Article de méthode

Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs

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DOI :

10.3791/63493

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17 août 2022

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1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole présente l’ensemble des procédures en laboratoire requises pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs. Nous présentons ici les étapes détaillées de l’amplification du génome entier, de la sélection des fragments d’ADN, de la construction de la bibliothèque, de la préparation du modèle et du flux de travail de séquençage avec des résultats représentatifs.

Résumé

Le séquençage de nouvelle génération a acquis une importance croissante dans l’application clinique dans la détermination des variantes génétiques. Dans le test génétique préimplantatoire, cette technique présente des avantages uniques en termes d’évolutivité, de débit et de coût. Pour le test génétique préimplantatoire pour l’analyse aneuploïdique, le système de séquençage de nouvelle génération (NGS) à base de semi-conducteurs présenté ici fournit une approche globale pour déterminer les variantes génétiques structurelles à une résolution minimale de 8 Mb. De l’acquisition de l’échantillon au rapport final, le processus de travail nécessite plusieurs étapes dans le respect strict des protocoles. Étant donné que diverses étapes critiques pourraient déterminer le résultat de l’amplification, la qualité de la bibliothèque, la couverture des lectures et la sortie des données, des informations descriptives avec une démonstration visuelle autre que des mots pourraient offrir plus de détails sur l’opération et la manipulation, ce qui peut avoir un impact important sur les résultats de toutes les étapes critiques. Les méthodes présentées ici présenteront les procédures impliquées dans l’amplification du génome entier (WGA) des cellules trophectodermiques biopsiées (TE), la construction de la bibliothèque génomique, la gestion du séquenceur et, enfin, la génération de rapports de variantes de nombre de copies.

Introduction

L’aneuploïdie est l’anomalie du nombre de chromosomes par la présence d’un ou plusieurs chromosomes supplémentaires ou l’absence d’un ou plusieurs chromosomes. Les embryons porteurs d’un certain type d’aneuploïdie, comme la perte d’un chromosome X (syndrome de Turner), des copies supplémentaires d’autosomes, comme les trisomies de l’autosome 21 (syndrome de Down), 13 (syndrome de Patau) et 18 (syndrome d’Edwards), ou des chromosomes sexuels supplémentaires tels que 47, XXY (syndrome de Klinefelter) et 47, XXX (syndrome Triple X), peuvent survivre à terme avec des malformations congénitales1. L’aneuploïdie est la principale cause des fausses couches du premier trimestre et de l’échec de la fécondation in vitro (FIV)2. Il est rapporté que le taux d’aneuploïdie pourrait varier de 25,4% à 84,5% à travers les différentes couches d’âge du cycle naturel et du groupe témoin médicamenteux dans la pratique de FIV3.

La technologie de séquençage de nouvelle génération est de plus en plus largement appliquée dans la détermination clinique de l’information génétique; Il fournit un accès pratique à la séquence du génome avec efficacité et un débit élevé. En particulier, le séquençage de nouvelle génération a également révolutionné le diagnostic des troubles avec des facteurs génétiques et les tests d’anomalie dans le génome4. Utilisant la technologie de séquençage des semi-conducteurs pour transférer directement les signaux chimiques dans le séquençage de la bioréaction en données numériques, le système de séquençage à base de semi-conducteurs fournit une détection directe et en temps réel pour séquencer les données en 3-7 h 5,6.

Dans une procédure de FIV, le test génétique préimplantatoire (PGT) étudie le profil génétique de l’embryon avant d’être transféré dans l’utérus afin d’améliorer les résultats de la FIV et de réduire le risque de troubles génétiques chez les nouveau-nés 1,7. Dans le PGT combiné avec les techniques NGS, le matériel génétique extrait de moins de 10 cellules est amplifié avec des kits d’amplification du génome entier ou un réactif d’amplification du génome entier développé indépendamment. Cela ne nécessite qu’une seule étape dans la phase d’amplification et ne nécessite pas de pré-amplification, pour obtenir des produits d’amplification du génome entier. Des amorces ou des panneaux pour la variante du nombre de copies et le séquençage spécial des loci géniques sont conçus et appliqués dans la bibliothèque construite.

Un flux de travail typique de tests génétiques préimplantatoires aneuploïdie (PGT-A) dans NGS implique des procédures en série et nécessite une charge de travail intense de personnel de laboratoire8. Une mauvaise opération a entraîné l’annulation de la procédure peut entraîner une perte indésirable de temps et de ressources du laboratoire. Une procédure opérationnelle normalisée (PON) concise et claire pour le flux de travail PGS-NGS est utile; Toutefois, les protocoles au format Word ne peuvent pas présenter d’informations plus détaillées sur le traitement des échantillons, la manipulation des périphériques et les paramètres des instruments, qui peuvent être visualisées dans un protocole vidéo. Dans cet article, un flux de travail validé combiné à une démonstration visualisée des détails de fonctionnement pourrait offrir des protocoles de référence plus directs et intuitifs dans la pratique du PGT sur une plate-forme de séquençage de semi-conducteurs.

Le protocole décrit ici une méthode qui prend en charge le dosage de jusqu’à 16 biopsies embryonnaires en parallèle. Pour les lots plus importants, il est recommandé d’utiliser un protocole commercial basé sur un kit pour le séquençage des semi-conducteurs, tel que Reproes-PGS.

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Protocole

Tous les protocoles et la biopsie du trophectoderme (TE) (section 1.1.1.1) appliqués dans cette étude ont été examinés et approuvés par le comité d’éthique de la recherche humaine de l’hôpital n ° 924 le 18 septembre 2017 (NO: PLA924-2017-59). Les patients/participants ont fourni leur consentement éclairé écrit pour participer à cette étude.

