Article de méthode

Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

DOI :

10.3791/63459

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6 avril 2022

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1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous décrivons un ensemble de méthodes pour caractériser l’interaction des protéines avec les membranes de cellules ou de microvésicules.

Résumé

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Dans le corps humain, la plupart des principales réactions physiologiques impliquées dans la réponse immunitaire et la coagulation sanguine se déroulent sur les membranes des cellules. Une première étape importante dans toute réaction dépendante de la membrane est la liaison des protéines sur la membrane des phospholipides. Une approche pour étudier l’interaction des protéines avec les membranes lipidiques a été développée en utilisant des protéines marquées par fluorescence et la cytométrie en flux. Cette méthode permet d’étudier les interactions protéine-membrane à l’aide de cellules vivantes et de vésicules phospholipides naturelles ou artificielles. L’avantage de cette méthode est la simplicité et la disponibilité des réactifs et des équipements. Dans cette méthode, les protéines sont marquées à l’aide de colorants fluorescents. Cependant, des protéines auto-fabriquées et disponibles dans le commerce, marquées par fluorescence, peuvent être utilisées. Après conjugaison avec un colorant fluorescent, les protéines sont incubées avec une source de la membrane phospholipidique (microvésicules ou cellules), et les échantillons sont analysés par cytométrie en flux. Les données obtenues peuvent être utilisées pour calculer les constantes cinétiques et l’équilibre Kd. En outre, il est possible d’estimer le nombre approximatif de sites de liaison aux protéines sur la membrane phospholipidique à l’aide de billes d’étalonnage spéciales.

Introduction

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Les biomembranes séparent le contenu interne des cellules animales et de l’espace extracellulaire. Notez que les membranes entourent également les microvésicules formées au cours du cycle de vie de la cellule et les organites. La membrane cellulaire est principalement composée de lipides et de protéines. Les protéines membranaires remplissent des fonctions de signalisation, structurelles, de transport et d’adhésif. Cependant, la bicouche lipidique est également essentielle pour l’interrelation de la cellule animale avec l’espace extracellulaire. Cet article propose une méthode pour étudier l’interaction périphérique des protéines externes avec la membrane lipidique.

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Protocole

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1. Marquage des protéines fluorescentes

  1. Préparation du matériel
    1. Préparez 1 M de tampon de bicarbonate de sodium, pH 9,0, conservez-le à 4 °C et utilisez-le dans un délai d’une semaine.
    2. Préparer un tampon de chlorhydrate d’hydroxylamine de 1,5 M, pH 8,5, immédiatement avant utilisation.
    3. Préparer une solution de colorant fluorescent à 10 mg/mL (voir la Table des matériaux) dans du sulfure de diméthyle.
      REMARQUE: Cette solution peut être conservée pendant un mois à -20 ° C dans l’obscurité.
    4. Préparer des solutions d’anticorps purifiés ou d’autres protéines à 1-10 mg / mL.
      REMARQUE: ....

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Résultats

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La méthode de cytométrie en flux décrite ici est utilisée pour caractériser la liaison des protéines de coagulation plasmatique aux plaquettes activées. En outre, les vésicules phospholipides PS:PC 20:80 ont été appliquées comme système modèle. Cet article se concentre principalement sur les vésicules phospholipides artificielles à titre d’exemple. Les paramètres du cytomètre, en particulier la tension du tube photomultiplicateur (PMT) et la compensation doivent être sélectionnés pour chaque dispositif spécifique, l’obje.......

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Discussion

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La méthode proposée peut être adaptée pour une caractérisation approximative de l’interaction des protéines avec les membranes phospholipides provenant de diverses sources et compositions. La cytométrie quantitative en flux décrite ici concède à la résonance plasmonique de surface (SPR) dans plusieurs paramètres. En particulier, il a une sensibilité et une résolution temporelle plus faibles et nécessite un marquage fluorescent des protéines. Le marquage fluorescent peut entraîner un changement de conformation et une pert.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs ont été soutenus par une subvention de la Fondation russe pour la science 20-74-00133.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
A23187Sigma AldrichC7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester succinimidylique)Thermo Fisher ScientificA37573colorant fluorescent
Apyrase de pommes de terreSigma AldrichA2230
BD FACSCantoIIBD Bioscience
albumine sérique bovineVWR Life Science AMRESCOAm-O332-0.1
Chlorure de calcium, anhydre, poudre, &ge ; 97 %Sigma AldrichC4901-100G
Spectromètre de fluorescence Cary EclipseAgilent
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)Thermo Fisher ScientificD384
DMSOSigma AldrichD8418
EDTA sel disodiqueVWR Life Science AMRESCOAm-O105B-0.1
FACSDivaBD Biosciencelogiciel d’acquisition de données de cytométrie
FlowJoTree Starlogiciel d’analyse de données
HEPESSigma AldrichH4034-500G
Factor XRecherche enzymatiqueHFX 1010
Chlorhydrate d’hydroxylaminePanreac141914.1209
L-&alpha ;-phosphatidylcholine (cerveau, porcin)Avanti Polar Lipids840053P
L-&alpha ;-phosphatidylsérine (cerveau, porcin) (sel de sodium)Avanti Polar Lipids840032P
Chlorure de magnésiumSigma AldrichM8266-100G
Mini-extrudeuseAvanti Polar Lipids610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951OriginLab CorporationLogiciel statistique
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), biotechnologie GradeVWR Life Science AMRESCO97062-732
Chlorure de potassiumSigma AldrichP9541-500G
Prostaglandine E1Cayman Chemical13010
Sephadex G25GE HealthcareGE17-0033-01milieu de filtration sur gel pour la purification des protéines
Sepharose CL-2BSigma AldrichCL2B300-500MLmilieu de filtration sur gel pour la purification des plaquettes
Bicarbonate de sodiumCorning61-065-RO
Chlorure de sodiumSigma AldrichS3014-500G
Phosphate de sodium monobasiqueSigma AldrichS3139-250G
Cônes de centrifugation avec membrane 0.2 µ ; mSartoriusVS0171
Citrate trisodique dihydratéSigma AldrichS1804-1KG
Human

Références

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  1. Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
  2. Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
  3. Pa....

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Mots-clés

Fluorescent Labeled ProteinsPhospholipid MicrovesiclesFlow CytometryProtein Membrane InteractionLigand Binding DynamicsKinetic Binding ExperimentsEquilibrium Binding AssayCalibration BeadsPlatelet ActivationSpectrofluorometer Analysis

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