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Article de méthode

Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

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DOI :

10.3791/63536

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1 février 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

CUT&RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&RUN unicellulaire.

Résumé

Déterminer les emplacements de liaison d’une protéine sur la chromatine est essentiel pour comprendre sa fonction et ses cibles régulatrices potentielles. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est la référence en matière de détermination de la localisation des protéines depuis plus de 30 ans et se définit par l’utilisation d’un anticorps pour extraire la protéine d’intérêt de la chromatine sonique ou digérée par voie enzymatique. Plus récemment, les techniques d’attache d’anticorps sont devenues populaires pour évaluer la localisation des protéines sur la chromatine en raison de leur sensibilité accrue. Le clivage sous cibles et libération sous nucléase (CUT&RUN) est le dérivé à l’échelle du génome de l’immunocléavage de la chromatine (ChIC) et utilise la protéine A recombinante attachée à la nucléase micrococcique (pA-MNase) pour identifier la région constante IgG de l’anticorps ciblant une protéine d’intérêt, permettant ainsi un clivage spécifique au site de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt. CUT&RUN peut être utilisé pour profiler les modifications des histones, les facteurs de transcription et d’autres protéines de liaison à la chromatine telles que les facteurs de remodelage des nucléosomes. Il est important de noter que CUT&RUN peut être utilisé pour évaluer la localisation des protéines associées à l’euchromatique ou à l’hétérochromatique et les modifications des histones. Pour ces raisons, CUT&RUN est une méthode puissante pour déterminer les profils de liaison d’une large gamme de protéines. Récemment, CUT&RUN a été optimisé pour le profilage des facteurs de transcription dans de faibles populations de cellules et de cellules individuelles et le protocole optimisé a été appelé CUT&RUN à entrée ultra-faible (uliCUT&RUN). Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de facteur unicellulaire à l’aide d’uliCUT&RUN dans un format manuel de 96 puits.

Introduction

De nombreuses protéines nucléaires fonctionnent en interagissant avec la chromatine pour promouvoir ou prévenir les activités modélisées par l’ADN. Pour déterminer la fonction de ces protéines interagissant avec la chromatine, il est important d’identifier les emplacements génomiques auxquels ces protéines sont liées. Depuis son développement en 1985, l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été l’étalon-or pour identifier où une protéine se lie à la chromatine 1,2. La technique ChIP traditionnelle a le flux de travail de base suivant: les cellules sont récoltées et réticulées (généralement avec du formaldéhyde), la chromatine est cisaillée (généralement avec des méthodes de sonication sévères, nécessitant une réticulation), la protéine d’intérêt est immunoprécipitée à l’aide d’un anticorps qui cible la protéine (ou protéine marquée) suivie d’un anticorps secondaire (couplé à l’agarose ou aux billes magnétiques), la réticulation est inversée, les protéines et l’ARN sont digérés pour purifier l’ADN, et cet ADN enrichi en ChIP est utilisé comme modèle d’analyse (à l’aide de sondes radiomarquées 1,2, qPCR3, microréseaux 5,6 ou séquençage4). Avec l’avènement des microréseaux et du séquençage profond massivement parallèle, ChIP-chip 5,6 et ChIP-seq4 ont été développés plus récemment et permettent l’identification à l’échelle du génome de la localisation des protéines sur la chromatine. La réticulation ChIP est une technique puissante et fiable depuis son avènement avec des avancées majeures en résolution par ChIP-exo7 et ChIP-nexus8. Parallèlement au développement de ChIP-seq, des protocoles natifs (non réticulants) pour ChIP (N-ChIP) ont été établis, qui utilisent la digestion nucléase (souvent à l’aide de nucléase micrococcique ou MNase) pour fragmenter la chromatine, par opposition à la sonication effectuée dans les techniques ChIP traditionnelles de réticulation9. Cependant, l’un des principaux inconvénients des technologies chIP et N-ChIP de réticulation a été l’exigence d’un nombre élevé de cellules en raison du faible rendement en ADN à la suite de la manipulation expérimentale. Par conséquent, au cours des dernières années, de nombreux efforts ont été déployés pour optimiser les technologies ChIP pour un faible apport cellulaire. Ces efforts ont abouti au développement de nombreuses technologies puissantes basées sur le ChIP dont l’applicabilité et les besoins en intrantsvarient 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Cependant, les technologies à base de ChIP-seq unicellulaire ont fait défaut, en particulier pour les protéines non histones.

