d’une solution stérile d’agarose ultrapure à 2 % dans du NaCl à 0,9 % dans de l’eau ultrapure. Autoclaver la solution pendant 30 min à 121 °C.
  2. Ajouter 500 μL de solution stérile d’agarose ultrapure à 2% au centre d’un moule en silicone contenant 81 ou 256 renfoncements circulaires.
  3. Après 40 min, démoulez l’agarose ultrapure du moule en silicone et placez-la dans un puits d’une plaque en plastique à 12 puits.
  4. Ajouter 2 mL de DMEM LOW dans le puits avec l’agarose micromoulée et incuber dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant au moins 12 h avant d’ensemencer les ASC.

3. Biofabrication des sphéroïdes ASC à l’aide du système de pipetage automatisé

  1. Vérifiez les points suivants :
    1. Vérifiez si le flux laminaire est activé et si le flux d’air de l’armoire fonctionne correctement.
    2. Vérifiez si l’équipement est connecté à la bonne tension.
    3. Vérifiez si la tablette est connectée à l’équipement.
    4. Vérifiez si la hauteur du verre de protection de l’armoire est à la même hauteur que le marquage du capteur de l’équipement.
  2. Appuyez sur le bouton Marche/Arrêt sur le côté gauche de l’équipement et attendez que la tablette et l’équipement démarrent.
  3. Placez les boîtes de pointe, le rack pour les tubes centrifuges et la plaque contenant l’hydrogel d’agarose micromoulé dans l’espace de travail de l’équipement.
  4. Sur la tablette avec le logiciel ouvert, cliquez d’abord sur Labware Editor.
  5. Installez une table de travail virtuelle et choisissez les positions des pipettes, des boîtes à embouts, du rack pour les tubes en plastique et des plaques.
    REMARQUE : La table de travail virtuelle doit représenter les positions physiques des accessoires dans l’équipement.
  6. Cliquez sur le bouton Passer à la production pour inclure les paramètres (voir étape 3.10) et les commandes que l’équipement exécutera tout au long de l’expérience. Attendez qu’une barre d’outils et une liste de produits s’ouvrent dans le logiciel.
  7. Initialement, pour indiquer les commandes, incluez le nombre d’échantillons à pipeter et faites-le glisser vers la liste de production.
    REMARQUE: Le nombre d’échantillons est le nombre de tubes centrifuges en plastique contenant la suspension ASC à ensemencer au centre des micromoules.
  8. Après avoir entré le nombre d’échantillons, cliquez sur le bouton de commande Transfert d’échantillons du logiciel pour transférer la suspension ASC vers les puits de la plaque de 12 puits, contenant les micromoules, et faites-la glisser vers la liste des produits.
  9. Cliquez sur Propriétés pour définir les positions de début et de fin de l’équipement pour transférer l’échantillon.
  10. Attendez que le logiciel revienne à la page Table de travail . Cliquez sur le bouton Options pour configurer les paramètres d’ensemencement automatisé des ASC: i) Vitesse d’aspiration de 15,4 s-1; ii) Vitesse de distribution de 1 s-1; iii) Délai de soufflage de 0 ms; iv) Vitesse de soufflage de 15,4 s-1; v) Avc initial de 100%. Sélectionnez Eau comme type de liquide standard.
  11. Configurer les paramètres pour mélanger les ASC afin d’obtenir une suspension homogène : i) Nombre de cycles de 5 ; ii) Vitesse de 6,5 s-1; iii) Volume de 300 μL.
  12. Après avoir configuré les paramètres, ajoutez le temps de 40 min à la liste des produits.
    REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour attendre que la suspension ASC décante au bas du micromoulage.
  13. Dans la liste des produits, incluez l’option Transfert de réactif pour transférer le milieu de culture sphéroïde vers les puits correspondants de la plaque.
  14. Répétez les étapes 3.9 à 3.11 pour configurer les configurations de position et de paramètres pour transférer le milieu de culture sphéroïde.
  15. Cliquez sur le bouton avec un symbole de contrôle sur la barre supérieure du logiciel pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreur de programmation.
  16. Cliquez sur le bouton Lecture (avec un symbole triangulaire) dans la barre supérieure du logiciel pour démarrer le programme.
  17. Laissez l’équipement démarrer, comme programmé, et attendez qu’il émette un son, indiquant qu’il est terminé.
  18. Recueillir la plaque de 12 puits et l’incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 18 h pour que les sphéroïdes soient complètement formés et compacts.
  19. Récoltez manuellement les sphéroïdes après 1, 3 et 7 jours de culture pour analyse. Rincer manuellement le milieu avec une micropipette pour libérer les sphéroïdes de l’hydrogel d’agarose micromoulé non adhérent.
  20. Après 5 min, vérifiez au microscope si les sphéroïdes sont complètement libérés de l’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé.
  21. Collectez les sphéroïdes manuellement à l’aide d’une micropipette et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
  22. Lavez les sphéroïdes au moins deux fois avec 0,01 M PBS. Évaluer la viabilité et effectuer des analyses biomécaniques sur les échantillons de sphéroïdes frais. Pour l’analyse morphologique (histologie), incuber les échantillons de sphéroïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant au moins 18 h à 2-8 °C.

