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Article de méthode

Analyse de la signalisation lipidique dans les photorécepteurs de la drosophile à l’aide de la spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/63516

⸱

7 mars 2022

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

Dans cet article

Résumé

Le manuscrit présente des protocoles de spectrométrie de masse polyvalents, robustes et sensibles permettant d’identifier et de quantifier plusieurs classes de lipides issus des photorécepteurs de la drosophile .

Résumé

L’activation de la phospholipase Cβ (PLCβ) est une étape essentielle lors de la transduction sensorielle dans les photorécepteurs de la drosophile . L’activité PLCβ entraîne l’hydrolyse du lipide membranaire phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2], conduisant finalement à l’activation des canaux TRP (TRPL) et TRP like (TRPL). L’activité de PLCβ conduit également à la génération de nombreuses espèces lipidiques, dont plusieurs ont été proposées pour jouer un rôle dans l’activation des TRP et TRPL. De plus, plusieurs classes de lipides ont été proposées pour jouer un rôle clé dans l’organisation de la biologie cellulaire des photorécepteurs afin d’optimiser les réactions de signalisation pour une transduction sensorielle optimale. Historiquement, ces découvertes ont été motivées par la capacité d’isoler les mutants de la drosophile pour les enzymes qui contrôlent les niveaux de lipides spécifiques et d’effectuer une analyse de la physiologie des photorécepteurs chez ces mutants. Plus récemment, de puissantes méthodes de spectrométrie de masse pour l’isolement et l’analyse quantitative des lipides avec une sensibilité et une spécificité élevées ont été développées. Ceux-ci sont particulièrement adaptés à une utilisation chez la drosophile où l’analyse des lipides est désormais possible à partir des photorécepteurs sans qu’il soit nécessaire de marquer les radionucléides. Dans cet article, les considérations conceptuelles et pratiques dans l’utilisation de la spectrométrie de masse lipidique pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise de divers lipides de signalisation dans les photorécepteurs de la drosophile sont couvertes. Avec les méthodes existantes en génétique moléculaire et en analyse physiologique, ces lipides sont susceptibles d’améliorer le pouvoir des photorécepteurs en tant que système modèle pour les découvertes en biologie.

Introduction

La phototransduction chez la drosophile est médiée par une cascade PLCβ couplée aux protéines G, conduisant à l’activation des canaux activés par la lumière TRP et TRPL1. PLCβ hydrolyse le phospholipide lié à la membrane, le phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] et génère le diacylglycérol (DAG) et l’inositol 1,4,5 trisphosphate (IP3). Le DAG est ensuite phosphorylé par la DAG-kinase pour générer de l’acide phosphatidique (PA). Par la suite, par une série de réactions qui impliquent la génération d’intermédiaires lipidiques, PI(4,5)P2 est régénéré2. Plusieurs composants de ce cycle PI(4,5)P2 ont des fonctions dans les photorécepteurs de la drosophile . Le mécanisme par lequel l’activation de l’API conduit à la porte de canal TRP et TRPL n’est pas résolu. Cependant, plusieurs sources de données suggèrent que les intermédiaires lipidiques générés par l’hydrolyse du PI(4,5)P2 pourraient interférer ce processus3. Ainsi, il est très important d’identifier et de quantifier ces intermédiaires lipidiques pour faire la lumière sur le mécanisme d’activation du TRP et du TRPL dans la phototransduction de la drosophile . En plus de leur rôle dans la phototransduction en soi, les lipides jouent également plusieurs rôles importants dans l’organisation cellulaire des photorécepteurs (examiné dans3). La compréhension de ces rôles fonctionnels des lipides est facilitée par la capacité de détecter et de quantifier leurs niveaux in vivo. Cet article fournit une vue d’ensemble ainsi que des protocoles pour le choix et la mise en œuvre de méthodes de quantification des lipides à partir des photorécepteurs de la drosophile .

Historiquement, l’analyse des lipides consistait en un fractionnement par classes chimiques suivi d’une analyse de classes individuelles. Pour identifier et quantifier avec succès les lipides, de nombreuses méthodes d’analyse ont été développées, soit des analyses ciblées ou non cibléesdes lipides 4,5,6,7,8,9,10. L’analyse ciblée se concentre sur les lipides connus et utilise une méthode spécifique à haute sensibilité pour l’analyse quantitative de ces lipides spécifiques. L’analyse non ciblée des lipides vise à détecter simultanément plusieurs espèces de lipides dans un échantillon. Ces méthodes d’analyse comprennent la chromatographie sur couche mince (CCM)4, la chromatographie en phase gazeuse (GC)5, la chromatographie liquide (LC)6, les tests immuno-enzymatiques (ELISA)7, la résonance magnétique nucléaire (RMN)8, le marquage des radionucléides et la spectrométrie de masse (MS)9,10. Bien que le marquage radioactif soit une méthode sensible pour la détection des lipides et puisse être utilisé dans le contexte de cellules cultivées, son utilisation dans l’analyse des lipides dans des organismes intacts tels que la drosophile est difficile en raison des considérations de sécurité liées au radiomarquage des animaux volants vivants. L’autre défi du marquage radioactif est qu’il dépend du marquage de tous les pools de précurseurs jusqu’à un quasi-équilibre, ce qui peut être difficile dans le contexte des modèles in vivo.