En 2004, une technologie de rechange a été mise au point pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine appelée clivage endogène de la chromatine (ChEC) et immunocléavage de la chromatine (ChIC)19. Ces techniques à locus unique utilisent une fusion de la MNase à la protéine d’intérêt (ChEC) ou à la protéine A (ChIC) pour la coupe directe de l’ADN adjacente à la protéine d’intérêt. Au cours des dernières années, ChEC et ChIC ont été optimisés pour le profilage protéique à l’échelle du génome sur la chromatine (ChEC-seq et CUT&RUN, respectivement)20,21. Bien que ChEC-seq soit une technique puissante pour déterminer la localisation des facteurs, elle nécessite le développement de protéines de fusion MNase pour chaque cible, tandis que ChIC et sa variation à l’échelle du génome, CUT&RUN, reposent sur un anticorps dirigé vers la protéine d’intérêt (comme avec ChIP) et la protéine A-MNase recombinante, où la protéine A peut reconnaître la région constante IgG de l’anticorps. Comme alternative, une protéine de fusion A / protéine G-MNase (pA / G-MNase) a été développée qui peut reconnaître une gamme plus large de régions constantes d’anticorps22. CUT&RUN est rapidement devenu une alternative populaire au ChIP-seq pour déterminer la localisation des protéines sur l’ensemble du génome de la chromatine.

Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), une variante de CUT&RUN qui permet l’utilisation d’entrées low et single-cell, a été décrite en 201923. Ici, la méthodologie pour une application manuelle à cellule unique au format 96 puits est décrite. Il est important de noter que depuis le développement d’uliCUT&RUN, deux alternatives pour le profilage des histones, CUT&Tag et iACT-seq ont été développées, fournissant un profilage robuste et hautement parallèle des protéines d’histones24,25. De plus, scCUT&Tag a été optimisé pour le profilage de plusieurs facteurs dans une seule cellule (multiCUT&Tag) et pour une application aux protéines non histones26. Ensemble, CUT&RUN offre une alternative attrayante au ChIP-seq à faible entrée où uliCUT&RUN peut être effectué dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire ayant accès à un trieur de cellules et à un équipement standard.

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Protocole

Déclaration d’éthique : Toutes les études ont été approuvées par l’Institutional Biosafety Office of Research Protections de l’Université de Pittsburgh.

1. Préparez des perles magnétiques

REMARQUE: Effectuer avant le tri cellulaire et maintenir sur la glace jusqu’à l’utilisation.

  1. Pipette 30 μL de microsphères paramagnétiques conjuguées ConA mélange de boue de billes par réaction à un tube de microfuge frais de 1,5 mL et ajouter 850 μL de tampon de liaison, pipetage doucement pour mélanger.
    REMARQUE: Les microsphères paramagnétiques conjuguées ConA sont des billes magnétiques recouvertes de lectine qui permettent la liaison de la membrane lipidique.
  2. Placez le tube sur une grille magnétique et laissez les perles magnétiser pendant 1-2 min. Une fois que le surnageant s’est dissipé, retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
  3. Retirez le tube de la grille magnétique et lavez les billes en les remettant en suspension dans 1 mL de tampon de liaison.
  4. Répétez les étapes 1.2 et 1.3.
  5. Magnétiser les perles pendant 2 min et retirer le surnageant pour le jeter.
  6. Retirez le tube du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 30 μL de tampon de liaison par réaction.
  7. Maintenez le mélange de billes lavées sur de la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées.

2. Récolter des cellules

REMARQUE: Cette étape est écrite pour les cellules adhérentes et optimisée pour les cellules souches embryonnaires murines E14. La culture et la récolte des cellules dépendent du type de cellule.