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Résultats

Le système de pipette automatique peut ensemencer la suspension de la cellule ASC dans 12 puits d’une plaque de 12 puits en 15 min. L’utilisation des 81 hydrogels micromoulés non adhérents produira 972 sphéroïdes à la fin du protocole. L’utilisation des 256 hydrogels micromoulés non adhérents produira 3 072 sphéroïdes à la fin du protocole. Les sphéroïdes ASC ont été analysés pour l’homogénéité de leur taille et de leur forme. Les sphéroïdes ASC des micromoules avec 81 récessions ont montré un diamètre homogène pendant l...

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Discussion

Cet article présente la génération à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’un système de pipette automatisé. L’étape critique du protocole consiste à configurer avec précision le logiciel pour assurer le volume correct de suspension de cellule, la vitesse et la distance pour le pipetage. Les paramètres décrits dans le protocole ont été déterminés après un certain nombre d’essais afin d’optimiser la distribution de la suspension de cellules ASC dans les puits de plaques de 12 puits contenant les hydrogels micromoulé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions l’Institut national de métrologie, de qualité et de technologie (INMETRO, RJ, Brésil) pour l’utilisation de ses installations. Cette étude a été partiellement soutenue par la Fondation Carlos Chagas Filho pour le soutien à la recherche de l’État de Rio de Janeiro (Faperj) (code financier: E26/202.682/2018 et E-26/010.001771/2019), le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) (code financier: 307460/2019-3) et l’Office de la recherche navale (ONR) (code financier: N62909-21-1-2091). Ce travail a été partiellement soutenu par le National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque plastique 12 puitsCorning3512
Tube à centrifuger 50 mLCorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. MotionEppendorf30015231
éthylènediamineacide tétraacétique (EDTA)Invitrogen15576028
sérum fœtal bovin (FBS)Gibco10082147
Low Glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)Gibco31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold sphéroïdes - 16 x 16 arraySigma
MicroTissues 3D Boîte de Pétri Micro-moule sphéroïdes - 9 x 9 arraySigmaZ764019
tampon salin phosphate (PBS)Sigma806552
sodium (NaCl)SigmaS8776
flacon de culture tissulaireCorning430720U
trypanLonza17-942E
trypsineGibco27250018
agarose ultra-pureInvitrogen16500100
Z764000 chlorure de

Références

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).

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Mots-clés

Cellules souches adipeusesBio impression 3DProduction de sph ro desCulture cellulaire automatis eHydrogel micromoulIng nierie tissulaire sans chafaudageFraction stromale vasculaireHomog n it des sph ro desEnsemencement de suspension cellulaire

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