L’analyse complète des lipides à l’aide de la spectrométrie de masse est une avancée récente rendue possible par le développement des technologies modernes de spectrométrie de masse11. L’analyse des lipides basée sur la MS offre plusieurs avantages, notamment la petite taille des échantillons, l’applicabilité à des échantillons provenant de modèles animaux, une sensibilité élevée, une spécificité ainsi qu’un débit élevé. En particulier, l’utilisation intensive de l’ionisation par électronébulisation a conduit à une amélioration des performances de la MS pour l’analyse des lipides. L’amélioration des analyseurs de masse dans les spectromètres de masse, y compris la combinaison de différents analyseurs de masse, a ajouté des avantages supplémentaires et le développement d’un analyseur de masse à haute résolution a relancé les études sur les lipides11. L’analyse basée sur la MS caractérise les molécules lipidiques de deux manières principales : (1) la lipidomique descendante où les expériences MS visent à caractériser quantitativement rapidement les changements globaux au sein du lipidome et reposent uniquement sur des masses précises de précurseurs lipidiques intacts12 ; (2) La lipidomique ascendante qui quantifie les espèces moléculaires individuelles en détectant les ions de fragments structurels caractéristiques à l’aide de MS13,14 en tandem.

Dans l’ensemble, l’analyse des lipides dans les photorécepteurs de la drosophile se déroule en deux étapes : d’abord, l’extraction des lipides des tissus oculaires et ciffaux et, d’autre part, l’analyse des lipides extraits par MS. Cela peut être réalisé en utilisant l’une des méthodes suivantes : séparation des lipides par chromatographie liquide (LC) couplée à la MS ou sans séparation chromatographique par utilisation de la lipidomique shotgun/MS à perfusion directe (DIMS). Les deux approches de profilage lipidique sont basées sur l’utilisation de la spectrométrie de spectrométrie par ionisation par électronébulisation (ESI-MS) et se sont avérées sensibles, quantitatives et efficaces10,15. Dans l’analyse DIMS, l’identification des lipides est basée sur la masse ionique des précurseurs, les balayages de perte neutre et les signatures spécifiques à la classe lipidique 14,16,17,18. Bien que cette approche combine la vitesse d’analyse et la robustesse, la suppression ionique des lipides de faible abondance due à la présence de lipides de haute abondance et hautement polarisables dans l’échantillon ne peut être évitée. Ainsi, les lipides peu abondants tels que les phosphoinositides et le PA sont souvent non détectés ou mal détectés par les plateformes DIMS standard, en raison de la suppression des ions entre autres raisons19,20. La séparation par chromatographie liquide avant la MS (LC-MS) peut aider à surmonter la suppression ionique et à cibler l’analyse de classes spécifiques ou d’espèces de lipides d’intérêt21.

Dans cet article, les étapes de la quantification des principaux lipides d’intérêt dans les photorécepteurs de la drosophile sont décrites. À cet égard, trois approches MS différentes ont été optimisées : (1) DIMS à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution, (2) chromatographie liquide en phase inverse-MS (RPLC-MS) à l’aide d’un spectromètre de masse à triple quadruple, et (3) chromatographie en phase normale - surveillance de réactions multiples - balayage ionique de produit amélioré (nplc-mrm-epi-ms) à l’aide d’un spectromètre de masse à triple quadruple avec une fonction de balayage d’ions de produit améliorée. Le choix entre ces méthodes est dicté par les questions de recherche spécifiques étudiées. Pour une description et une analyse globales de tous les types de glycérophospholipides impliqués dans la phototransduction, il faut utiliser le DIMS. Cependant, il convient de noter que dans cette approche, il est peu probable que des glycérophospholipides faiblement polarisables et de faible abondance, tels que les phosphoinositides, soient détectés22. Pour détecter ces lipides de faible abondance, une RPLC-MS post-dérivatisation doit être effectuée. En utilisant cette approche, nous avons réussi à détecter et à quantifier l’acide phosphatidique (PA)23,24,25, le phosphatidylinositol (PI), le phosphatidylinositol 5 phosphate (PI5P)26, le phosphatidylinositol 4 phosphate (PI4P) et le PI(4,5)P 2 27. Les méthodes DIMS et RPLC-MS de post-dérivation génèrent des informations au niveau de la classe lipidique. Par exemple, en utilisant ces deux méthodes, on peut quantifier PA (34:2) dont m/z est compatible avec plusieurs espèces moléculaires, notamment : (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) et (viii) PA (20:0/14:2). En utilisant ces méthodes, on ne peut pas obtenir d’informations sur la composition des chaînes acyles grasses du PA (34:2) présent dans l’échantillon. Ce défi peut être surmonté par une méthode MS hybride qui associe la séparation LC, la surveillance des réactions multiples (MRM) et le balayage ionique de produit amélioré (EPI). Cette méthode est à la fois sensible et quantitative et permet : une mesure directe, c’est-à-dire sans pré-marquage ni post-traitement de l’échantillon, et permet d’établir l’espèce moléculaire avec une information exacte sur la chaîne acyle grasse25. En utilisant cette méthode, nous avons identifié un grand nombre d’espèces moléculaires de PA et déterminé la composition exacte des chaînes acyles grasses au niveau SN1 et SN2 du squelette glycérol. Cette approche sera utile lors de l’analyse de la fonction d’espèces moléculaires spécifiques de n’importe quelle classe de lipides dans les photorécepteurs. Les protocoles détaillés présentés ici pour chacun de ces types d’analyses peuvent être adaptés à d’autres lipides de signalisation pertinents pour la fonction des photorécepteurs de la drosophile (pour les schémas, voir Figure 1). Il convient de noter que des méthodes détaillées d’analyse lipidomique de plusieurs autres classes de lipides (non couvertes dans cet article) ont été décrites ailleurs. Il s’agit notamment des céramides28,29, des sphingolipides30,31, des lipides neutres tels que les diglycérides et les triglycérides32,33 et des stérols15,33. Dans certains cas, des méthodes d’analyse de ces lipides ont été décrites pour les tissus larvaires de la drosophile et pourraient être adaptées pour être utilisées dans les photorécepteurs.