  1. Retirez les cellules de l’incubateur à 37 °C et examinez-les au microscope pour en assurer la qualité.
  2. Aspirer le milieu de la plaque cellulaire et rincer avec 5 mL de 1x PBS.
  3. Aspirez le PBS de la plaque et récoltez les cellules (en utilisant des méthodes traditionnelles de récolte cellulaire qui diffèrent selon le type de cellule). Obtenir une suspension unicellulaire en piquant doucement de haut en bas avec une pipette sérologique contre la boîte de culture, si nécessaire.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et tourner vers le bas à 200 x g pendant 5 min.
  5. Aspirer le support pour jeter et laver la pastille de cellule avec 5 mL de PBS + 1% FBS.
  6. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de PBS + 1% FBS.
  7. Compter les cellules et transférer 1 mL de 1 x 106 cellules dans un tube de microfuge frais de 1,5 mL.
  8. Ajouter 5 μL de 7-amino-actinomycine D (7-AAD), bien inverser le tube pour mélanger, puis appliquer l’échantillon au trieur de cellules pour trier les cellules individuelles dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.
    REMARQUE: Le colorant 7-AAD est exclu des cellules vivantes et peut donc être utilisé dans le tri des cellules vivantes.

3. Tri et lyse des cellules

  1. Préparez une plaque de 96 puits compatible avec le trieur de cellules avec 100 μL de tampon d’extraction nucléaire (NE) dans chaque puits avant le tri des cellules.
  2. Triez les cellules en plaques de 96 puits en suivant les instructions du fabricant.
  3. Faites tourner rapidement la plaque (600 x g pendant 30 s) pour vous assurer que les cellules sont dans le tampon à l’intérieur des puits.
    REMARQUE: Il vaut la peine de tester dans une expérience préliminaire si les cellules utilisées sont amenées de manière fiable au fond des puits.
  4. Maintenez les échantillons sur la glace pendant 15 min.
  5. Faire tourner les échantillons à 600 x g pendant 5 min à 4 °C et pipeter soigneusement pour retirer le surnageant (en laissant derrière lui 5 μL).
  6. Remettre en suspension chaque échantillon dans 55 μL de tampon NE et ajouter 30 μL des microsphères paramagnétiques conjuguées ConA prélavées (à partir de l’étape 1.7; dans Le tampon de liaison) à chaque réaction.
  7. Incuber à température ambiante pendant 10 min.

4. Pré-bloquer les échantillons pour empêcher la digestion précoce par MNase

  1. Placez la plaque sur une grille magnétique à 96 puits, laissez les perles se lier pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
  2. Ajouter 100 μL de tampon bloquant aux billes liées au noyau et mélanger avec un pipetage doux.
  3. Incuber pendant 5 min à température ambiante.

5. Ajout d’anticorps primaires

  1. Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  2. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 100 μL de tampon de lavage par réaction avec un pipetage doux.
  3. Replacez la plaque sur le rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager, puis retirez et jetez le surnageant.
  4. Remettre en suspension les billes dans 25 μL de tampon de lavage par réaction avec pipetage doux.
  5. Faire un mélange maître d’anticorps primaires : 25 μL de tampon de lavage + 0,5 μL d’anticorps par réaction.
  6. Tout en tourbillonnant doucement les billes liées aux noyaux, ajoutez 25 μL du mélange maître d’anticorps primaires à chaque échantillon traité avec un anticorps ciblant la protéine d’intérêt (généralement une dilution finale de 1:100). Ajouter 25 μL de tampon de lavage sans anticorps, si vous effectuez un contrôle.
  7. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
  8. Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  9. Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage.

6. Ajout de pA-MNase ou de pA/G-MNase

REMARQUE: La protéine A a une forte affinité pour les molécules d’IgG de certaines espèces telles que les lapins, mais ne convient pas aux IgG d’autres espèces telles que les souris ou les rats. Alternativement, la protéine A / G-MNase peut être utilisée. Cet hybride lie les IgG du lapin, de la souris et du rat, évitant ainsi le besoin d’anticorps secondaires lorsque des anticorps primaires de souris ou de rat sont utilisés.

  1. Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  2. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension chaque échantillon dans 25 μL de tampon de lavage.
  3. Faire un mélange maître pA-MNase (25 μL de tampon de lavage + quantité optimisée de pA-MNase par réaction).
  4. Tout en tourbillonnant doucement, ajoutez 25 μL du mélange maître pA-MNase à chaque échantillon, y compris les échantillons témoins.
    REMARQUE: La concentration de pA-MNase varie selon la préparation, si elle est faite maison, et doit être testée avant utilisation à chaque purification indépendante. Pour la pA/G-MNase, il faut utiliser 2,5 μL du stock 20x.
  5. Incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante.
  6. Placez la plaque sur un support magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans perturber les perles.
  7. Retirez la plaque de la grille magnétique et lavez les billes avec 100 μL de tampon de lavage, en les remettant en suspension par pipetage doux.

