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Déclaration d’éthique : Toutes les études ont été approuvées par l’Institutional Biosafety Office of Research Protections de l’Université de Pittsburgh.
1. Préparez des perles magnétiques
REMARQUE: Effectuer avant le tri cellulaire et maintenir sur la glace jusqu’à l’utilisation.
- Pipette 30 μL de microsphères paramagnétiques conjuguées ConA mélange de boue de billes par réaction à un tube de microfuge frais de 1,5 mL et ajouter 850 μL de tampon de liaison, pipetage doucement pour mélanger.
REMARQUE: Les microsphères paramagnétiques conjuguées ConA sont des billes magnétiques recouvertes de lectine qui permettent la liaison de la membrane lipidique.
- Placez le tube sur une grille magnétique et laissez les perles magnétiser pendant 1-2 min. Une fois que le surnageant s’est dissipé, retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
- Retirez le tube de la grille magnétique et lavez les billes en les remettant en suspension dans 1 mL de tampon de liaison.
- Répétez les étapes 1.2 et 1.3.
- Magnétiser les perles pendant 2 min et retirer le surnageant pour le jeter.
- Retirez le tube du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 30 μL de tampon de liaison par réaction.
- Maintenez le mélange de billes lavées sur de la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées.
2. Récolter des cellules
REMARQUE: Cette étape est écrite pour les cellules adhérentes et optimisée pour les cellules souches embryonnaires murines E14. La culture et la récolte des cellules dépendent du type de cellule.
- Retirez les cellules de l’incubateur à 37 °C et examinez-les au microscope pour en assurer la qualité.
- Aspirer le milieu de la plaque cellulaire et rincer avec 5 mL de 1x PBS.
- Aspirez le PBS de la plaque et récoltez les cellules (en utilisant des méthodes traditionnelles de récolte cellulaire qui diffèrent selon le type de cellule). Obtenir une suspension unicellulaire en piquant doucement de haut en bas avec une pipette sérologique contre la boîte de culture, si nécessaire.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et tourner vers le bas à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirer le support pour jeter et laver la pastille de cellule avec 5 mL de PBS + 1% FBS.
- Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de PBS + 1% FBS.
- Compter les cellules et transférer 1 mL de 1 x 106 cellules dans un tube de microfuge frais de 1,5 mL.
- Ajouter 5 μL de 7-amino-actinomycine D (7-AAD), bien inverser le tube pour mélanger, puis appliquer l’échantillon au trieur de cellules pour trier les cellules individuelles dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.
REMARQUE: Le colorant 7-AAD est exclu des cellules vivantes et peut donc être utilisé dans le tri des cellules vivantes.
3. Tri et lyse des cellules
- Préparez une plaque de 96 puits compatible avec le trieur de cellules avec 100 μL de tampon d’extraction nucléaire (NE) dans chaque puits avant le tri des cellules.
- Triez les cellules en plaques de 96 puits en suivant les instructions du fabricant.
- Faites tourner rapidement la plaque (600 x g pendant 30 s) pour vous assurer que les cellules sont dans le tampon à l’intérieur des puits.
REMARQUE: Il vaut la peine de tester dans une expérience préliminaire si les cellules utilisées sont amenées de manière fiable au fond des puits.
- Maintenez les échantillons sur la glace pendant 15 min.
- Faire tourner les échantillons à 600 x g pendant 5 min à 4 °C et pipeter soigneusement pour retirer le surnageant (en laissant derrière lui 5 μL).
- Remettre en suspension chaque échantillon dans 55 μL de tampon NE et ajouter 30 μL des microsphères paramagnétiques conjuguées ConA prélavées (à partir de l’étape 1.7; dans Le tampon de liaison) à chaque réaction.
- Incuber à température ambiante pendant 10 min.
4. Pré-bloquer les échantillons pour empêcher la digestion précoce par MNase
- Placez la plaque sur une grille magnétique à 96 puits, laissez les perles se lier pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
- Ajouter 100 μL de tampon bloquant aux billes liées au noyau et mélanger avec un pipetage doux.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante.