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Protocole

1. Élevage des mouches et préparation des produits chimiques

  1. Mouches arrière (Drosophila melanogaster) sur de la nourriture anti-mouches standard dans un incubateur avec 50 % d’humidité relative à 25 °C sans éclairage interne. Préparez de la nourriture pour mouches en ajoutant 80 g/L de farine de maïs, 20 g/L de D-glucose, 40 g/L de saccharose, 8 g/L d’agar, 15 g/L d’extrait de levure, 4 mL d’acide propionique, 0,7 g/L de TEGO (para-hydroxybenzoate de méthyle) et 0,6 mL d’acide orthophosphorique tel que décrit à lasection 34 et sont également disponibles à https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Cultivez un ensemble de mouches, après l’éclosion, dans un incubateur refroidi maintenu à 25 °C avec un éclairage continu à lumière blanche de ~2 000 lux.
  2. Préparez le tampon d’élution de phosphoinositide (PEB) en ajoutant du chloroforme :méthanol :2,4 M d’acide chlorhydrique dans un rapport de 250:500:200 (vol/vol/vol). Préparez le tampon de lavage en phase inférieure en ajoutant du méthanol :1 M acide chlorhydrique :chloroforme dans un rapport de 235:245:15 (vol/vol/vol). Préparez la solution de lavage post-dérivatisation en ajoutant du chloroforme :méthanol :eau dans un rapport de 8:4:3 (vol/vol/vol).
    REMARQUE : Utilisez des solvants et des produits chimiques de qualité MS. Ne stockez pas le tampon PEB et LPWS pendant plus de 3 mois.
  3. Utilisez la colonne C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) pour les phosphoinositides, PI4P et PI(4,5)P2 et la colonne C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) pour le PA, la phosphatidylcholine (PC) et le phosphatidylinositol (PI). Pour la méthode NPLC-MRM-EPI, utilisez la colonne de silice (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Préparez l’éluant A en ajoutant de l’hexane :alcool isopropylique :100 mM d’acétate d’ammonium aqueux dans un rapport de 68:30:2 (vol/vol/vol) et de l’éluant B en ajoutant de l’hexane :alcool isopropylique :100 mM d’acétate d’ammonium aqueux dans un rapport de 70:20:10 (vol/vol/vol) pour PA, PC et PI. Préparez le solvant A pour les phosphoinositides en ajoutant de l’acide formique à 0,1 % dans l’eau et le solvant B à ajouter de l’acide formique à 0,1 % dans de l’acétonitrile.

2. Isolement des tissus

  1. Prélevez 10 mouches par échantillon à l’aide d’un anesthésique au dioxyde de carbone (CO2) (les mouches s’immobilisent en quelques secondes) et décapitez les mouches à l’aide d’une lame tranchante sur une plaque anesthésique de CO2 .
  2. Prélever des mouches foncées ou adaptées à la lumière d’un âge défini (12 à 24 h) dans des tubes de 1,5 mL et les congeler dans de l’azote liquide. Déshydratez les mouches à l’acétone à -80 °C pendant 48 h dans un flacon en verre35. Pour le tissu rétinien, prélevez 100 rétines de mouches lyophilisées. À l’aide d’un scalpel, retirez les yeux du reste de la tête et retirez la rétine.
  3. Pour l’analyse des phosphoinositides PI4P et PI(4,5)P2 , lorsque vous travaillez avec des rétiniens frais, utilisez 25 rétiniens par échantillon provenant de mouches élevées dans des conditions d’éclairage appropriées pour mesurer les niveaux de lipides pendant l’éclairage et de mouches élevées sans lumière pour mesurer les niveaux de lipides dans l’obscurité. Stocker dans 50 μL de 1x PBS dans des tubes d’homogénéisation sur de la glace carbonique jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’extraction.

3. Extraction des lipides

ATTENTION : Le chloroforme est un solvant toxique et est de nature cancérigène. Il affecte le système reproducteur et est un irritant pour la peau et les yeux. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de ce produit chimique. Toutes les étapes impliquant du chloroforme doivent être effectuées dans une hotte chimique bien ventilée.