7. Digestion dirigée de l’ADN

  1. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes, puis retirez et jetez le surnageant.
  2. Retirez les échantillons de la grille magnétique et remettez en suspension les billes dans 50 μL de tampon de lavage par pipetage doux.
  3. Équilibrer les échantillons à 0 °C dans un mélange glace/eau pendant 5 min.
  4. Retirer les échantillons du bain-marie glace/eau à 0 °C et ajouter 1 μL de CaCl2 de 100 mM à l’aide d’une pipette multicanal. Bien mélanger (3-5 fois) avec un pipetage doux à l’aide d’une pipette multicanal de plus grand volume, puis ramener les échantillons à 0 °C.
    REMARQUE: Bien mélanger ici est essentiel. CaCl2 est ajouté pour activer la digestion MNase de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt.
  5. Démarrez une minuterie de 10 minutes dès que la plaque est de retour dans le bain de glace / eau.
  6. Arrêtez la réaction en pipetant 50 μL de tampon 2XRSTOP+ dans chaque puits, dans le même ordre que le CaCl2 a été ajouté.
    REMARQUE: Faites un tampon 2XRSTOP + avant la fin de la digestion de 10 minutes pour éviter une digestion excessive.

8. Fractionnement de l’échantillon

  1. Incuber les échantillons pendant 20 min à 37 °C.
  2. Faire tourner la plaque à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  3. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager pendant au moins 5 minutes et transférez les surnageants sur une plaque fraîche de 96 puits. Jetez les perles.

9. Extraction de l’ADN

  1. Ajouter 1 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 0,83 μL de protéinase K à 20 mg/mL à chaque échantillon.
    ATTENTION : La poudre de FDS est nocive en cas d’inhalation. Les utilisateurs doivent utiliser dans des espaces bien ventilés en portant des lunettes, des gants et un respirateur de qualité N95, à manipuler avec soin.
  2. Mélanger les échantillons par pipetage doux.
  3. Incuber les échantillons pendant 10 min à 70 °C.
  4. Remettre la plaque à température ambiante et ajouter 46,6 μL de 5 M NaCl et 90 μL de PEG 4000 à 50 %. Mélanger par pipetage doux.
  5. Ajouter 33 μL de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE: Assurez-vous d’apporter les billes de polystyrène-magnétite à température ambiante (~ 30 min) et mélangez bien avant de les utiliser.
  6. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez le surnageant dégager pendant environ 5 minutes, puis jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
  7. Rincer 2x avec 150 μL d’éthanol à 80% sans déranger les billes.
    ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et provoque une irritation de la peau, des yeux et des poumons. Effectuez cette étape avec des vêtements de laboratoire appropriés et dans une capuche ventilée.
  8. Faire tourner brièvement la plaque à 1000 x g pendant 30 s. Replacez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et retirez tout etOH résiduel sans perturber les perles.
  9. Séchez les échantillons à l’air libre pendant environ 2 à 5 minutes.
    REMARQUE: Ne séchez pas les perles pendant plus de 5 minutes. Si vous êtes diligent à enlever l’EtOH, 2-3 min de séchage est suffisant.
  10. Remettre en suspension les billes avec 37,5 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  11. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez les perles se lier pendant 5 min.
  12. Transférer 36,5 μL du surnageant vers une plaque de 96 puits compatible avec le thermocycleur frais. Jetez les perles.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant des échantillons à -20 ° C ou peut continuer avec la construction de la bibliothèque (étapes 10-15).

10. Réparation finale, phosphorylation, adénylation

REMARQUE : Les réactifs proviennent de la liste des matériaux, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Le protocole ci-dessous suit une méthode similaire au kit commercial tel que le kit NEBNext Ultra DNA II.