1. Isolement de l’ADN à partir d’une biopsie d’embryons humains et d’une amplification génomique complète

  1. Protocole pour l’amplification du génome entier 9,10
    REMARQUE: Le kit Pico PLEX WGA est utilisé pour effectuer une amplification du génome entier.
    1. Prélèvement et stockage des échantillons
      1. Biopsie du trophectoderme : Prélever en moyenne six à neuf cellules de hernie TE d’embryon D5/6 après éclosion assistée afin d’obtenir une quantité qualifiée d’ADN pour l’amplification suivante.
      2. Transférer les cellules d’échantillon dans un tube de PCR dans 5 μL de PBS.
      3. Congeler immédiatement les échantillons à -80 °C si le protocole ne procède pas directement à l’extraction de l’ADN.
    2. Lyse cellulaire
      REMARQUE : Le dossier supplémentaire 1 énumère et sert de référence pour les volumes recommandés de chaque composant lors de la préparation du mélange maître pendant la lyse cellulaire et l’amplification du génome entier de lots de 1, 8, 16 et 32 échantillons (avec surdosage pour tenir compte des erreurs de pipetage). Lors de la formulation d’autres mélanges maîtres de ce protocole, le volume de chaque composant est en outre augmenté pour tenir compte de la consommation de composants causée par le pipetage répété. Toute centrifugation brève est effectuée sur une mini-centrifugeuse de table pendant 2 à 10 s à température ambiante (RT), avec un régime fixe de 10 000 avec une force centrifuge de 5 300 x g. La force centrifuge doit être comprise entre 2 000 x g et 12 000 x g.
      1. Préparer le mélange de lyse cellulaire avec 4,8 μL de tampon de dilution de l’enzyme d’extraction et 0,2 μL de l’enzyme d’extraction cellulaire par échantillon.
      2. Introduire à la pipette 5 μL du mélange de lyse cellulaire fraîchement préparé dans chaque échantillon de cellules de 5 μL dans des tubes de PCR et centrifuger brièvement le tube à TA pendant 5 s. Ne pas vortex le tube.
      3. Incuber l’échantillon dans un thermocycleur comme suit: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Centrifuger brièvement (5 s) le tube après l’incubation.
    3. Pré-amplification de l’ADN du génome entier
      1. Préparer le mélange de préamplification avec 4,8 μL de tampon de préampli et 0,2 μL d’enzyme de préamplification par échantillon.
      2. Introduire à la pipette 5 μL du mélange de préamplification dans les tubes d’échantillon à travers les parois du tube et centrifuger brièvement pendant 3 s. Évitez que la pointe n’atteigne le fond du tube et ne tourbillonnez pas le tube.
      3. Incuber l’échantillon selon le programme de thermocycleur mentionné dans le tableau 1.
    4. Amplification de l’ADN du génome entier
      1. Centrifuger brièvement l’échantillon pendant 5 s et placer le produit d’incubation du préampli sur de la glace.
      2. Préparer le mélange d’amplification du génome entier avec 25 μL de tampon d’amplification, 0,8 μL de l’enzyme d’amplification et 34,2 μL d’eau exempte de nucléases par échantillon.
      3. Mélanger 60 μL du mélange d’amplification du génome entier fraîchement préparé avec les 15 μL de produit d’incubation préamplificateur; le volume total doit être de 75 μL. Centrifuger brièvement pendant 5 s. Évitez que la pointe n’atteigne le fond du tube et ne tourbillonnez pas le tube.
      4. Placez le tube PCR sur le thermocycleur et exécutez le programme de thermocycleur mentionné dans le tableau 2.
      5. Centrifuger brièvement les tubes pendant 5 s et transférer les produits dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.
      6. Quantifier la concentration du produit WGA à l’aide d’un fluoromètre11. Les échantillons peuvent être conservés temporairement à -20°C pendant moins de 2 mois s’ils ne passent pas à l’étape suivante.
  2. Protocole des réactifs WGA développés indépendamment.
    1. Prélèvement et stockage des échantillons
      1. Prélever les cellules de l’embryon D5/6 après l’éclosion assistée pour l’amplification suivante.
      2. Transférer les cellules d’échantillon avec 1,5 μL de PBS dans un tube de PCR contenant 2 μL de PBS.
        REMARQUE: PBS est exempt de Mg 2+ et Ca2+.
      3. Congeler immédiatement les échantillons à -80 °C s’ils ne sont pas directement soumis au protocole d’extraction de l’ADN.
    2. Lyse cellulaire
      1. Faire fondre le tampon de lyse cellulaire (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM d’acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA), 1 % (v/v) Triton X-100, 5 mM pyrophosphate de sodium, 2 mM β-glycérophosphate, 0,1% SDS) à TA et le placer sur la glace. Ajouter 2 μL de tampon de lyse cellulaire à chaque échantillon et centrifuger brièvement (5 s).
        REMARQUE: Ne pas vortex le tube et éviter que l’embout de la pipette ne touche la surface du liquide dans le tube pour éviter d’amener les cellules ou l’ADN hors du système réactionnel.
      2. Incuber l’échantillon dans un thermocycleur comme suit: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, maintenir. Centrifuger brièvement le tube à TA pendant 10 s après l’incubation.
    3. Amplification de l’ADN du génome entier
      1. Centrifuger brièvement le produit de lyse cellulaire pendant 5 s et le placer sur de la glace.
      2. Préparer le mélange d’amplification du génome entier pour chaque échantillon en mélangeant avec 16 μL de solution prémélangée d’amplification, 1 μL d’enzyme d’amplification et 28 μL d’eau sans nucléase. Mélanger doucement, centrifuger brièvement (5 s) et placer le mélange sur de la glace. Ne pas vortex le tube.
      3. Pipeter 45 μL du mélange d’amplification du génome entier fraîchement préparé dans le produit de lyse cellulaire préparé à l’étape 1.2.2.2; Mélanger doucement et centrifuger brièvement pendant 5 s.
        REMARQUE: Ne pas vortex le tube et éviter que l’embout de la pipette ne touche le liquide dans le tube.
      4. Placez le tube PCR sur le thermocycleur et exécutez le programme comme indiqué dans le tableau 3.
      5. Centrifuger les tubes brièvement pendant 5 s et transférer les produits dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.
      6. Quantifier la concentration du produit WGA avec un fluoromètre11 et enregistrer les résultats sur la feuille d’analyse de la qualité (AQ). Les produits avec des concentrations qualifiées peuvent être stockés temporairement à -20 °C pendant moins de 2 mois s’ils ne passent pas à l’étape suivante.

2. Sélection des fragments d’amplification

REMARQUE : Les documents utilisés dans cette section sont disponibles dans la trousse de préparation de la bibliothèque (tableau des matériaux).