  1. Pour tous les glycérophospholipides autres que PI4P et PI(4,5)P2
    1. Pour chaque échantillon, homogénéiser 10 têtes de mouches ou 100 rétiniens (prélevés comme décrit à l’étape 2.2) dans 0,1 mL de HCl méthanolique glacé à 0,1 N et 30 μL de mélange étalon interne (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), acide lysophosphatidique (LPA ; 13:0), lysophosphatidylcholine (LPC ; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) et PC (12:0/13:0)). Préparez des étalons de telle sorte que la quantité finale de tout étalon lipidique se situe dans la courbe de réponse linéaire du spectromètre de masse.
    2. Homogénéiser les tissus à l’aide d’un homogénéisateur automatisé qui permet un traitement rapide et simultané de tous les échantillons. Faites tourner brièvement les tubes dans une centrifugeuse de table et assurez-vous qu’aucune pastille ne se forme, ce qui indique une homogénéisation complète. Transférez l’homogénat méthanolique dans un tube de microcentrifugation bouché de 2 ml.
    3. Ajouter 0,2 mL de HCl méthanolique 0,1 N glacé pour récupérer toute matière résiduelle dans le tube et combiner dans le tube de 2 mL. Ajouter 0,1 mL de HCl méthanolique glacé 0,1 N suivi de 0,8 mL de chloroforme et bien mélanger. Laisser reposer le mélange, contenant l’homogénat tissulaire, sur de la glace pendant 10 min, puis ajouter 0,4 mL de KCl à 0,88 % et agiter pendant 30 s.
    4. Centrifuger le mélange à 1 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer les phases aqueuse et organique. Retirez très soigneusement la phase organique inférieure contenant les lipides sans la mélanger avec la phase aqueuse et transférez-la dans un tube de microcentrifugation frais de 2 ml.
      REMARQUE : Lors de l’extraction des lipides, transférez la phase organique inférieure avec le plus grand soin pour éviter de le mélanger avec la phase aqueuse, ce qui pourrait entraver l’analyse des lipides en aval.
    5. Séchez cette solution lipidique dans un évaporateur sous vide à 4 °C, inspectez visuellement l’échantillon pour assurer un séchage complet. Mettre en suspension dans 420 μL d’un mélange méthanol :chloroforme 2:1 pour analyse. Analysez les échantillons immédiatement sans stockage.
  2. Pour les phosphoinositides PI4P et PI(4,5)P2
    1. Homogénéiser 25 rétiniens dans 950 μL de tampon d’élution phosphoinositide (PEB ; 250 mL de CHCl3, 500 mL de méthanol et 200 mL de HCl 2,4 M) et ajouter des étalons internes (phosphatidyléthanolamine (PE) 17:0/14:1 ; PI (17:0/14:1) ; PI4P (17:0/20:4) ; et un mélange de PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) contenant 50 ng de PI, 25 ng de PI4P, 50 ng de PI(4,5)P2 et 0,2 ng de PE par échantillon.
    2. Ajouter 250 μL de chloroforme et 2,4 M de HCl, suivis d’une sonication pendant 2 min et d’une centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour la séparation des phases. Retirer la phase organique inférieure dans un tube frais, laver avec 900 μL de LPWS et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Extrayez les lipides de la phase aqueuse restante en effectuant à nouveau une séparation de phase comme à l’étape 3.2.2. Séchez les phases organiques collectées dans une centrifugeuse sous vide réglée à 4 °C, inspectez visuellement les échantillons pour assurer un séchage complet.

4. Dosage du phosphate organique

  1. Préparer une solution mère de 7,34 mM KH2PO4. Effectuer les dilutions standard, à l’aide d’eau distillée, dans des tubes de microcentrifugation conformément au tableau 1. Agitez légèrement les tubes et transférez les dilutions standard dans des tubes en verre sans phosphate.
  2. Préparez un ensemble séparé de tubes en verre contenant les échantillons de lipides. Optimiser le volume des échantillons de lipides de sorte que l’absorbance à 630 nm (après l’achèvement de ce protocole) se situe dans la plage de la norme KH2PO4 (qui est de 0 à 20x).
  3. Chauffer les tubes en verre contenant des dilutions standard à 120 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Chauffer les tubes de verre contenant les échantillons de lipides (prendre 1/8e du volume total de l’échantillon requis pour avoir une absorbance dans la plage des KHstandard 2PO4) à 90 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.
  4. Ajouter 50 μL d’acide perchlorique à 70 % dans tous les tubes et chauffer à 180 °C pendant 30 min. Refroidissez les tubes à température ambiante. Ajouter 250 μL d’eau, 50 μL de molybdate d’ammonium à 2,5 % et 50 μL d’acide ascorbique à 10 % dans chaque tube.
    REMARQUE : 2,5 % de molybdate d’ammonium et 10 % d’acide ascorbique sont des concentrations poids/vol. Ils doivent être fraîchement préparés et peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
  5. Conservez les tubes dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 1 h. Aliquote 130 μL de l’échantillon dans une plaque de 96 puits et mesurer l’absorbance à 630 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

5. Dérivation

ATTENTION : Le triméthylsilyldiazométhane (TMSD) aurait de nombreux effets toxicologiques chez l’homme. Le TMSD en solution cible les reins, le foie, le tractus gastro-intestinal, les muscles squelettiques, le système nerveux central et les systèmes respiratoire et reproducteur. Des précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation de ce produit chimique. L’ensemble du processus doit être effectué dans une hotte chimique bien ventilée.