  1. Diluer 5 U/μL d’ADN polymérase T4 1:20 dans 1x tampon d’ADN ligase T4.
  2. Préparer un mélange maître de réparation finale/3'A : 2 μL de 10x tampon d’ADN ligase T4, 2,5 μL de 10 mM dNTP, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40 % PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL d’ADN polymérase T4 diluée, 0,5 μL de 5U/μL d’ADN polymérase Taq, avec un volume total de 13,5 μL par réaction.
    REMARQUE: Assurez-vous d’apporter 40% PEG 4000 à la température ambiante avant le pipetage.
  3. Ajouter 13,5 μL de mélange maître de réparation finale/3'A à 36,5 μL d’ADN.
  4. Mélanger la réaction par vortex rapide, puis un spin rapide (500 x g pendant 10 s).
  5. Incuber en utilisant les conditions de réaction suivantes dans un thermocycleur pré-refroidi avec un couvercle chauffé pour des températures >20 °C. Utilisez les conditions de réaction : 12 °C pendant 15 min, 37 °C pendant 15 min, 72 °C pendant 20 min, maintenir à 4 °C.

11. Ligature de l’adaptateur

REMARQUE: Gardez les échantillons sur la glace tout en mettant en place la réaction suivante. Laissez le tampon ligase atteindre la température ambiante avant le pipetage. Diluer l’adaptateur (voir tableau des matériaux) dans une solution de 10 mM de Tris-HCl contenant 10 mM de NaCl (pH 7,5). En raison du faible rendement, ne pré-quantifiez pas l’ADN enrichi en CUT&RUN. Générez plutôt des dilutions 25 fois de l’adaptateur, en utilisant une concentration finale de l’adaptateur de travail de 0,6 μM.

  1. Faire un mélange maître de ligature : 55 μL de tampon ligase (2x), 5 μL d’ADN ligase T4 et 5 μL d’adaptateur dilué, avec un volume total de 65 μL par réaction.
  2. Ajouter 65 μL du mélange de ligature maître à 50 μL d’ADN à partir de l’étape 10.5.
  3. Mélanger par vortex rapide, suivi d’une rotation rapide (500 x g pendant 10 s).
  4. Incuber à 20 °C dans un thermocycleur (sans couvercle chauffant) pendant 15 min.
    REMARQUE : Passez immédiatement à l’étape suivante.

12. Digestion de l’UTILISATEUR

  1. Ajouter 3 μL d’enzyme USER à chaque échantillon, vortex et spin (500 x g pendant 10 s).
  2. Incuber dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 15 min (couvercle chauffé réglé à 50 °C).

13. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite après réaction de ligature

REMARQUE: Laissez les billes de polystyrène-magnétite s’équilibrer à température ambiante (~ 30 min). Vortex pour homogénéiser la solution de billes avant utilisation. Effectuez les étapes suivantes à température ambiante.

  1. Ajouter 39 μL (0,33x) de solution de billes de polystyrène-magnétite à chaque puits contenant de l’ADN ligaturé par adaptateur.
  2. Bien mélanger par pipetage, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min pour permettre à l’ADN de se lier aux perles.
  3. Placez les échantillons sur un rack magnétique à 96 puits et incubez pendant 5 minutes jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
  4. Gardez la plaque sur le support magnétique et retirez et jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
  5. Rincez les billes avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
  6. Incuber pendant 30 s sur un rack magnétique de 96 puits pour permettre à la solution de s’éclaircir.
  7. Retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.
  8. Répétez les étapes 13.5 à 13.7 pour un total de deux lavages.
  9. Faites tourner brièvement la plaque à 500 x g pendant 10 s, replacez la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et retirez l’EtOH résiduel sans perturber les perles.
  10. Conservez la plaque sur la grille magnétique et séchez les échantillons à l’air libre pendant 2 min.
    REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
  11. Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 28,5 μL de 10 mM tris-HCl (pH 8).
    ATTENTION : L’acide chlorhydrique est très corrosif. Les utilisateurs doivent le manipuler avec soin dans une hotte à fumée chimique en portant des lunettes, des gants et un manteau de laboratoire.
  12. Ressuspendez soigneusement les perles par pipetage, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
  13. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  14. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
  15. Transférer 27,5 μL de surnageant sur une nouvelle plaque PCR et jeter les billes.

14. Enrichissement de la bibliothèque

REMARQUE: Les apprêts sont dilués avec la même solution que l’adaptateur. Pour cette construction de bibliothèque, utilisez une concentration finale d’amorce de travail de 0,6 μM.