  1. Préparation avant de commencer
    1. Équilibrer les billes magnétiques (n x 100 μL) pour la purification à TA pendant 30 min.
    2. Restaurez le produit WGA précédent à RT. Vortex le produit à RT pendant 30 s avant de le centrifuger brièvement.
    3. Préparez de l’éthanol frais à 70%.
  2. Procédure de sélection des fragments
    1. Pipeter 25 μL des produits WGA et transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL avec 25 μL d’eau sans nucléase préchargée.
    2. Vortex et mélangez bien les perles de purification de l’ADN. Aliquote 50 μL dans chaque tube à échantillon (échantillon original : billes (volume) = 1:1), vortex et centrifugeuse brièvement (5 s). Réglez le tube pendant 5 min à RT pour le processus de liaison à l’ADN.
    3. Insérez le tube centrifuge de 1,5 mL dans un support magnétique et attendez que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL. Évitez de pipeter les perles.
    4. Selon le volume d’échantillon original, pipeter 30 μL (échantillon original : billes (volume) = 1:0,6) de billes magnétiques, vortex et centrifugeuse brièvement (5 s). Réglez le tube pendant 5 min à RT pour le processus de liaison à l’ADN.
    5. Insérez les tubes centrifugeuses de 1,5 mL dans le support magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Évitez de pipeter les perles.
    6. Pipeter 300 μL d’éthanol à 70 % dans le tube centrifuge de 1,5 mL, faire tourner doucement le tube deux fois avec un angle de 180° et déplacer les billes le long de la paroi du tube pour un lavage complet. Pipeter et jeter le surnageant. Évitez de pipeter les perles.
    7. Répétez la procédure de lavage une fois.
    8. Retirez le tube de centrifugation de 1,5 mL du rack magnétique et centrifugez brièvement (5 s). Réinsérez les tubes dans le rack magnétique et attendez que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube.
    9. Extraire soigneusement le liquide restant au fond. Gardez le tube ouvert pour sécher les perles à TA pendant 3-5 min. Gardez l’humidité hors des perles.
      REMARQUE: Fermez immédiatement le couvercle si des fissures apparaissent sur la pastille de perles.
    10. Retirez les tubes du rack magnétique, pipette 25-30 μL du tampon d’élution de l’ADN dans un tube, et fermez le capuchon et le vortex. Centrifuger brièvement (5 s) pour amener le liquide trouble au fond du tube, et régler le tube à TA pendant 5 min.
    11. Réinsérez les tubes dans les racks magnétiques et attendez que toutes les perles soient attirées par la paroi latérale du tube et que le surnageant devienne transparent. Transférer soigneusement la solution d’ADN dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 mL. Évitez de pipeter les perles.
    12. Quantifier la concentration d’ADN après sélection des fragments avec un fluoromètre11, le stocker à -20°C. En règle générale, la concentration du fragment d’ADN sélectionné varie de 1,5 à 2,4 ng / μL.

3. Préparation de la banque d’ADN12

REMARQUE : Les documents utilisés dans cette section sont disponibles dans la trousse de préparation de la bibliothèque (tableau des matériaux).