  1. À la phase organique inférieure des échantillons obtenus à la fin de l’étape 3.2.3., ajouter 50 μL de 2 M TMSD. Laissez la réaction se dérouler à température ambiante pendant 10 minutes en secouant constamment à 250 tr/min. Après 10 min, ajoutez 10 μL d’acide acétique glacial pour éteindre la réaction, indiquée par la disparition de la couleur jaune dans la solution.
  2. Tapotez les tubes et ouvrez-les avec précaution pour retirer le N2 formé lors de la réaction d’extinction. Une fois que le gaz N2 s’est échappé, fermez les tubes et faites-les tourner. Ensuite, ajoutez 600 μL de solution de lavage post-dérivatisation et agitez pendant 2 min dans un mélangeur à 250 tr/min.
  3. Jetez ~400 μL de la phase supérieure qui se formera. Répétez l’étape 5.2. Jetez toute la phase supérieure et ajoutez 50 μL de méthanol à 90 % à la phase inférieure et mélangez-la.
  4. Sécher les échantillons pendant 2 h dans un concentrateur centrifuge à 800 x g fonctionnant sous vide. Après séchage, les tubes doivent contenir ~20 μL de l’échantillon restant. Ajoutez 180 μL de méthanol à 100 %, mélangez bien et conservez à 4 °C jusqu’à 2-3 jours avant l’utilisation de la LC-MS/MS.

6. Acquisition et analyse des données

  1. Acquisition de données en MS à perfusion directe (DIMS)
    REMARQUE : La spectrométrie de masse peut être effectuée par perfusion directe ou par chromatographie liquide (LC-MS). Dans cette section, nous décrivons la SEP par perfusion directe.
    1. Avant de commencer l’expérience, calibrez le spectromètre de masse selon les instructions du fabricant.
    2. Générer une courbe de réponse linéaire pour la série de dilution des étalons synthétiques et, sur la base de la réponse linéaire de l’instrument, diluer l’échantillon de sorte que l’intensité de l’analyte lipidique tombe dans la linéarité de l’instrument. Diluer les extraits lipidiques totaux ou les étalons lipidiques avec un mélange de méthanol 2:1 : chloroforme (vol/vol). Sélectionner la dilution des extraits lipidiques totaux et des étalons synthétiques individuellement pour chaque expérience.
    3. Transférez les extraits et les étalons dans des flacons individuels. Évitez les bulles d’air lors du transfert des échantillons dans des flacons d’échantillons de MS. Les bulles d’air créeront une pression élevée dans la colonne et entraveront l’analyse des lipides.
    4. Avant l’analyse, centrifugez les échantillons pendant 9 minutes à 6 440 x g et chargez-les dans une plaque de 96 puits et scellez-la avec une feuille d’aluminium.
    5. Effectuer des analyses MS sur un spectromètre de masse à haute résolution en utilisant la méthode de perfusion directe. Obtenir une ionisation stable des glycérophospholipides basée sur l’ESI à l’aide d’une source d’ions nano-flux robotisée à l’aide de puces avec des buses de pulvérisation de diamètre 4,1 μm.
    6. Contrôlez la source d’ions à l’aide d’un logiciel de spectromètre de masse personnalisé et réglez les tensions d’ionisation à +1,2 kV et -1 kV en modes positif et négatif, respectivement ; contre-pression à 1 psi dans les deux modes ; et la température du capillaire de transfert d’ions à 180 °C. Effectuez l’acquisition à une résolution de masse, Rm/z400 = 100 000. Voir la figure 2A pour l’interface logicielle permettant de configurer les paramètres du spectromètre de masse.
    7. Dissoudre à nouveau les extraits lipidiques totaux séchés dans 400 μL de chloroforme :méthanol (1:2). Pour l’analyse, chargez 60 μL d’échantillons sur une plaque source d’ions à 96 puits et scellez-la avec une feuille d’aluminium. Analysez chaque échantillon pendant 20 minutes en mode ionique positif pour détecter la PC, la phosphatidylsérine (PS), la phosphatidyléthanolamine (PE), la PE-O (phosphatidyléthanolamine liée à l’éther), la céramide (Cer) et le phosphate de céramide (Cer-P).
    8. Effectuez une acquisition indépendante en mode ions négatifs pendant 20 min où PA et PI ont été détectés. Voir la figure 2B pour des détails spécifiques sur la configuration de l’instrument pour l’acquisition de données pour la MS haute résolution et une liste ciblée d’espèces PA qui ont été incluses dans la mise en place de l’acquisition dépendante des données (DDA).
      REMARQUE : L’interface logicielle pour la configuration de la méthode DDA est illustrée à la Figure 2C. La liste des molécules PA ciblées dans cette approche est présentée dans le tableau 2. Une capture d’écran du résultat expérimental de l’approche DDA est présentée à la figure 2D.
  2. Analyse de données en MS à perfusion directe (DIMS)
    REMARQUE : L’analyse des données de masse générées par tous les types de spectromètres de masse nécessite une plateforme automatisée d’analyse des lipides. LipidXplorer36 est un logiciel non commercial qui prend en charge tous les types d’expériences lipidiques DIMS. Ce logiciel peut être trouvé ici : https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Une fois les données acquises à l’aide des méthodes décrites à l’étape 6.1, identifier les espèces lipidiques à l’aide d’une plateforme d’analyse des lipides en faisant correspondre m/z de leurs pics monoisotopiques aux contraintes de composition élémentaire correspondantes. L’exemple d’importation de données est illustré à la figure 3A. Réglez la tolérance de masse à 10 ppm et le seuil d’intensité en fonction du niveau de bruit signalé par le logiciel du spectromètre de masse.
    2. Après l’importation, compilez des requêtes MFQL (molecular fragmentation query language) pour PA en fonction de la structure chimique de PA, comme illustré à la figure 3B. Voir la figure 3C pour la MFQL mise en place dans la plateforme d’analyse des lipides.
    3. En utilisant une approche similaire, compilez la MFQL pour d’autres glycérophospholipides dans le logiciel de la plateforme d’analyse des lipides. Chaque requête cible une classe lipidique et de nombreuses requêtes peuvent être utilisées en une seule exécution.
    4. Exécutez toutes les MFQL en cliquant sur le bouton Exécuter . Toutes les espèces lipidiques identifiées sont rapportées dans un seul fichier de résultats au format .csv fichier avec les abondances d’ions précurseurs et/ou de fragments correspondants pour la quantification ultérieure des lipides. Le tableau 3 donne un exemple de la production.