  1. Ajouter 5 μL d’amorce indexée diluée (voir tableau des matériaux) à chaque échantillon.
    REMARQUE : Chaque échantillon a besoin d’un index différent pour être identifié après le séquençage.
  2. Préparer un mélange maître PCR : 10 μL de 5x tampon PCR haute fidélité, 1,5 μL de dNTP 10 mM, 5 μL d’apprêt universel dilué, 1 μL de polymérase haute fidélité à démarrage à chaud de 1 U, avec un volume total de mélange maître de 17,5 μL par échantillon.
  3. Ajouter 17,5 μL de mélange PCR à 32,5 μL d’ADN purifié ligaturé par adaptateur (5 μL d’amorce indexée sont inclus dans ce volume).
  4. Mélanger la solution par pipetage.
  5. Incuber dans un thermocycleur en utilisant les conditions de réaction suivantes avec une vitesse de rampe maximale de 3 °C/s : 98 °C pendant 45 s, 98 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 10 s, répéter les deuxième et troisième étapes 21 fois, 72 °C pendant 1 min, maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pour le stockage à court terme ou à -20 °C pour le stockage à long terme.

15. Nettoyage des billes de polystyrène-magnétite

  1. Ajouter 60 μL (1,2x) de billes de polystyrène-magnétite à chaque échantillon.
  2. Remettre en suspension les billes par pipetage et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  3. Placez la plaque sur un support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire.
  4. Jeter le surnageant et rincer les perles avec 200 μL de 80% d’EtOH sans déranger les perles.
  5. Répétez l’étape de lavage pour un total de deux lavages EtOH à 80%.
  6. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 10 s, placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez les perles se lier pendant 5 min.
  7. Pipette pour enlever l’excès d’EtOH sans déranger les perles et laisser sécher les perles à l’air libre pendant 2 min.
    REMARQUE: Ne séchez pas trop les perles.
  8. Remettre en suspension les billes dans 21 μL d’eau sans nucléase et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  9. Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min.
  10. Transférer 20 μL du surnageant sur une nouvelle plaque.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée ici en stockant l’échantillon à -20 ° C.
  11. Quantifier les concentrations de bibliothèque à l’aide d’un fluoromètre (voir Tableau des matériaux), à l’aide d’un réactif SH 1x.
  12. Si la concentration le permet, exécutez 30 ng d’échantillon sur un gel d’agarose à 1,5% avec une échelle de faible poids moléculaire pour visualiser. Vous pouvez également effectuer une visualisation sur un analyseur de fragments ou un instrument associé.
  13. Séquencer des bibliothèques sur une plate-forme Illumina pour obtenir environ 50 000 à 100 000 lectures mappées de manière unique.

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Résultats

Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de protéines unicellulaires sur la chromatine en utilisant un format manuel de 96 puits uliCUT & RUN. Bien que les résultats varient en fonction de la protéine profilée (en raison de l’abondance des protéines et de la qualité des anticorps), du type de cellule et d’autres facteurs contributifs, les résultats prévus pour cette technique sont discutés ici. La qualité cellulaire (apparence cellulaire et pourcentage de cellules viables) et le tri unicellulaire doi...

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Discussion

CUT&RUN est un protocole efficace pour déterminer la localisation des protéines sur la chromatine. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres protocoles, notamment: 1) un rapport signal/bruit élevé, 2) un protocole rapide et 3) une faible couverture de lecture de séquençage requise, ce qui entraîne des économies de coûts. L’utilisation de la protéine A- ou de la protéine A/G-MNase permet d’appliquer CUT&RUN avec n’importe quel anticorps disponible; par conséquent, il a le potentiel de profiler rapidement et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent lié à ce projet.