  1. Fin de la réparation
    1. Équilibrer les billes magnétiques à TA pendant 30 min.
    2. Équilibrer le produit ADN de la sélection des fragments à l’étape 2.2.12 à RT. Vérifiez et notez l’étiquette sur chaque flacon contenant l’ADN.
    3. Préparer le système de réparation finale de l’ADN avec 30 μL de produits d’ADN, 10 μL de tampon de réparation d’extrémité, 0,5 μL d’enzyme de réparation d’extrémité et 9,5 μL d’eau sans nucléase dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Vortex du tube pendant 30 s et centrifuger brièvement (5 s) à RT pour amener tout le liquide au fond du tube.
    4. Incuber à 25 °C pendant 30 min, et centrifuger brièvement (5 s) le tube après incubation.
    5. Mélanger les billes magnétiques sous vortex ou mélanger à l’envers et transférer 75 μL des billes magnétiques dans un tube contenant des échantillons d’ADN réparés (échantillon original : billes (volume) = 1:1,5). Pipette ou vortex doux pour bien mélanger les billes et centrifuger brièvement (5 s) pour faire tourner toute la suspension jusqu’au fond du tube. Réglez le tube pendant 5 min à RT pour le processus de liaison à l’ADN. Retournez doucement les tubes pour garder les billes dispersées.
    6. Insérez les tubes de centrifugation dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale et que le surnageant devienne transparent. Retirez le surnageant et évitez de pipeter les perles, en gardant les tubes sur la grille lors du pipetage.
    7. Transférer 300 μL de l’éthanol à 70 % nouvellement préparé dans les tubes, faire tourner doucement les tubes deux fois à un angle de 180° et déplacer les billes le long de la paroi du tube pour un lavage en profondeur. Pipeter et jeter le surnageant. Évitez de pipeter les perles.
    8. Répétez la procédure de lavage une fois.
    9. Retirez les tubes de centrifugation de 1,5 mL du rack magnétique et centrifugez brièvement (5 s). Réinsérez les tubes dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube.
    10. Extraire soigneusement le liquide restant dans le fond. Ouvrez le bouchon des tubes à centrifuger de 1,5 ml et séchez les billes à TA pendant 3 à 5 min. Gardez l’humidité hors des perles.
      REMARQUE: Fermez immédiatement le couvercle si des fissures apparaissent sur la pastille de perles.
    11. Pipeter 33 μL de tampon d’élution d’ADN dans un tube, fermer le capuchon et vortex. Centrifuger brièvement (5 s) pour amener la suspension trouble au fond du tube et régler le tube à TA pendant 5 min.
    12. Réinsérez les tubes dans les racks magnétiques et attendez que toutes les perles soient attirées par le flanc et que la solution devienne transparente. Transférez soigneusement la solution d’ADN dans de nouveaux tubes centrifugeuses de 1,5 mL avec l’étiquette appropriée, en évitant de pipeter les perles.
  2. Ligature par code-barres
    1. Placer les réactifs de ligature de codes-barres à l’étape 3.2.2 sur de la glace pour faire fondre tous les réactifs congelés.
    2. Préparer le système de ligature avec 32 μL de produits d’ADN réparés en bout de ligne, 10 μL d’eau sans nucléase, 5 μL de tampon ligase, 1 μL de ligase et 1 μL de P1 adapter dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Extraire à la pipette 1 μL de chaque réactif de code à barres dans le mélange de solution dans le tube pour un échantillon, vortex pendant 5 s et centrifuger brièvement (5 s) pour obtenir tout le liquide dans le fond du tube.
      REMARQUE: Lors de l’ajout des codes à barres, vérifiez que le nombre de codes à barres et d’échantillons correspond; n’ouvrir qu’un seul flacon de codes-barres à chaque fois pour éviter la pollution mixte des codes-barres; Changez les gants pour chaque cinq ou six codes-barres ajoutés.
    3. Incuber les tubes à 25 °C pendant 30 min.
    4. Pipette 75 μL (échantillon original : billes (volume) = 1:1,5) des billes magnétiques dans un tube, et pipette ou vortex doux pour bien mélanger les billes. Centrifuger brièvement (5 s) pour faire tourner toute la suspension vers le bas, en évitant l’agrégation de talons. Réglez le tube pendant 5 min à RT pour le processus de liaison à l’ADN. Retournez doucement les tubes pour garder les billes dispersées.
    5. Insérez les tubes de centrifugation dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale et que le surnageant devienne transparent. Retirez le surnageant et évitez de pipeter les perles, en gardant les tubes sur la grille lors du pipetage.
    6. Transférer 300 μL de l’éthanol à 70 % nouvellement préparé dans des tubes, faire tourner doucement les tubes deux fois à un angle de 180° et déplacer les billes le long de la paroi du tube pour un lavage complet. Pipeter et jeter le surnageant. Évitez de pipeter les perles.
    7. Répétez la procédure de lavage une fois.
    8. Retirez brièvement les tubes de centrifugation de 1,5 mL du rack magnétique et centrifugez brièvement (5 s). Réinsérez les tubes dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube. Extraire soigneusement le surnageant restant dans le fond.
    9. Gardez le bouchon du tube ouvert pour sécher les perles à TA pendant 3-5 min. Gardez l’humidité hors des perles.
      REMARQUE: Fermez immédiatement le couvercle si des fissures apparaissent sur la pastille de perles.
    10. Pipeter 15 μL du tampon d’élution de l’ADN dans le tube. Rincez la pastille des billes jusqu’au fond du tube, scellez le bouchon et le vortex. Centrifuger brièvement (5 s) pour amener la suspension trouble au fond du tube et maintenir le tube stable à TA pendant 5 min.
  3. Amplification de fragments
    1. Placez les réactifs de construction de la bibliothèque sur de la glace lorsque le réactif congelé se dissout.
    2. Transférer 47,5 μL du mélange enzymatique et 2,5 μL du mélange d’amorces dans le tube contenant de l’ADN élué et des billes, vortex pendant 5 s et centrifuger brièvement (5 s) pour amener tout le liquide au fond du tube.
    3. Réglez le tube à RT pendant 5 min. Réinsérez les tubes dans des racks magnétiques et attendez que toutes les perles soient attirées par le flanc et que le surnageant devienne transparent. Transférer soigneusement la solution d’ADN dans des tubes de PCR de 0,2 ml avec des étiquettes clairement marquées et éviter de pipeter les billes.
    4. Incuber l’échantillon dans un thermocycleur avec le programme suivant: 72°C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cycles); 70 °C, 5 min. Centrifuger brièvement (5 s) le tube lorsque la réaction est terminée et stocker les produits à 4 °C.
    5. Transférer les produits PCR dans un tube à centrifuger de 1,5 mL (faible fixation). Ajouter 97,5 μL (volume d’échantillon original : billes (volume) = 1:1,5) de billes magnétiques dans le tube à la fin de la réaction, pipeter ou vortex doucement pour bien mélanger les billes et centrifuger brièvement (5 s) pour faire tourner tout le liquide vers le fond. Évitez l’agrégation de perles. Réglez le tube à RT pendant 5 min. Retournez doucement les tubes pour garder les billes dispersées.
    6. Insérez les tubes de centrifugation dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale et que le surnageant devienne transparent. Retirez le surnageant, évitez de pipeter les perles et maintenez les tubes stables sur la grille.
    7. Transférer 300 μL de l’éthanol à 70 % nouvellement préparé dans des tubes, faire tourner doucement les tubes deux fois à un angle de 180° et déplacer les billes le long de la paroi du tube pour un lavage complet. Pipeter et jeter le surnageant. Évitez de pipeter les perles.
    8. Répétez la procédure de lavage une fois.
    9. Retirez brièvement le tube de centrifugation de 1,5 mL du support magnétique et centrifugez brièvement (5 s). Réinsérez le tube dans le rack magnétique et attendez 5 minutes jusqu’à ce que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube. Extraire soigneusement le liquide restant dans le fond.
    10. Gardez le bouchon du tube ouvert pour sécher les perles à TA pendant 3-5 min. Gardez l’humidité hors des perles.
      REMARQUE: Fermez immédiatement le couvercle si des fissures apparaissent sur la pastille des billes.
    11. Pipeter 22 μL du tampon d’élution de l’ADN dans le tube, rincer la pastille des billes vers le bas et fermer le bouchon et le vortex. Centrifuger brièvement (5 s) pour amener le liquide trouble au fond du tube et régler le tube à TA pendant 5 min.
    12. Quantifier la concentration de la banque d’ADN construite à l’aide d’un fluoromètre11 et stocker la banque d’ADN construite à -20 °C; la concentration du fragment d’ADN sélectionné varie de 0,6 à 10 ng/μL. Recodez les informations de la bibliothèque dans la base de données de la bibliothèque et stockez les échantillons en conséquence.

4. Préparation du modèle de séquençage13,14

REMARQUE : Les matériaux utilisés dans cette section sont disponibles dans l’ensemble de kits de préparation de modèles (réactifs/solutions/matériaux) du kit universel des réactions de séquençage (tableau des matériaux).