7. Chromatographie liquide et spectrométrie microscopique en tandem d’échantillons dérivés

  1. Séparer les échantillons obtenus à partir de l’étape 5.4 par chromatographie liquide à l’aide d’un système de chromatographie liquide ultra-performant. Lors du choix de ce système, assurez-vous que son logiciel peut s’intégrer à celui du spectromètre de masse utilisé pour l’analyse.
  2. Connectez le système à un spectromètre de masse triple quadripolaire. Choisissez une colonne de séparation. Pour la séparation des lipides autres que PI4P et PI(4,5)P2 , choisir une colonne C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Pour PI4P et PI(4,5)P2, choisissez une colonne C4 de dimensions 300 Å (1,0 mm x100 mm x 1,7 μm).
  3. Préparez la phase mobile qui contient du formiate d’ammonium en dissolvant le formiate d’ammonium dans de l’eau de masse d’abord, puis dans des solvants organiques. Sonicate tous les solvants utilisés en spectrométrie de masse pendant 20 min pour éliminer les bulles d’air.
  4. Équilibrer la colonne en infusant la solution A contenant de l’eau + 0,1 % d’acide formique et la solution B de l’acétonitrile + 0,1 % d’acide formique.
  5. Injecter l’éluat du système de chromatographie liquide (volume d’injection compris entre 1 et 20 μL) dans le spectromètre de masse pour analyse. Réglez le débit à 0,1 mL/min et la température de la colonne à température ambiante. Injecter tout le volume d’élué sortant de la colonne dans le spectromètre de masse.
  6. Dans la séquence d’injection d’échantillons, commencez toujours par une injection de solvant à blanc (méthanol) et conservez des échantillons étalons nets par intermittence entre les échantillons biologiques pour les contrôles de contrôle de la qualité effectués par spectrométrie de masse (tous les six essais).
  7. Pour l’installation expérimentale du spectromètre de masse hybride à piège ionique triple quadripôle, avant de commencer l’expérience, étalonnez le spectromètre de masse conformément aux instructions du fabricant. Pour PA, PC et PI, utilisez l’ionisation par électronébulisation (ESI) pour générer les ions et fonctionner en mode positif pour détecter les espèces lipidiques chargées positivement. Acquérez les données et analysez-les à l’aide du logiciel d’analyse de données installé avec le système.
  8. Optimiser les paramètres d’analyse en fonction de l’étalon interne correspondant utilisé. Les paramètres du spectromètre de masse sont les suivants : temps de séjour = 30 ms ; CAD (dissociation activée par collision) = 3 psi ; GS1 (gaz source 1) = 24 psi et GS2 (gaz source 2) = 21 psi ; CUR (gaz de rideau) = 30 psi ; IS (tension ESI) = 4,5 kV ; et TEM (température source) = 450 °C.
  9. Pour PI4P et PI(4,5)P2, utilisez le spectromètre de masse en mode positif. Les paramètres du spectromètre de masse sont les suivants : temps de séjour = 65 ms ; CAD (dissociation activée par collision) = 2 psi ; GS1 (gaz source 1) et GS2 (gaz source 2) = 20 psi ; CUR (gaz de rideau) = 37 psi ; IS (tension ESI) = 5,2 kV ; et TEM (température source) = 350 °C.