5. Ajout d’anticorps primaires
- Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
- Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 100 μL de tampon de lavage par réaction avec un pipetage doux.
- Replacez la plaque sur le rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager, puis retirez et jetez le surnageant.
- Remettre en suspension les billes dans 25 μL de tampon de lavage par réaction avec pipetage doux.
- Faire un mélange maître d’anticorps primaires : 25 μL de tampon de lavage + 0,5 μL d’anticorps par réaction.
- Tout en tourbillonnant doucement les billes liées aux noyaux, ajoutez 25 μL du mélange maître d’anticorps primaires à chaque échantillon traité avec un anticorps ciblant la protéine d’intérêt (généralement une dilution finale de 1:100). Ajouter 25 μL de tampon de lavage sans anticorps, si vous effectuez un contrôle.
- Incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
- Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage.
6. Ajout de pA-MNase ou de pA/G-MNase
REMARQUE: La protéine A a une forte affinité pour les molécules d’IgG de certaines espèces telles que les lapins, mais ne convient pas aux IgG d’autres espèces telles que les souris ou les rats. Alternativement, la protéine A / G-MNase peut être utilisée. Cet hybride lie les IgG du lapin, de la souris et du rat, évitant ainsi le besoin d’anticorps secondaires lorsque des anticorps primaires de souris ou de rat sont utilisés.
- Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
- Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension chaque échantillon dans 25 μL de tampon de lavage.
- Faire un mélange maître pA-MNase (25 μL de tampon de lavage + quantité optimisée de pA-MNase par réaction).
- Tout en tourbillonnant doucement, ajoutez 25 μL du mélange maître pA-MNase à chaque échantillon, y compris les échantillons témoins.
REMARQUE: La concentration de pA-MNase varie selon la préparation, si elle est faite maison, et doit être testée avant utilisation à chaque purification indépendante. Pour la pA/G-MNase, il faut utiliser 2,5 μL du stock 20x.
- Incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante.
- Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
- Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage doux.
7. Digestion dirigée de l’ADN
- Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
- Retirez les échantillons de la grille magnétique et remettez en suspension les billes dans 50 μL de tampon de lavage par pipetage doux.
- Équilibrer les échantillons à 0 °C dans un mélange glace/eau pendant 5 min.
- Retirer les échantillons du bain-marie glace/eau à 0 °C et ajouter 1 μL de CaCl2 de 100 mM à l’aide d’une pipette multicanal. Bien mélanger (3-5 fois) avec un pipetage doux à l’aide d’une pipette multicanal de plus grand volume, puis ramener les échantillons à 0 °C.
REMARQUE: Bien mélanger ici est essentiel. CaCl2 est ajouté pour activer la digestion MNase de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt.
- Démarrez une minuterie de 10 minutes dès que la plaque est de retour dans le bain de glace / eau.
- Arrêtez la réaction en pipetant 50 μL de tampon 2XRSTOP+ dans chaque puits, dans le même ordre que le CaCl2 a été ajouté.
REMARQUE: Faites un tampon 2XRSTOP + avant la fin de la digestion de 10 minutes pour éviter une digestion excessive.
8. Fractionnement de l’échantillon
- Incuber les échantillons pendant 20 min à 37 °C.
- Faire tourner la plaque à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes et transférez les surnageants sur une plaque fraîche de 96 puits. Jetez les perles.
9. Extraction de l’ADN
- Ajouter 1 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 0,83 μL de protéinase K à 20 mg/mL à chaque échantillon.
ATTENTION : La poudre de FDS est nocive en cas d’inhalation. Les utilisateurs doivent utiliser dans des espaces bien ventilés en portant des lunettes, des gants et un respirateur de qualité N95, à manipuler avec soin.
- Mélanger les échantillons par pipetage doux.
- Incuber les échantillons pendant 10 min à 70 °C.
- Remettre la plaque à température ambiante et ajouter 46,6 μL de 5 M NaCl et 90 μL de PEG 4000 à 50 %. Mélanger par pipetage doux.
- Ajouter 33 μL de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon et incuber pendant 10 min à température ambiante.
