Le protocole d’indentation par microscopie à force atomique offre la possibilité de disséquer le rôle des propriétés physiques de la paroi cellulaire d’une cellule particulière d’un tissu ou d’un organe pendant une croissance normale ou contrainte (c’est-à-dire sous déficit hydrique).
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Microscopie à force atomique pour étudier les propriétés physiques des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une méthode est décrite ici pour caractériser les propriétés physiques de la paroi cellulaire des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis par nanoindentations avec un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope optique à fluorescence inversée. La méthode consiste à appliquer des forces contrôlées à l’échantillon tout en mesurant sa déformation, ce qui permet de quantifier des paramètres tels que le module apparent de Young des parois cellulaires à des résolutions subcellulaires. Cela nécessite une immobilisation mécanique minutieuse de l’échantillon et une sélection correcte des pénétrateurs et des profondeurs d’indentation. Bien qu’elle ne puisse être utilisée que dans les tissus externes, cette méthode permet de caractériser les changements mécaniques dans les parois cellulaires végétales au cours du développement et permet la corrélation de ces changements microscopiques avec la croissance d’un organe entier.
Introduction
Les cellules végétales sont entourées d’une paroi cellulaire qui est une structure complexe composée de réseaux en interaction de polysaccharides, de protéines, de métabolites et d’eau dont l’épaisseur varie de 0,1 à plusieurs μm selon le type cellulaire et la phase de croissance 1,2. Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire jouent un rôle essentiel dans la croissance des plantes. De faibles valeurs de rigidité de la paroi cellulaire ont été proposées comme condition préalable à la croissance cellulaire et à l’expansion de la paroi cellulaire, et il est de plus en plus évident que toutes les cellules d....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Préparation du matériel végétal et conditions de croissance
- Pour générer le matériel végétal nécessaire, stérilisez les graines de type sauvage d’Arabidopsis et les lignées mutantes d’intérêt.
REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé ce qui suit: ttl1: Lignes d’insertion de l’ADN-T Salk_063943 (pour TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) de type sauvage; le mutant Procuste1 (prc1-1), qui consiste en une mutation knock-out (Q720stop) dans le gène CESA6 (AT5G64740), comme décrit précédemment dans10,11; et TTL1 x PRC1-1 D....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Expériences d’indentation de force
Le texte suivant présente certains résultats attendus lorsqu’une expérience d’indentation de force est menée pour montrer la sortie typique à attendre lorsque le protocole est bien exécuté.
Courbes force-déplacement
Les diagrammes d’indentation de force représentative qui ont été obtenus en indentant des échantillons vivants à une position placée au centre de la cellule de la zone d’élongation racinaire sont présentés à.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La mécanique des cellules et des parois cellulaires devient de plus en plus pertinente pour mieux comprendre comment la mécanique affecte les processus de croissance. Comme les forces physiques se propagent sur des distances considérables dans les tissus solides, l’étude des changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire et comment ils sont détectés, contrôlés, réglés et impactent la croissance de la plante devient un domaine d’étude important 2,3,8
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts. Le script MATLAB utilisé pour ajuster les données est disponible sur demande personnelle en écrivant à J. C. B.
Remerciements
Cette recherche a été financée par CSIC I+D 2018, subvention n ° 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) et PEDECIBA.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Comprend du chlorure de sodium et un tampon de phosphate et est formulée pour prévenir le choc osmotique et maintenir l’équilibre de l’eau dans les cellules vivantes. | ||
| Bruker, Billerica, MA, États-Unis | |||
| Microscopie à force atomique (AFM) | Catalyseur BioScope, Bruker, Billerica, MA, États-Unis | ||
| Catalyseur Porte-sonde-fluide | Bruker, Billerica, MA, États-Unis | CAT-FCH | Support de sonde pour le catalyseur Bioscope, conçu pour un fonctionnement fluide en mode contact ou tapotement. ; Également compatible avec le fonctionnement à l’air. |
| Osmomètre cryoscopique ; modèle OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Allemagne | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Concentration originale, (1962) |
| Microscope optique inversé couplé à l’AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| pegamil | anaerobicos s.r.l., Buenos Aires, Argentine | 100429 | Colle silicone neutre, non acide |
| Boîtes de Pétri | Deltalab | 200201.B | Polystyrène, 55 x 14 mm, stérile par rayonnement. |
| Iodure de propidium | Sigma | P4170 | Pour le test de viabilité des racines. |
| Sonde en nitrure de silicium, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | Pour la microscopie à modulation de force en fonctionnement liquide. Rayon de pointe de la sonde de 20 à 60 nm. 175-&mu ; porte-à-faux triangulaire de longueur M, ; avec une constante de ressort de 0,35 N/m. |
| Pince à épiler | Sigma | T4537 |
Références
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell.....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
