Article de méthode

Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn

DOI :

10.3791/63499

⸱

1 mars 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

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Résumé

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Le présent protocole décrit le développement d’un modèle de colite semblable à celui de Crohn chez les rongeurs. L’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS et un élargissement mécanique est observé dans le segment proximal de la sténose. Ces changements permettent d’étudier le stress mécanique dans la colite.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) telles que la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal affectant environ 20 pour 1 000 000 en Europe et aux États-Unis. La MC se caractérise par une inflammation transmurale, une fibrose intestinale et une sténose luminale. Bien que les thérapies anti-inflammatoires puissent aider à contrôler l’inflammation, elles n’ont aucune efficacité sur la fibrose et la sténose dans la MC. La pathogenèse de la MC n’est pas bien comprise. Les études actuelles se concentrent principalement sur la délimitation des mécanismes de réponse immunitaire intestinale dérégulés. Alors que l’inflammation transmurale associée à la MC, la fibrose intestinale et la sténose luminale représentent toutes un stress mécanique à la paroi intestinale, le rôle du stress mécanique dans la MC n’est pas bien défini. Pour déterminer si le stress mécanique joue un rôle pathogène indépendant dans la MC, un protocole de modèle de colite de type CD induite par TNBS chez les rongeurs a été développé. Ce modèle d’inflammation transmurale et de fibrose induit par le TNBS ressemble aux caractéristiques pathologiques de la MC dans le côlon. Elle est induite par instillation intracolononique de TNBS dans le côlon distal des rats Sprague-Dawley adultes. Dans ce modèle, l’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS (site I). Une distension mécanique est observée dans la portion proximale au site d’instillation (site P), représentant un stress mécanique mais pas d’inflammation visible. La partie colique distale à l’inflammation (site D) ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements distinctifs de l’expression des gènes, de la réponse immunitaire, de la fibrose et de la croissance musculaire lisse à différents sites (P, I et D) ont été observés, soulignant un impact profond du stress mécanique. Par conséquent, ce modèle de colite de type CD nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogènes de la MC, en particulier le rôle du stress mécanique et de l’expression des gènes induits par le stress mécanique dans la dérégulation immunitaire, la fibrose intestinale et le remodelage tissulaire dans la MC.

Introduction

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Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC), se caractérisent par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal (GI). Il affecte ~ 1-2 millions d’Américains1. Les coûts annuels estimés des soins des MII aux États-Unis sont de 11,8 milliards de dollars. Contrairement à la CO, la MC est caractérisée par une inflammation transmurale et la formation de sténoses 2,3. La formation de sténoses (sténose) survient chez jusqu’à 70 % des patients atteints de la MC3 et peut être causée par une inflammation transmurale (sténose inflammatoire) ou une fibrose intestinale (sténose fibrotique)4,5. La fibrose intestinale est caractérisée par un dépôt excessif de collagène et d’autres matrices extracellulaires (ECM) avec des cellules musculaires lisses (SMC) comme l’un des principaux types de cellules mésenchymateuses impliquées dans le processus 3,4. L’hyperplasie musculaire lisse associée à l’hypertrophie est un autre changement histologique important de la sténose fibrotique dans laCD 6. Bien que la formation de sténoses dans la MC soit associée à une inflammation chronique, aucun traitement anti-inflammatoire n’est efficace, à l’exception du traitement chirurgical 2,6. Cependant, les récidives post-opératoires sont presque de 100%, avec suffisamment de temps 2,7. En tant que réponse inflammatoire, la fibrose et l’hyperplasie SMC peuvent également se développer dans des conditions non inflammatoires (c.-à-d. occlusion intestinale) dans l’intestin 8,9; on pense que des mécanismes dépendants de l’inflammation et indépendants sont impliqués dans la formation desténoses 3,4. Étant donné que des recherches approfondies sur les mécanismes dépendants de l’inflammation ne se sont pas traduites par un traitement efficace pour la formation de sténoses, des études sur le rôle possible des mécanismes indépendants de l’inflammation dans la fibrose intestinale sont nécessaires.