8. Chromatographie liquide en phase normale-surveillance de réactions multiples-balayage ionique de produit amélioré MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Conditions chromatographiques
    1. Utilisez une méthode LC en phase normale utilisant une colonne de silice, qui est capable de séparer le PA des autres phospholipides. Utiliser hexane :alcool isopropylique :100 mM aqueux NH4COOH dans le rapport 68:30:2 comme phase mobile A et alcool isopropylique :hexane :100 mM aqueux NH4COOH dans un rapport de 70:20:10 comme phase mobile B.
      REMARQUE : Cette combinaison a fourni la meilleure séparation et la meilleure sélectivité de pic des différentes espèces moléculaires de PA.
    2. Utiliser le comportement chromatographique des composés de référence (étalons internes), en termes de résolution et de forme de pic, pour choisir les conditions optimales.
    3. Effectuer une séparation chromatographique sur une colonne de silice en phase normale (1 mm x 150 mm x 3 μm) à température ambiante sur une colonne de chromatographie liquide ultra-performante. Réglez le volume d’injection de l’échantillonneur automatique à 6 μL et le débit d’éluant à 210 μL/min.
    4. Après 5 min d’équilibre avec 100 % de la phase mobile A, augmentez linéairement la phase mobile B à 30 % sur 5 min, puis à 80 % sur 5 min, puis à 100 % sur 5 min, et maintenez-la constante à 100 % pendant 5 min. Enfin, rééquilibrez la colonne pendant 9 min.
  2. Spectrométrie de masse
    1. Utilisez un spectromètre de masse hybride à piège ionique triple quadripôle fonctionnant en mode ESI négatif. Contrôlez le fonctionnement du système et l’acquisition des données à l’aide du logiciel d’analyse fourni. Avant de commencer l’expérience, calibrez le spectromètre de masse selon les instructions du fabricant.
    2. Optimisez les paramètres de la source à l’aide de l’analyse par injection en flux du mélange étalon interne. En conséquence, réglez la tension de pulvérisation ionique = -4,5 kV, la température de la source (TEM) = 450 °C, le gaz de dissociation activé par collision (CAD) = 3 psi. Utilisez de l’azote gazeux comme gaz de collision et réglez le gaz de nébulisation (GS1) = 24 psi, le gaz auxiliaire (GS2) = 21 psi et le gaz de rideau (CUR) = 30 psi.
    3. Définissez les paramètres du trajet ionique dépendant du composé comme le potentiel de désagrégation (DP) = -42 V, le potentiel d’entrée (EP) = -6 V et le potentiel de sortie de cellule de collision (CXP) = -12 V, optimisés à l’aide de l’infusion continue d’une solution de mélange étalon interne. Enregistrez les spectres complets du produit ainsi que les transitions MRM du précurseur au produit avec une énergie de collision (CE) variable allant de 12 eV à 40 eV pour l’analyse de fragmentation à l’aide de la fonction de balayage EPI disponible dans le spectromètre de masse.
      REMARQUE : L’EPI IDA déclenché par MRM enregistre simultanément le produit ionique précurseur, le balayage ionique et l’acquisition MS/MS à la volée. Le MRM a rétréci la plage de balayage ionique dans le quadripôle 1 (Q1) et le piège à ions a amélioré les fragments d’ions passant par Q2, améliorant ainsi considérablement la capacité qualitative de la MS/MS quadripolaire, en particulier pour la capture de tous les fragments provenant de l’ion précurseur. En mode EPI, plusieurs ions fragmentaires issus des ions précurseurs sont détectés en Q3 avec un meilleur rapport signal/bruit.
    4. Effectuez des expériences MRM avec un EC de 39 eV pour obtenir une sensibilité élevée. Limitez le nombre maximum de MRM à 75 et le temps de séjour à 30 ms pour détecter et enregistrer le MRM de toute molécule spécifique qui s’échappe de la colonne chromatographique à tout moment au cours de l’exploitation. Cela augmente le cycle de service de la machine.
    5. Effectuez un réglage expérimental pour décider des meilleurs paramètres d’ionisation pour le PA, comme décrit ci-dessus. Pour cette expérience, réglez la tension de pulvérisation ionique = -4,5 kV, la température de la source (TEM) = 450 °C, le gaz de dissociation activé par collision (CAD) = 3 psi. Utilisez de l’azote gazeux comme gaz de collision. Réglez le gaz du nébuliseur (GS1) = 24 psi, le gaz auxiliaire (GS2) = 21 psi et le gaz du rideau (CUR) = 30 psi.
    6. Examinez manuellement toutes les données de réglage pour vous assurer de la sélection correcte des paramètres d’ionisation et des ions produits. Tenez compte de la minimisation des interférences potentielles entre les canaux MRM lors de la sélection de l’ion produit. Les paramètres expérimentaux utilisés pour l’analyse de toutes les espèces moléculaires de PA sont présentés dans le tableau 4.
      REMARQUE : Le spectromètre de masse hybride à piège ionique linéaire triple quadripôle nous permet de combiner le mode de balayage MRM avec la fonction de balayage de piège à ions, permettant ainsi un balayage rapide et élevé en utilisant des méthodes telles que le balayage EPI pour enregistrer des spectres de masse en tandem utiles de chaque précurseur détecté. Dans cette étude, pour identifier des espèces moléculaires distinctes de PA, nous avons exploité cette approche MS/MS basée sur le chemin ionique triple quadripôle conventionnel avec la propriété de balayage EPI du piège à ions, contrôlée par le logiciel d’analyse.

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Résultats

Détermination de la linéarité de la mesure en MS. La linéarité est la capacité de la méthode MS à fournir des résultats directement proportionnels à la concentration de l’analyte lipidique. La linéarité dépend (a) de l’efficacité d’ionisation de l’analyte lipidique et (b) du comportement d’ionisation de l’analyte lipidique à différentes concentrations dépend de la source d’ions utilisée. Dans l’ionisation par électronébulisation (ESI) utilisée dans cette étude, la linéarité se maintient à des concentrati...