  1. Mélange de bibliothèques
    1. Remplissez le formulaire d’une feuille d’enregistrement de pré-exécution dans le système serveur et étiquetez le tube d’échantillon avec la concentration de la bibliothèque et le numéro de code à barres. Évitez d’utiliser les mêmes codes-barres sur différents échantillons en une seule fois.
    2. Vortex et mélanger l’échantillon de la bibliothèque, et centrifuger brièvement (5 s). Diluer tous les échantillons à 100 pM avec de l’eau exempte de nucléase, vortex pendant 30 s et centrifuger brièvement l’échantillon.
      REMARQUE : Étant donné que l’ADN a une longueur moyenne de 260 pb et que 1 pb correspond à 660 g/mol, calculez la conversion de ng/μL en pM à l’aide de l’équation suivante : 1 ng/μL = 5 827,5 pM/L.
    3. Pipeter 10 μL de bibliothèque diluée de 100 pM dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, vortex pendant 30 s et centrifuger brièvement pendant 2 s. Gardez la bibliothèque mixte sur la glace.
  2. Préparation du modèle
    1. Démarrez le système d’amplification du modèle et choisissez le programme propre. Ajouter l’huile de réaction à la moitié du tube et ajouter la solution de rupture de l’émulsifiant à 1/3 du tube.
    2. Vérifiez que la plaque d’amplification et l’adaptateur de lavage sont réglés sur la position ON . Nettoyez la bouteille de déchets et insérez une aiguille dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml pour recueillir les déchets. Confirmez les étapes traitées sur l’écran du système d’amplification du modèle. Appuyez sur SUIVANT pour démarrer un programme propre, ce qui prendra environ 15 minutes.
    3. Remplacez la plaque d’amplification par une nouvelle après le programme de nettoyage, insérez les tubes de collecte contenant 150 μL de solution de rupture II dans le rotor et placez le pont sur les tubes de collecte. Ajouter l’huile de réaction à la moitié du tube et la solution de rupture de l’émulsifiant à 1/3 du tube.
    4. Préparation du réactif PCR émulsionné: Équilibrer le tampon PCR émulsionné à TA jusqu’à ce qu’il se dissolve, centrifuger brièvement (5 s) tous les réactifs et les placer sur de la glace avant utilisation.
    5. Pipeter 120 μL du mélange d’enzymes PCR émulsionnées, 100 μL de tampon de particules de sphère ionique (ISP) matrice, 170,5 μL d’eau sans nucléase et 9,5 μL de la bibliothèque mixte (100 pM) dans un tube contenant 2 000 μL de tampon PCR émulsionné. Bien mélanger la solution avec des pipetages répétés.
      NOTE: La solution mélangée doit être chargée sur le système d’amplification du gabarit dans les 15 minutes; effectuer toutes les procédures chez RT.
    6. Placez un nouveau filtre pour la préparation du gabarit sur le support du tube avec le portail d’échantillon vers le haut. Vortex de la solution pendant 5 s, centrifuger brièvement (5 s) et transférer la solution dans le portail d’échantillon du filtre après avoir pipeté à plusieurs reprises 800 μL trois fois. Centrifuger le tube pour diminuer les bulles avant la dernière injection. Évitez d’injecter de l’air dans le filtre. Injecter 200 μL d’huile de réaction II après la solution mélangée.
    7. Tournez le portail d’échantillon du filtre vers le bas et remplacez l’adaptation au lavage par le filtre. Insérez l’aiguille de l’échantillon dans le trou central du couvercle du rotor, puis appuyez sur l’aiguille vers le bas.
    8. Appuyez sur le bouton RUN à l’écran, choisissez le programme en fonction du kit correspondant, puis appuyez sur ASSISTED pour vérifier toutes les étapes. Appuyez sur SUIVANT jusqu’à ce que l’exécution soit lancée; Il faut environ 4,5 h pour terminer.
    9. Appuyez sur SUIVANT lorsque le programme est terminé; Le système démarrera une centrifugation de 10 minutes. Lorsque la centrifugation s’arrête, appuyez sur le bouton Ouvrir le couvercle et déplacez les tubes de collecte vers des racks. Si la procédure ne passe pas à l’étape suivante en 15 minutes, appuyez sur Final Spin pour recentrifuger.
    10. Retirer le surnageant dans le tube de collecte, en laissant 100 μL de solution dans le tube. Mélanger l’échantillon restant par pipetage et transférer l’échantillon dans les nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 ml marqués OT (système One touch 2).
      REMARQUE: Lorsque vous pipetez le surnageant, évitez de toucher le fond du tube le long du côté.
    11. Pipeter 100 μL d’eau exempte de nucléases dans chacun des tubes de collecte et transférer la solution dans le tube OT lavé avec un pipetage répété. Ajouter 600 μL d’eau sans nucléase dans le tube OT pour obtenir le volume total 1 mL, vortex pendant 30 s et centrifuger à 15 500 x g pendant 8 min.
    12. Retirez délicatement le surnageant dans le tube OT avec 100 μL restants et utilisez l’embout pour éliminer soigneusement la couche d’huile. Ajouter 900 μL d’eau sans nucléase, vortex pendant 30 s et centrifuger à 15 500 x g pendant 8 min.
    13. Retirer le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 20 μL, ajouter la solution de remise en suspension de la matrice pour obtenir un volume de 100 μL, vortex pendant 30 s et centrifuger brièvement pendant 2 s.
      NOTE: La solution obtenue dans cette étape doit passer à l’étape suivante en moins de 12 h.
    14. Exécutez le programme propre sur le système d’amplification du modèle avant de couper son alimentation.
  3. Enrichissement du modèle
    1. Préparer le mélange fondu avec 280 μL de tween-80 et 40 μL de NaOH 1 M.
    2. Lavez les perles C1. Vortex la solution de perles C1 pendant 30 s. Transférer 100 μL de billes dans un tube centrifuge de 1,5 mL, insérer le tube sur une grille magnétique pendant 2 min et jeter le surnageant.
    3. Transférer 1 mL de la solution de lavage des billes C1 dans le tube et le vortex pendant 30 s. Centrifuger brièvement (5 s), insérer le tube dans le rack magnétique pendant 2 min et jeter le surnageant. Pipeter 130 μL de solution de remise en suspension de billes C1 dans le tube et mélanger les billes par pipetage répété. Évitez de créer des bulles.
    4. Charger 100 μL de la bibliothèque diluée, 130 μL de billes C1, 300 μL x 3 solution de lavage gabarit et 300 μL de la solution de fusion dans les bandes à huit puits, comme illustré à la figure 1.
    5. Installez les bandes de huit puits sur le module d’enrichissement, chargez la pointe du pipetage et placez le tube centrifuge de 200 μL en position de collecte. Appuyez sur START pour exécuter le programme; Cela prend environ 35 min.
    6. L’échantillon sera automatiquement prélevé dans le tube à centrifuger de 200 μL; Fermez le couvercle et centrifugez-le à 15 500 x g pendant 5 min. Vérifiez le fond du tube pour vérifier s’il reste des billes C1.
    7. S’il reste des billes C1, pipeter à plusieurs reprises la solution matrice 10x et insérer le tube sur le rack magnétique pendant 4 min. Transférer tout le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 0,2 mL et centrifuger à 15 500 x g pendant 5 min.
    8. S’il ne reste aucune bille de C1 visible, jeter le surnageant jusqu’à ce qu’il en reste 10 μL, ajouter 200 μL d’eau sans nucléase et mélanger en pipetant 10x. Centrifuger à 15 500 x g pendant 5 min.
    9. Jeter le surnageant avec 10 μL restants et ajouter 90 μL d’eau sans nucléase pour atteindre un volume total de 100 μL. Pipeter de haut en bas 10x pour mélanger la solution, vortex pendant 5 s et centrifuger brièvement (5 s). La solution peut être conservée entre 2 et 8 °C pendant moins de 3 jours.