En tant que facteur non inflammatoire, le stress mécanique (SEP) associé à l’œdème, à l’infiltration de cellules inflammatoires, à la déformation tissulaire, à la fibrose et à la sténose 10,11,12,13 est couramment rencontré dans les MII, en particulier la MC, qui se caractérise par une inflammation transmurale. Le stress mécanique est le plus remarquable dans la CD sténotique, où la sténose (inflammatoire ou fibrotique) dans le site de l’inflammation présente un stress mécanique dans le tissu local et conduit à une distension de la lumière dans le segment proximal au site d’obstruction10,14. Des études in vitro antérieures ont démontré que le stress mécanique modifie l’expression génique de médiateurs inflammatoires spécifiques (c.-à-d. COX-2, IL-6)8,14,15 et les facteurs de croissance (c.-à-d. TGF-β) dans les tissus gastro-intestinaux, en particulier les cellules musculaires lisses intestinales (SMC)16. Des études récentes ont également révélé que l’expression de médiateurs pro-fibrotiques spécifiques tels que le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) est très sensible au stress mécanique17,18. On a émis l’hypothèse que le stress mécanique pourrait jouer un rôle pathogène indépendant dans l’inflammation, la fibrose et le remodelage des tissus associés à la MC. Cependant, l’importance pathogène du stress mécanique dans l’inflammation intestinale, la fibrose et l’hyperplasie des muscles lisses dans la MC reste largement inexplorée. Cela peut être dû en partie au fait que l’inflammation est un processus plus visible et mieux étudié que le stress mécanique. Plus important encore, il n’y a pas eu de modèle animal bien défini de MII pour distinguer l’effet du stress mécanique de celui de l’inflammation.

Les travaux actuels décrivent un modèle rongeur de colite de type Crohn induite par injection intracolonique de réactif haptène acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS)19,20, qui pourrait servir à étudier le rôle du stress mécanique dans la MC. Il a été constaté que l’instillation de TNBS induisait une inflammation transmurale localisée (~ 2 cm de longueur) avec rétrécissement de la lumière (sténose) dans le côlon distal. La sténose entraîne une distension intestinale marquée (stress mécanique)14,15 mais une inflammation non visible dans le segment colique proximal du site d’instillation. Au contraire, le segment du côlon distal au site de la sténose ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements significatifs spécifiques au site dans l’expression des gènes, l’inflammation, la fibrose et l’hyperplasie SMC ont été observés dans les trois sites différents. Les résultats suggèrent que le stress mécanique, en particulier l’expression génétique induite par le stress mécanique, peut jouer un rôle essentiel dans le développement de la fibrose et de l’hyperplasie dans la colite de Crohn.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas (#0907051C). Des rats Sprague-Dawley mâles ou femelles, âgés d’environ 8 à 9 semaines, ont été utilisés pour l’étude.

1. Préparation des animaux

  1. Jeûnez les rats pendant 24 heures et traitez-les avec un laxatif (nettoyant pour l’intestin, voir tableau des matériaux) pendant la nuit.
  2. Le lendemain, anesthésiez les rats à l’aide d’un système d’anesthésie (voir Tableau des matériaux) en les exposant à 2% d’isoflurane avec 1 L / min d’oxygène pendant l’administration de TNBS. Vérifiez les réflexes ou pincez les orteils pour confirmer l’anesthésie.
  3. Préparez une solution de TNBS fraîche en fonction du poids corporel.
    NOTE: TNBS - 65 mg / kg de poids corporel dans 250 μL d’éthanol à 40% a été utilisé.
  4. Mettez les rats en position couchée sur la table d’anesthésie. Pour induire la colite, insérez à travers l’anus un cathéter en polyuréthane ouvert de qualité médicale à environ 7-8 cm du bord anal et instillez doucement le TNBS (préparé à l’étape 1.3) dans le côlon19. Administrer les rats témoins simulés avec 250 μL de solution saline seulement.
  5. Après avoir instillé du TNBS ou une solution saline, gardez les rats en décubitus dorsal et légèrement tête baissée (~ 30 °), avec l’anus fermé pendant 2 minutes pour aider à la distribution du TNBS et éviter les déversements.
  6. Fournissez aux rats de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant 7 jours et observez les rats quotidiennement pour le poids corporel, les absorptions de nourriture, les matières fécales et l’état de santé général.