REMARQUE: Assurez-vous d’apporter les billes de polystyrène-magnétite à température ambiante (~ 30 min) et mélangez bien avant de les utiliser.
- Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez le surnageant dégager pendant environ 5 minutes, puis jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
- Rincer 2x avec 150 μL d’éthanol à 80% sans déranger les billes.
ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et provoque une irritation de la peau, des yeux et des poumons. Effectuez cette étape avec des vêtements de laboratoire appropriés et dans une capuche ventilée.
- Faire tourner brièvement la plaque à 1000 x g pendant 30 s. Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et retirez tout etOH résiduel sans perturber les perles.
- Séchez les échantillons à l’air libre pendant environ 2 à 5 minutes.
REMARQUE: Ne séchez pas les perles pendant plus de 5 minutes. Si vous êtes diligent à enlever l’EtOH, 2-3 min de séchage est suffisant.
- Remettre en suspension les billes avec 37,5 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez les perles se lier pendant 5 min.
- Transférer 36,5 μL du surnageant vers une plaque de 96 puits compatible avec le thermocycleur frais. Jetez les perles.
REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant des échantillons à -20 ° C ou peut continuer avec la construction de la bibliothèque (étapes 10-15).
10. Réparation finale, phosphorylation, adénylation
REMARQUE : Les réactifs proviennent de la liste des matériaux, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Le protocole ci-dessous suit une méthode similaire au kit commercial tel que le kit NEBNext Ultra DNA II.
- Diluer 5 U/μL d’ADN polymérase T4 1:20 dans 1x tampon d’ADN ligase T4.
- Préparer un mélange maître de réparation finale/3'A : 2 μL de 10x tampon d’ADN ligase T4, 2,5 μL de 10 mM dNTP, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40 % PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL d’ADN polymérase T4 diluée, 0,5 μL de 5U/μL d’ADN polymérase Taq, avec un volume total de 13,5 μL par réaction.
REMARQUE: Assurez-vous d’apporter 40% PEG 4000 à la température ambiante avant le pipetage.
- Ajouter 13,5 μL de mélange maître de réparation finale/3'A à 36,5 μL d’ADN.
- Mélanger la réaction par vortex rapide, puis un spin rapide (500 x g pendant 10 s).
- Incuber en utilisant les conditions de réaction suivantes dans un thermocycleur pré-refroidi avec un couvercle chauffé pour des températures >20 °C. Utilisez les conditions de réaction : 12 °C pendant 15 min, 37 °C pendant 15 min, 72 °C pendant 20 min, maintenir à 4 °C.
11. Ligature de l’adaptateur
REMARQUE: Gardez les échantillons sur la glace tout en mettant en place la réaction suivante. Laissez le tampon ligase atteindre la température ambiante avant le pipetage. Diluer l’adaptateur (voir tableau des matériaux) dans une solution de 10 mM de Tris-HCl contenant 10 mM de NaCl (pH 7,5). En raison du faible rendement, ne pré-quantifiez pas l’ADN enrichi en CUT&RUN. Générez plutôt des dilutions 25 fois de l’adaptateur, en utilisant une concentration finale de l’adaptateur de travail de 0,6 μM.
- Faire un mélange maître de ligature : 55 μL de tampon ligase (2x), 5 μL d’ADN ligase T4 et 5 μL d’adaptateur dilué, avec un volume total de 65 μL par réaction.
- Ajouter 65 μL du mélange de ligature maître à 50 μL d’ADN à partir de l’étape 10.5.
- Mélanger par vortex rapide, suivi d’une rotation rapide (500 x g pendant 10 s).
- Incuber à 20 °C dans un thermocycleur (sans couvercle chauffant) pendant 15 min.
REMARQUE : Passez immédiatement à l’étape suivante.
12. Digestion de l’UTILISATEUR
- Ajouter 3 μL d’enzyme USER à chaque échantillon, vortex et spin (500 x g pendant 10 s).
- Incuber dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 15 min (couvercle chauffé réglé à 50 °C).
13. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite après réaction de ligature
REMARQUE: Laissez les billes de polystyrène-magnétite s’équilibrer à température ambiante (~ 30 min). Vortex pour homogénéiser la solution de billes avant utilisation. Effectuez les étapes suivantes à température ambiante.
- Ajouter 39 μL (0,33x) de solution de billes de polystyrène-magnétite à chaque puits contenant de l’ADN ligaturé par adaptateur.
- Bien mélanger par pipetage, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min pour permettre à l’ADN de se lier aux perles.
- Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits et incubez pendant 5 minutes jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
- Gardez la plaque sur le support magnétique et retirez et jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
- Rincez les billes avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
- Incuber pendant 30 s sur un rack magnétique de 96 puits pour permettre à la solution de s’éclaircir.
- Retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
- Répétez les étapes 13.5 à 13.7 pour un total de deux lavages.
- Faites tourner brièvement la plaque à 500 x g pendant 10 s, replacez la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et retirez l’EtOH résiduel sans perturber les perles.
- Conservez la plaque sur la grille magnétique et séchez les échantillons à l’air libre pendant 2 min.
REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
- Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 28,5 μL de 10 mM tris-HCl (pH 8).
ATTENTION : L’acide chlorhydrique est très corrosif. Les utilisateurs doivent le manipuler avec soin dans une hotte à fumée chimique en portant des lunettes, des gants et un manteau de laboratoire.
- Ressuspendez soigneusement les perles par pipetage, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
- Transférer 27,5 μL de surnageant sur une nouvelle plaque PCR et jeter les billes.
14. Enrichissement de la bibliothèque
REMARQUE: Les apprêts sont dilués avec la même solution que l’adaptateur. Pour cette construction de bibliothèque, utilisez une concentration finale d’amorce de travail de 0,6 μM.
- Ajouter 5 μL d’amorce indexée diluée (voir tableau des matériaux) à chaque échantillon.
REMARQUE : Chaque échantillon a besoin d’un index différent pour être identifié après le séquençage.
- Préparer un mélange maître PCR : 10 μL de 5x tampon PCR haute fidélité, 1,5 μL de dNTP 10 mM, 5 μL d’apprêt universel dilué, 1 μL de polymérase haute fidélité à démarrage à chaud de 1 U, avec un volume total de mélange maître de 17,5 μL par échantillon.
- Ajouter 17,5 μL de mélange PCR à 32,5 μL d’ADN purifié ligaturé par adaptateur (5 μL d’amorce indexée sont inclus dans ce volume).
- Mélanger la solution par pipetage.
- Incuber dans un thermocycleur en utilisant les conditions de réaction suivantes avec une vitesse de rampe maximale de 3 °C/s : 98 °C pendant 45 s, 98 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 10 s, répéter les deuxième et troisième étapes 21 fois, 72 °C pendant 1 min, maintenir à 4 °C.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pour le stockage à court terme ou à -20 °C pour le stockage à long terme.
15. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite
- Ajouter 60 μL (1,2x) de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon.
- Remettre en suspension les billes par pipetage et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Placez la plaque sur un support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire.
- Jeter le surnageant et rincer les perles avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
- Répétez l’étape de lavage pour un total de deux lavages EtOH à 80%.
- Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 10 s, placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez les perles se lier pendant 5 min.
- Pipette pour enlever l’excès d’EtOH sans déranger les perles et laisser sécher les perles à l’air libre pendant 2 min.
REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
- Remettre en suspension les billes dans 21 μL d’eau sans nucléase et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
- Transférer 20 μL du surnageant sur une nouvelle plaque.
REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant l’échantillon à -20 ° C.
- Quantifier les concentrations de bibliothèque à l’aide d’un fluoromètre (voir Tableau des matériaux), à l’aide d’un réactif SH 1x.
- Si la concentration le permet, exécutez 30 ng d’échantillon sur un gel d’agarose à 1,5% avec une échelle de faible poids moléculaire pour visualiser. Vous pouvez également effectuer une visualisation sur un analyseur de fragments ou un instrument associé.
- Séquencer des bibliothèques sur une plate-forme Illumina pour obtenir environ 50 000 à 100 000 lectures mappées de manière unique.