5. Séquençage de nouvelle génération 9,15

Remarque : Toutes les procédures de cette section sont effectuées sur la plate-forme de séquençage DA8600. Les matériaux utilisés dans cette section sont disponibles dans le kit de séquençage (réactifs/solutions/matériaux) du kit universel de réactions de séquençage (tableau des matériaux).

  1. Vérifiez tous les réactifs et matériaux requis dans une plate-forme de séquençage à rodage.
    1. Réactif de séquençage : Vérifiez la disponibilité de la solution enzymatique de séquençage (6 μL), des amorces de séquençage (20 μL), du gabarit de contrôle de la qualité (5 μL) et du dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), stockés entre -30 et 10 °C.
    2. Solution de séquençage : Vérifier la disponibilité de la solution de séquençage II (100 mL), de la Solution de séquençage III (50 mL), du tampon de recuit (1 015 μL), du tampon de chargement (10 μL), de l’agent moussant (2 μL), du comprimé de chlore (1 comprimé) et des billes de streptavidine (100 μL), conservées à 4 °C.
    3. Matériaux : Vérifiez la disponibilité d’un tube de réactifs de 250 ml (8), d’un bouchon de tube de 250 réactifs (8), d’une gorgée II (8), d’une gorgée (1), d’un flacon de réactif de 2 L (1) et d’une puce de séquençage (1), stockés chez RT.
  2. Lavez la puce avant utilisation.
    1. Placez une puce sur une plaque de travail, injectez 100 μL d’eau exempte de nucléases dans le trou d’échantillonnage, retirez la solution dans le portail de sortie et répétez la procédure.
    2. Injecter 100 μL de solution de NaOH 0,1 M dans la puce et incuber pendant 1 min à TA.
    3. Injectez 100 μL d’isopropanol dans le trou de l’échantillon, retirez la solution supplémentaire dans le portail de sortie et répétez la procédure.
    4. Couvrir le portail de sortie avec un papier filtre, aspirer l’azote pour sécher l’isopropanol restant dans la cellule d’écoulement de la puce et conserver la puce prête à l’emploi à RT.
  3. Lancement du séquenceur
    1. Allumez la valve d’azote et réglez la pression à 30 psi. Démarrez le séquenceur, appuyez sur CLEAN sur l’écran principal et choisissez de l’eau ou du chlorure pour laver la machine en conséquence.
      REMARQUE: Laver à l’eau avant chaque course, laver au chlorure chaque semaine ou le temps que la machine se met en veille avec des réactifs pendant 48 heures.
    2. Lavage au chlorure : Choisissez un flacon de réactif spécifié pour le lavage au chlorure, lavez le flacon deux fois avec 18 MΩ d’eau et remplissez le flacon avec 1 L d’eau 18 MΩ. Mettez un comprimé de chlorure dans le flacon, dissolvez le comprimé pendant 10 min, ajoutez 1 mL de 1 M de NaOH, puis inversez le flacon pour mélanger la solution. Utilisez la solution de chlorure dans les 3 heures suivant la préparation.
    3. Filtrer 100 mL de solution de chlorure avec un filtre de 0,45 μm et recueillir avec deux tubes. Installez les deux tubes de chlorure dans les positions C1 et C2. Appuyez sur CLEAN sur l’écran principal et équipez une puce pour le lavage au chlorure.
    4. Appuyez sur SUIVANT et vérifiez toutes les étapes à l’écran pour démarrer le programme de lavage; Le programme se terminera dans 30 min. Commencez un lavage à l’eau après le lavage au chlorure.
    5. Lavage à l’eau: Marquez deux tubes spécifiques pour l’eau avec C1 et C2, et lavez les tubes avec 18 MΩ d’eau deux fois. Ajouter 100 mL de 18 MΩ d’eau à chacun des tubes de lavage à l’eau et les placer en position C1 et C2, respectivement.
    6. Choisissez le programme CLEAN , installez la puce préparée pour le lavage à l’eau, appuyez sur SUIVANT, puis vérifiez toutes les étapes à l’écran pour démarrer le programme de lavage.
  4. Initialisation
    1. Nettoyez le flacon de lavage avec la solution de lavage II, marquez-le comme W2 et lavez-le trois fois avec 18 MΩ d’eau.
    2. Nettoyez le tube d’azote avec du papier posé à l’air, insérez-le dans le fond du tube et réglez le débit d’air à 0,5 L/min. Déchargez l’oxygène dans la bouteille et remplissez la bouteille avec 1 920 ml d’eau 18 MΩ. Ajouter la solution de séquence II et 10 μL de NaOH 1 M dans le flacon, fermer le bouchon et retourner le flacon plusieurs fois pour mélanger la solution.
    3. Marquez deux nouveaux tubes comme W1 et W3. Ajouter 32 μL de NaOH 1 M à W1, ajouter 40-50 mL de solution III de séquence 1x à W3 et fermer les bouchons.
      NOTE: La solution de séquence 1x III doit être dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes lors de la première utilisation. La solution de séquence II doit être protégée de la lumière et stockée à TA. Le flacon de lavage doit être remplacé par un nouveau après avoir été utilisé 20 fois.
    4. Appuyez sur INITIALIZE sur l’écran principal, changez le sipper sur les positions W1, W2 et W3, réglez les tubes sur leur position en conséquence et scellez-les hermétiquement par rotation. Installez une puce pour l’initialisation et vérifiez les paramètres d’état de la machine.
    5. Appuyez sur SUIVANT pour démarrer le programme d’initialisation ; Il faut compter 40 min dans la première section.
      REMARQUE: Les gants doivent être changés avant de changer la nouvelle gorgée pour éviter de contaminer le corps de la gorgée. Une fois utilisées pour le lavage à l’eau et l’initialisation, les puces peuvent être appliquées à l’initialisation, mais n’utilisez pas les puces utilisées pour les copeaux de lavage au chlorure pour l’initialisation.
    6. Dissoudre dGTP, dCTP, dATP et dTTP sur de la glace et vortex pour mélanger. Marquer quatre nouveaux tubes comme G, C, A et T, et pipeter 70 μL de la solution selon l’étiquette du tube.
  5. Préparez la bibliothèque pour l’exécution.
    1. Placez le gabarit de contrôle de la qualité, les amorces et la solution enzymatique sur la glace.
    2. Préparez la bibliothèque d’ADN lorsque le programme d’initialisation a environ 20 minutes restantes. Vortex le gabarit de contrôle de qualité pendant 30 s à mélanger, et centrifuger brièvement pendant 2 s. Transférer 5 μL du gabarit de contrôle de la qualité dans la solution matrice, vortex pendant 5 s et centrifuger le tube pendant 15 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant en le pipetant soigneusement, éviter de toucher la pastille et laisser un volume de 10 μL dans le tube.
    3. Ajouter 15 μL de tampon de recuit dans le tube; le volume total de la solution est de 25 μL.
    4. Vortex les amorces de séquence lorsqu’il se dissout complètement sur la glace et centrifuger brièvement pendant 2 s. Transférer 20 μL des amorces de séquence dans le tube à partir de l’étape précédente, vortex pendant 5 s, centrifuger brièvement pendant 2 s, puis stocker à TA avant utilisation.
  6. Chargement de l’échantillon et séquençage
    1. Pipeter 55 μL de la solution échantillon préparée à l’étape précédente et l’injecter dans le trou d’échantillon de la puce.
    2. Réglez la puce sur la centrifugeuse; Gardez l’encoche vers l’extérieur et le portail d’échantillon à l’intérieur, en l’équilibrant avec une autre puce usagée, et centrifugez pendant 10 min.
    3. Préparez la solution de chargement.
      1. Mélanger 0,5 mL du tampon de recuit et 0,5 mL d’eau exempte de nucléases dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Marquez-le comme tampon de recuit à 50% et utilisez-le dans les 7 jours.
      2. Mélanger 0,5 mL de solution d’isopropanol et 0,5 mL de tampon de recuit. Marquez-le comme tampon de lavage à 50% et utilisez-le dans les 24 heures.
      3. Mélanger 6 μL d’enzyme séquentielle et 60 μL de tampon de recuit à 50%. Marquez-le comme tampon de réaction enzymatique et placez la solution sur de la glace après préparation.
      4. Mélanger 49 μL de tampon de recuit à 50% et 1 μL d’agent moussant et le marquer comme solution moussante.
    4. Souffler 100 μL d’air dans la solution moussante, pipeter à plusieurs reprises la solution jusqu’à ce que les bulles soient dans un état de mousse dense et maintenir le volume de mousse autour de 250 μL.
    5. Placez la puce sur la paillasse après la centrifugeuse, injectez 100 μL de mousse dans le trou de l’échantillon et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie. Remettez la puce dans la centrifugeuse et faites la centrifuger brièvement pendant 30 s.
    6. Répétez les étapes 5.6.4 à 5.6.5.
    7. Injectez deux fois 100 μL de tampon de lavage à 50% et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie après chaque injection.
    8. Injecter trois fois 100 μL de tampon de recuit à 50 % et retirer la solution extrudée dans le portail de sortie après chaque injection.
    9. Injectez 65 μL de tampon de réaction enzymatique à 50%, évitez les bulles et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie.
    10. Stabilisez la puce chargée à RT pendant 5 min, et installez la puce sur le portail de puce du séquenceur. Choisissez le plan programmé à l’étape 6, vérifiez les informations et démarrez l’exécution; Il faut environ 1,5 h pour terminer.
    11. Effectuez le programme de lavage à l’eau dans les 72 heures suivant la fin de la course. Effectuer le lavage au chlorure avant le lavage à l’eau lorsque le temps dépasse 72 h. Arrêtez le séquenceur et fermez la vanne de l’azote.