2. Préparations tissulaires

  1. Le jour de l’euthanasie, euthanasier les rats par inhalation de CO2 et confirmer l’euthanasie avec luxation cervicale.
  2. Ouvrez l’abdomen du rat à l’aide de ciseaux et de pinces de qualité chirurgicale.
  3. Retirez soigneusement tout le côlon (au-dessus du canal anal) et transférez immédiatement le côlon dans un tampon HBSS glacé 1x.
  4. Redressez le deux-points dans le tampon et mesurez la longueur du côlon à l’aide d’une règle. Prenez du fil de nylon et un cercle autour du côlon pour mesurer la circonférence externe des segments du côlon en contrôle et des rats traités au TNBS. Prenez des tissus de pleine épaisseur pour l’histologie.
  5. Coupez le côlon le long de la carte mésentérique et nettoyez bien le côlon avec un tampon HBSS. Évaluez le côlon pour le score d’inflammation macroscopique en fonction des critères décrits précédemment19 avec des modifications minimales.
    REMARQUE: 0 = muqueuse normale; 1 = hyperémie localisée mais pas d’érosions ou d’ulcères; 2 = ulcère et sténose (zone touchée < 5 mm); 3 = ulcère grave, cicatrice et sténose (zone touchée > 5 mm).
  6. Prélever des échantillons de tissu colique du site P (portion de 2 à 3 cm avant la marge buccale du site d’inflammation), du site I (site d’inflammation, généralement à 4-6 cm de l’extrémité du côlon, où le TNBS est instillé) et du site D (portion de 1 à 2 cm distale à la marge aborale du site d’inflammation), respectivement chez des rats traités par TNBS.
    REMARQUE: Le tissu du côlon d’environ 1-2 cm de long a été prélevé sur chaque segment. De plus, les tissus du côlon de 2 cm de long (~4-6 cm de l’extrémité du côlon) des rats traités à la solution saline ont été prélevés comme contrôle fictif (S) (Figure 1).
  7. Prélever des échantillons de tissus de chaque site pour une préparation de pleine épaisseur et, si vous le souhaitez, des couches de muqueuse / sous-muqueuse et de muscularis externa, respectivement,ainsi que 21,22.
  8. Congeler d’abord les échantillons de tissus dans de l’azote liquide avant de les stocker à -80 °C pour les entreposer jusqu’à un an et à des fins futures (c.-à-d. préparations d’ARN).

3. Évaluation histopathologique de l’inflammation intestinale et de la fibrose

  1. Fixer les tissus du côlon de pleine épaisseur dans 10% de formol pendant 48 h, puis transférer à 70% d’éthanol pendant 24-48 h.
  2. Utilisez un microtome pour couper des sections de paraffine de 5 μm d’épaisseur pour l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et les taches trichromes de Masson 6,19,23 (voir tableau des matériaux), respectivement.
  3. Acquérir et visualiser des images avec un microscope vertical équipé d’une caméra haute résolution avec logiciel compatible (voir Tableau des matériaux).
  4. Grade des indices d’inflammation et de fibrose par deux investigateurs indépendants, dont un pathologiste chirurgical gastro-intestinal selon les critères décrits précédemment 6,23 avec modifications. Voir le dossier supplémentaire 1 pour les scores.
  5. Mesurez l’épaisseur et le nombre de cellules des couches musculaires circulaires et longitudinales par section transversale dans quatre vues de chaque spécimen coloré H & E et prenez la moyenne des quatre mesures pour chaque spécimen.

4. Extraction de l’ARN et RT-PCR quantitative

  1. Homogénéiser les tissus du côlon excisés obtenus à partir du contrôle fictif et de trois sites (P, I, D) de rats de colite TNBS dans le réactif d’extraction d’un kit d’extraction d’ARN (voir tableau des matériaux).
  2. Isolez l’ARN de chaque échantillon à l’aide du kit. Éluez la pastille d’ARN dans 30 μL d’eau sans RNase.
  3. Quantifier la concentration d’ARN et vérifier la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume (voir tableau des matériaux).
  4. Utilisez 1 μg d’ARN total pour synthétiser l’ADNc21,22 à l’aide du kit de synthèse d’ARN (voir tableau des matériaux).
  5. Analyser et quantifier les niveaux d’expression des gènes en effectuant une PCR en temps réel avec 50 ng d’ADNc comme modèle, des sondes d’IL-6 et du CTGF à l’aide d’un kit pcR commercial pour un système de PCR en temps réel (voir Tableau des matériaux).
  6. Utilisez l’ARNr du gène de contrôle 18S pour normaliser les échantillons et quantifier l’expression relative des gènes en utilisant les valeurs Cq obtenues.

