Le présent protocole décrit le développement d’un modèle de colite semblable à celui de Crohn chez les rongeurs. L’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS et un élargissement mécanique est observé dans le segment proximal de la sténose. Ces changements permettent d’étudier le stress mécanique dans la colite.
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Article de méthode
Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn
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Résumé
Résumé
Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) telles que la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal affectant environ 20 pour 1 000 000 en Europe et aux États-Unis. La MC se caractérise par une inflammation transmurale, une fibrose intestinale et une sténose luminale. Bien que les thérapies anti-inflammatoires puissent aider à contrôler l’inflammation, elles n’ont aucune efficacité sur la fibrose et la sténose dans la MC. La pathogenèse de la MC n’est pas bien comprise. Les études actuelles se concentrent principalement sur la délimitation des mécanismes de réponse immunitaire intestinale dérégulés. Alors que l’inflammation transmurale associée à la MC, la fibrose intestinale et la sténose luminale représentent toutes un stress mécanique à la paroi intestinale, le rôle du stress mécanique dans la MC n’est pas bien défini. Pour déterminer si le stress mécanique joue un rôle pathogène indépendant dans la MC, un protocole de modèle de colite de type CD induite par TNBS chez les rongeurs a été développé. Ce modèle d’inflammation transmurale et de fibrose induit par le TNBS ressemble aux caractéristiques pathologiques de la MC dans le côlon. Elle est induite par instillation intracolononique de TNBS dans le côlon distal des rats Sprague-Dawley adultes. Dans ce modèle, l’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS (site I). Une distension mécanique est observée dans la portion proximale au site d’instillation (site P), représentant un stress mécanique mais pas d’inflammation visible. La partie colique distale à l’inflammation (site D) ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements distinctifs de l’expression des gènes, de la réponse immunitaire, de la fibrose et de la croissance musculaire lisse à différents sites (P, I et D) ont été observés, soulignant un impact profond du stress mécanique. Par conséquent, ce modèle de colite de type CD nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogènes de la MC, en particulier le rôle du stress mécanique et de l’expression des gènes induits par le stress mécanique dans la dérégulation immunitaire, la fibrose intestinale et le remodelage tissulaire dans la MC.
Introduction
Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC), se caractérisent par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal (GI). Il affecte ~ 1-2 millions d’Américains1. Les coûts annuels estimés des soins des MII aux États-Unis sont de 11,8 milliards de dollars. Contrairement à la CO, la MC est caractérisée par une inflammation transmurale et la formation de sténoses 2,3. La formation de sténoses (sténose) survient chez jusqu’à 70 % des patients atteints de la MC3 et peut être causée par une infl....
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas (#0907051C). Des rats Sprague-Dawley mâles ou femelles, âgés d’environ 8 à 9 semaines, ont été utilisés pour l’étude.
1. Préparation des animaux
- Jeûnez les rats pendant 24 heures et traitez-les avec un laxatif (nettoyant pour l’intestin, voir tableau des matériaux) pendant la nuit.
- Le lendemain, anesthésiez les rats à l’aide d’un système d’anesthésie (voir Tableau des matériaux) en les exposant à 2% d’i....
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Résultats
Vue macroscopique de la colite de type Crohn induite par l’instillation intracolique du TNBS
Comme le montre la figure 1, l’instillation intracolonique de TNBS chez le rat a induit une inflammation transmurale localisée (~2 cm de longueur) avec une paroi intestinale épaissie et une lumière rétrécie (sténose) dans le site d’instillation dans le côlon distal (figure 1A). Le site d’instillation du TNBS est appelé site I. En raison de l’inflammat.......
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Discussion
La colite induite par le TNBS a été introduite en 1989 et a été utilisée comme modèle expérimental de la maladie de Crohn depuis lors 19,20,23. Les caractéristiques importantes de ce modèle chez les rongeurs comprennent le développement d’une inflammation transmurale qui ressemble beaucoup aux lésions histopathologiques développées dans la maladie de Crohn humaine19,20. .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu en partie par des subventions des NIH (R01 DK124611 à XZS) et du département de la Défense des États-Unis (W81XWH-20-1-0681 à XZS). Le travail d’histologie a été réalisé avec l’aide du laboratoire de pathologie chirurgicale de l’UTMB.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Logiciel de contrôle ACT-1 Ver2.63 | |||
| C1000 avec module de réaction rapide à 96 puits | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Module de réaction optique pour systèmes de PCR en temps réel | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Colorant spécial | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson’s Kit Trichrome ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Appareil photo numérique couleur HR Nikon | DXM1200 | ||
| Eucaryote 18S rRNA Contrôle endogène | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Plaques PCR à coque dure à 96 puits, profil bas, paroi mince, à jupe, blanche/claire | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1x sans calcium ni magnésium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| Système d’imagerie numérique LI-COR Odyssey | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermocycleur avec panneau de commande 5340 Thermocycleur | Eppendorf | 5341 | |
| Cathéter en polyuréthane à bout ouvert de qualité médicale | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotomètres | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Microscope droit | Nikon | E800 | |
| Sandwichs en papier nitrocellulose/filtre Paquet de 50, 0,45 & mu ; m, 7 x 8,5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyéthylène glycol 3350, laxatif osmotique | Miralax | C8175 | Dose : 17g dans 226 mL d’eau |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Colonnes, tubes de collecte (1,5 mL et 2 mL), réactifs et tampons sans RNase | QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III Système de synthèse premier brin | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Dosages d’expression génique TaqMan Rn00573960_g1 sonde CTGF | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Dosages d’expression génique TaqMan Rn99999011_m1 sonde IL6 | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Colorateur de lames automatisé | Sakura | 6171 | |
| TNBS (solution d’acide picrylsulfonique) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Références
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G.
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