6. Planifier une exécution de séquençage instruite dans le système du serveur rapporteur16

Remarque : Toutes les procédures de cette section sont effectuées sur Ion Proton Sequencer avec le système de serveur rapporteur.

  1. Connectez-vous au système serveur, sélectionnez l’onglet Plan et cliquez sur Exécuter le modèle de plan. Choisissez le génome entier comme type d’exécution et sélectionnez le modèle approprié dans la liste des modèles d’exécution planifiés.
  2. Dans l’onglet Plan , entrez ou effectuez les sélections suivantes :
    1. Entrez un nouveau nom de plan d’exécution en fonction du lot d’échantillons, sélectionnez hg19 (Homo sapiens) dans la liste déroulante Bibliothèque de référence , puis sélectionnez Aucun dans les listes déroulantes Régions cibles et Régions sensibles .
    2. Entrez le nombre de codes-barres utilisés dans le jeu d’échantillons, sélectionnez un code-barres dans la liste déroulante pour chaque échantillon, puis entrez un nom descriptif unique, ce qui peut être utile pour regrouper et suivre l’échantillon. Évitez d’utiliser l’exemple 1 par défaut et ainsi de suite.
    3. Sélectionnez Aucun dans l’onglet Ion Reporter , cliquez sur Suivant, puis sélectionnez ADN dans l’application et Génome entier comme technique cible.
    4. Dans l’onglet Kits , vérifiez les sélections ou apportez des modifications lorsque cela est approprié pour une exécution.
      1. Sélectionnez Ion Plus Fragment Library Kit dans la liste déroulante Library Kit Type (Type de kit de bibliothèque ). Sélectionnez Kit Ion PI HI-Q OT2 200 dans la liste déroulante Kit de modèles , puis choisissez OneTouch par défaut. Sélectionnez Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit dans la liste déroulante Kit de séquençage .
      2. Entrez 300 flux, sélectionnez Ion PITM Chip dans la liste déroulante Type de puce et sélectionnez IonXpress dans la liste déroulante Barcode Set .
      3. Annulez la sélection de Marquer comme doublons et la sélection de Activer le réalignement.
    5. Choisissez le plug-in approprié dans l’onglet Plug-ins pour effectuer l’analyse des données à l’étape 7. Terminez les sélections à l’étape des projets, cliquez sur Suivant, puis cliquez sur Planifier l’exécution dans le coin inférieur droit pour répertorier les exécutions planifiées.
    6. Dans l’onglet Exécutions planifiées , sélectionnez l’exécution nouvellement créée et vérifiez tous les paramètres dans la fenêtre de révision.