5. Analyse statistique

  1. Utilisez un logiciel d’analyse statistique (voir Tableau des matériaux) pour comparer le contrôle simulé et les rats de colite TNBS.
  2. Considérez que la valeur p < 0,05 est statistiquement significative15,19.
  3. Pour tester les différences entre deux groupes, utilisez l’analyse t-test de Student et effectuez un test ANOVA si les comparaisons sont supérieures à deux groupes15,19.

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Résultats

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Vue macroscopique de la colite de type Crohn induite par l’instillation intracolique du TNBS
Comme le montre la figure 1, l’instillation intracolonique de TNBS chez le rat a induit une inflammation transmurale localisée (~2 cm de longueur) avec une paroi intestinale épaissie et une lumière rétrécie (sténose) dans le site d’instillation dans le côlon distal (figure 1A). Le site d’instillation du TNBS est appelé site I. En raison de l’inflammat...

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Discussion

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La colite induite par le TNBS a été introduite en 1989 et a été utilisée comme modèle expérimental de la maladie de Crohn depuis lors 19,20,23. Les caractéristiques importantes de ce modèle chez les rongeurs comprennent le développement d’une inflammation transmurale qui ressemble beaucoup aux lésions histopathologiques développées dans la maladie de Crohn humaine19,20. ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail est soutenu en partie par des subventions des NIH (R01 DK124611 à XZS) et du département de la Défense des États-Unis (W81XWH-20-1-0681 à XZS). Le travail d’histologie a été réalisé avec l’aide du laboratoire de pathologie chirurgicale de l’UTMB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Logiciel de contrôle ACT-1 Ver2.63
C1000 avec module de réaction rapide à 96 puitsBIO-RAD1851196
CFX96 Module de réaction optique pour systèmes de PCR en temps réelBIO-RAD1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Colorant spécialDakoAR310
Dako-Agilent Masson’s Kit Trichrome ref# AR173DakoAR173
DXM1200 Appareil photo numérique couleur HR NikonDXM1200
Eucaryote 18S rRNA Contrôle endogèneThermoFisher Scientific4352930E
E-Z AnesthesiaE-Z Systems Inc.EZ-155
GraphPad Prism 9GraphPad9.0.2 (161)
Plaques PCR à coque dure à 96 puits, profil bas, paroi mince, à jupe, blanche/claireBIO-RADHSP9601
HBSS (Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1x sans calcium ni magnésium)CORNING21-021-CV
HM 325 MicrotomeThermo Scientific23-900-667
IsofluranePiramalNDC 66794-017-10
Système d’imagerie numérique LI-COR OdysseyLI-COR9120
Mastercycler epGradient Thermocycleur avec panneau de commande 5340 ThermocycleurEppendorf5341
Cathéter en polyuréthane à bout ouvert de qualité médicaleCovidien8890703013
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotomètresThermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Microscope droitNikonE800
Sandwichs en papier nitrocellulose/filtre Paquet de 50, 0,45 & mu ; m, 7 x 8,5 cmBIO-RAD1620215
Polyéthylène glycol 3350, laxatif osmotiqueMiralaxC8175Dose : 17g dans 226 mL d’eau
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Colonnes, tubes de collecte (1,5 mL et 2 mL), réactifs et tampons sans RNase		QIAGEN74106
SuperScript III Système de synthèse premier brinThermoFisher Scientific18080051
Dosages d’expression génique TaqMan Rn00573960_g1 sonde CTGFThermoFisher Scientific4331182
Dosages d’expression génique TaqMan Rn99999011_m1 sonde IL6ThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444557
Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1Sakura6190
Tissue-Tek Prisma Plus Colorateur de lames automatiséSakura6171
TNBS (solution d’acide picrylsulfonique)SIGMA-ALDRICH92822
Thermocycleur tactile Nikon DXM1200F

Références

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Mots-clés

Mod le de colite au TNBSinflammation transmuralefibrose intestinalest nose luminaledistension coliqueremodelage tissulaireexpression g nique

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