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Discussion

Un certain nombre de sources de preuves convergent sur les rôles multiples des lipides de signalisation dans la régulation de l’organisation et de la fonction des photorécepteurs de la drosophile. En plus du rôle bien étudié des lipides dans la régulation de la phototransduction3, les lipides de signalisation ont également été impliqués dans le trafic des protéines et l’organisation subcellulaire 23,30,39,40,41.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par le Département de l’énergie atomique du gouvernement de l’Inde (projet n° d’identification n°. RTI 4006), le Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde (BT/PR4833/MED/30/744/2012) et une bourse de recherche de l’Alliance de l’Inde (IA/S/14/2/501540) à PR. Nous remercions l’installation de spectrométrie de masse du NCBS, en particulier le Dr Dhananjay Shinde et les membres du laboratoire de relations publiques pour leurs contributions au développement de ces méthodes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 N HCLPour l’isolement total des lipides
0,88 % KClSigma AldrichP9541Pour l’isolement total des lipides
1,5 ml / 2 ml Tubes LoBind EppendorfEppendorf,022431081/022431102Pour l’isolement total des lipides
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti lipides polaires999974Lipide Étalon interne
37 % HCl purSigma Aldrich320331Pour l’isolement des lipides totaux
PlaqueDosage du phosphate organique total
AcétoneFisher Scientific32005Pour les dissections
MolybdateDosage du phosphate organique total
Acide ascorbique Dosagephosphate organique total
Sonicateurà bain
Colonne BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352
LC Porte-lameOutils scientifiques fins10052-11Pour dissections
IncubateurDosage du phosphate organique total
Lames cassablesOutils scientifiques fins10050-00Pour dissections
Papier beurreGE healthcare10347671Pour dissections
C4, 300 A0, [1.7 &mu ; m x1 mm x 100 mm] colonneWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatographie Flacons en verre ambré avec insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti lipides polaires860517Lipide Étalon interne lipidique
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Lipides polaires Avanti850172Lipides Microscopes
de dissection interne étalon interneOlympusSZ51Pour les dissections
Bain de chaleur sèche.
Eluent AHexane :Alcool isopropylique :100 mM acétate d’ammonium aqueux (68:30:2) , pour LC
Eluent BHexane :Alcool isopropylique :100 mM acétate d’ammonium aqueux (70:20:10), pour LC
Papier filtreIndica-HM274039Pour
dissections FiolesBorosilPour dissections
FliesNANARaghu Padinjat
lab Nourriture pour mouchesNANANCB lab kitchen, composition : farine de maïs 80 g/L, D-glucose 20 g/L, saccharose 40 g/L, gélose 8 g/L, extrait de levure 15 g/L, acide propionique 4 mL, TEGO (para hydroxybenzoate de méthyle) 0,7 g/L, acide orthophosphorique 0,6 mL)
ForcepsOutils scientifiques fins11254-20Pour dissections
Hotte
EntonnoirBorosilPour les dissections
Acide acétique glacialFisher ScientificA35-500Pour la dérivatisation
Bouteilles en verre : transparent et de couleurPour une isolation totale des lipides
Tubes en verre sans phosphate résistants aux hautes températures.Dosage du phosphate organique total
Tubes d’homogénéisation avec billesPour l’isolation totale des lipides
Instrument d’homogénéisationPrecellys
CO2 humidifié connecté à des coussinetsPour le poussage
des mouches Incubateurs contrôlés par éclairagePanasonic SanyoMIR-553Pour les mouches
élevage Mélangeméthanol :chloroforme (2:1), Pour l’isolement des lipides totaux
Grade LC-MS ChloroformeSigma Aldrich650498Pour l’isolement des lipides totaux
Grade LC-MS MéthanolSigma Aldrich34860Pour l’isolement des lipides totaux
Eau de qualité LC-MSSigma Aldrich34877Pour l’isolement des lipides totaux
Léger compteurHTC instrumentsLX-103
Embouts à faible rétentionEppendorf0030072006/72014/72022/72030Pour l’isolement total des lipides
Instrument LTQ Orbitrap XLThermo Fisher Scientific, Brême, Allemagne
Acide lysophosphatidique (LPA)- 13:0Lipides polairesAvanti LM-1700Étalon lipidique interne
Acide lysophosphatidique (LPA)- 17:1Lipides polaires AvantiLM 1701Lipide étalon interne
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Lipides polaires AvantiLM-1600Lipide interne
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Lipides polaires Avanti855677Étalon interne lipidique
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Lipides polaires Avanti855776Étalon
Acide perchlorique.Dosage du phosphate organique total
DihydrogénophosphateDosage du phosphate organique total
Saline tamponnée au phosphate (PBS)NANA Composition: 137 mMNaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 et 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Acide phosphatidique (PA)- 12:0/13:0Lipides polaires Avanti,LM-1400  ; Lipide Étalon interne
Acide phosphatidique (PA)- 17:0/14:1Lipides polaires AvantiLM-1404Lipide Étalon interne
Acide phosphatidique (PA)-(17:0/17:0)Lipides polaires Avanti830856Lipide Étalon interne
Acide phosphatidique (PA)-16:0-D31/18:1Lipides polaires Avanti860453Lipide Étalon interne
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Lipides polaires AvantiLM-1000Lipide étalon interne
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Lipides polaires AvantiLM-1004Lipide étalon interne
Phosphatidyléthanolamine (PE) - 17:0/14:1Lipides polairesAvanti LM-110Étalon interne lipidique
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Lipides polaires AvantiLM-1504Étalon interne lipidique
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Lipides polairesAvanti LM-1904Lipide interne
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Lipides polairesAvanti LM-1901Lipide interne
d’ions nanoflux robotiqueTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
TamponsPour dissections
solvant A0,1 % acide formique dans l’eau, pour solvant LC
B0,1 % acide formique dans l’acétonitrile, pour
LC Centrifugeuse
Thermo-mélangeur
TMS-diazométhaneAcrosAC385330050Pour la dérivation
Spectromètre de masse triple quadripôleAB SciexQTRAP 6500
Système UPLCWaters Acquity
Concentrateur centrifuge sous videScanvac , Labogene
Vortex machine
méthanolique à 96 puits d’ammonium du DBO  : ambrée d’oxyde de zirconium anti-mouches organique initial interne lipidique de potassium étalon Source en silicone de table

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