7. Analyse des données

  1. Analysez les variantes de nombre de copies (CNV) à l’aide d’un flux de travail bioinformatique.
    NOTE: Les CNV ont été analysés dans le flux de travail bioinformatique avec la mise en œuvre d’un algorithme basé sur un modèle de Markov caché (HMM)17; Le modèle utilise la couverture de lecture à travers le génome pour prédire le nombre de copies ou le statut de ploïdie du nombre entier (c.-à-d. 0, 1, 2, 3, etc.). Le pipeline bioinformatique global a été construit dans le plug-in d’un système de serveur de séquence, ce qui est illustré à la figure 2. L’étape de l’analyse bioinformatique dure en moyenne 4 heures.

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Résultats

Lorsque le plan de séquences se termine après le processus d’exécution dans la machine, le système de serveur de séquences affiche le résumé avec des informations descriptives sur les données générées, l’état de la puce, le taux de chargement du FAI et la qualité de la bibliothèque, comme illustré à la figure 2. Dans cette démonstration des résultats, 17,6 G de données dans la base totale ont été obtenues, et le taux de charge global de l’ISP était de 88% dans le total des puits de la puce; ...

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Discussion

L’aneuploïdie chromosomique des embryons est à l’origine d’une grande partie des pertes de grossesse, qu’elles soient conçues naturellement ou par fécondation in vitro (FIV). Dans la pratique clinique de la FIV, il est proposé que le dépistage de l’aneuploïdie embryonnaire et le transfert de l’embryon euploïdie pourraient améliorer les résultats de la FIV. L’hybridation in situ par fluorescence est la première technique adoptée pour la sélection du sexe et la PGT-A; Cependant, cette technique nécessite ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Zhangyong Ming et M. Rongji Hou pour leurs conseils sur l’application élargie du LIMS. Cette étude est soutenue par les projets de recherche spéciaux de l’APL pour la planification familiale (17JS008, 20JSZ08), le Fonds du Laboratoire clé de recherche sur les maladies métaboliques du Guangxi (n ° 20-065-76) et le Projet de recherche sur les sciences et technologies de la santé citoyenne de Guangzhou (201803010034).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 &mu ; m Unité de filtration de seringueMerkmilliporeMillex-HV
1,5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
15 mLGreiner Bio-One188261
2,0 mLDNA LoBind TubesEppendorf30108078
50 mLGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON
  ; Réactif Anstart Tap DNA polyméraseFAPON
AMPure XP (billes magnétiques pour la liaison à l’ADN)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Tampon de lyse cellulaireSouthern Medical UniversityTampon de lyse cellulaire contenant 40 mM de Tris (pH 8), 100 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 1 mM d’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA), 1 % (v/v) Triton X-100, 5 mM de sodium pyrophosphate, 2 mM &beta ;-glycérophosphate, 0,1 % SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
d’élution d’ADNNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Alcool éthyliqueGuangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientifiquehttp://www.chemicalreagent.com/
Réactifs d’amplification du génome entier développés indépendammentUniversitéLes réactifs se composent des composants suivants :
1. Lyse cellulaire
2. Amplification Solution pré-mélangée
  ;   ;   ; 1) Amorce WGA-P2 (10 &mu ; M)
  ;   ;   ; 2) dNTP (10 mM)
  ;   ;   ; 3) 5x tampon Anstart Taq (Mg2+ Plus)
3. Enzyme d’amplification
  ;   ; 1) ADN polymérase Anstart Tap (5 U/&mu ; L)
Ion PI Hi-Q OT2 200 KitThermo Fisher ScientificA26434Kit mentionné à l’étape 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit  ;   ;Thermo Fisher ScientificA26433
Système de protons ioniquesLife Technologies4476610
Serveur de reporters d’ions 4487118
isopropanolréactifs chimiques de Guangzhouhttp://www.chemicalreagent.com/
Kit de préparationDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
de vie de l’eau sans nucléaseAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 SystemLife Technologies4474779  ; Système d’amplification et d’enrichissement de modèles
Tubes PCRAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara Bio USAR300671
Pointes de pipetteProduits scientifiqueshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Mini centrifugeuse portable LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluoromètreLife TechnologiesQ33216Fluorimètre
Qubit Tubes d’essaiLife TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS Kit d’essaiLife TechnologiesQ32851
Séquenceur Système de serveurThermo Fisher ScientificTorrent Suite
Logiciel Séquençage Réactions Kit universelDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Ce kit contient les composants suivants :
1. Kit de préparation de modèle Set

1.1 Kit de préparation de modèle :
Tampon PCR d’émulsion
Mélange d’enzymes PCR d’émulsion
Solution de support de modèle

1.2 Solutions de préparation de modèle :
Huile de réaction I
Solution de rupture d’émulsifiant II
Huile de réaction II
Eau sans nucléase
Tween solution
Solution de désémulsification I
Solution de lavage des gabarits
Solution de lavage des billes C1
Solution de remise en suspension des billes C1
Solution de remise en suspension des gabarits

1.3 Matériaux de préparation des gabarits :
Tube à réactifs Connecteur I

Tube de collecte
Pipette à tube réactif I
Plaque d’amplification
8 puits strip
Pointes dédiées
Adaptateur de lavage de préparation de gabarit
Filtre de préparation de gabarit

2. Kit de séquençage Set

2.1 Kit de séquençage :
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Solution enzymatique de séquençage
Amorces de séquençage
Modèles de contrôle de la qualité

2.2  ; Solutions de séquençage :
Solution de séquençage II
Solution de séquençage IIII
Tampon de recuit
Tampon de chargement
Agent moussant
Pastilles de chlore
C1 bead

2.3 Matériaux de séquençage :
Tube de réactif II
Bouchon de tube de réactif
Tube de réactifbr/ Tube de réactif  ; II
Bouteille de réactif
Bouteilles de réactifs

3. Chip
Solution d’hydroxyde de sodiumSigma72068-100ML
Thermal CyclerLife Technologies4375786
tampon médicale du Sud Usine de de la bibliothèque Technologies de qualité

Références

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
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