Remerciements

Nous remercions les membres du Hainer Lab d’avoir lu et commenté une version antérieure de ce manuscrit. Ce projet a utilisé le NextSeq500 disponible au centre de séquençage des sciences de la santé de l’Université de Pittsburgh à l’hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh pour le séquençage, avec des remerciements particuliers à son directeur, William MacDonald. Cette recherche a été soutenue en partie par le Center for Research Computing de l’Université de Pittsburgh grâce aux ressources informatiques fournies. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (à S.J.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes microfuges transparents de 1,5 mLThermoFisher Scientific90410
Tube de 1,5 mL Rack magnétiqueThermoFisher Scientific12321D
Centrifugeuse à froid compatible avec les tubes de 1,5 mLEppendorf5404000537
culture de tissus stériles de 10 cmThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA LigaseNouveau Angleterre BiolabsB0202S
15 mL tubes coniquesVWR89039-656
1X tampon TEThermoFisher Scientific12090015
200 µ ; L Tubes PCREppendorf951010022
2X tampon ligase rapideNew England BiolabsM2200Tampon ligase
5X Tampon HiFi KAPARoche79588890015X tampon PCR haute fidélité
7-Amino-Actinomycine D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
Rack magnétique à 96 puitsThermoFisher Scientific12027 ou 12331D
Plaque à 96 puitsVWR82006-636
Perles AMPure XPBeckman CoulterA63881Perles de polystyrène-magnétite ; En raison de la variabilité potentielle entre les lots de billes AMPure XP, il est recommandé d’étalonner votre solution de billes AMPure. Voir le fabricant' Instructions de
l’anticorps contre la protéine d’intérêtATP
ThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A billesPolysciences86057-10Microsphères paramagnétiques conjuguées ConA
BSA
Chlorure de calcium (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Trieur de cellulesBD FACSAria II TrieurNécessite une formation
Milieux spécifiques aux cellules pour la culture cellulaireVarie
ChloroformeThermoFisher ScientificC298-500Le chloroforme est irritant pour la peau et nocif en cas d’ingestion ; manipuler dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire et de lunettes
Ordinateur avec processeur 64 bits et accès à un cluster de super calculateursPour l’analyse computationnelle des ensembles de données de séquençage résultants
Colonnes de spin d’ADNEpoch Life Sciences1920-250
dNTP setNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
L’équipement d’électrophorèsevarie
ÉthanolFisher Scientific22032601100 % vol/vol l’éthanol est hautement inflammable ; manipuler dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire, et lunettes
Acide éthylènediaminetétraacétique  ; (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GlycérolFisher ScientificBP229-1
GlycogèneVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Hétérologue S. cerevisiae Spike d’ADNfait maisonPréparé à partir d’ADN génomique réticulé, digéré par la MNase et extrait d’un gel d’agarose, purifié de la protéine/de l’ARN et dilué à 10 ng/mL. Nous recommandons l’ADN génomique de levure, mais d’autres organismes peuvent être utilisés si nécessaire.
Acide chlorhydrique  ; (HCl)Fisher ScientificA144-212L’acide chlorhydrique est très corrosif ; manipulez-le dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire et de lunettes de protection
Le seau à glacevarie
Plateforme de séquençage Illumina (par exemple, NextSeq500)Incubateur Illumina
avec contrôle de la température et de l’atmosphèreThermoFisher Scientific51030284
KAPA HotStart HiFi DNA polymérase avec tampon 5X KAPA HiFiRoche7958889001hotstart haute fidélité polymérase Hotte
flux laminaireBakery CompanySG404
Chlorure de manganèse (MnCl2)Sigma Aldrich244589
Jeu de micropipettesRainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
Adaptateur NEBNew England BiolabsE6612AVIALAdaptateur
NEB Amorce universelleNew England BiolabsE6611AVIALUniversal Primer
NEBNext Multiplex Oligos pour kit IlluminaNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LAmorces indexées
Anticorps de contrôle négatifAnticorps en ligneABIN101961
Eau sans nucléaseNew England BiolabsB1500S
Thermocycleur PCREppendorf2231000666
Tubes à verrouillage de phaseQiagen129046
Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (PCI)ThermoFisher Scientific15593049Le phénol est nocif en cas d’ingestion ou de contact avec la peau ; manipuler dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire et de
lunettes de protectionSolution saline tamponnée au phsophate (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
Aide à la pipetteDrummond Scientific# 4-000-100
Polyéthylène glycol (PEG) 4000VWRA16151
Chlorure de potassium (KCl)Sigma AldrichP3911
Hydroxyde de potassium (KOH)Fisher ScientificP250-1ATTENTION Le KOH est un irritant pour les yeux et la peau sous forme de solution solide et corrosive. Manipuler dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire et de lunettes de protection
Inhibiteurs de protéaseThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purifiée à partir de pK19pA-MNAddgene86973
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ33230
Tubes de dosage QubitThermoFisher ScientificQ32856
Fluorimètre QubitThermoFisher ScientificQ33238
Quick Ligase avec tampon 2X Quick LigaseNew England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
Acétate de sodium  ; (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Dodécylsulfate de sodium (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS est toxique en cas d’inhalation ; manipulez avec précaution dans des espaces bien ventilés à l’aide de gants, d’une protection oculaire et d’un respirateur de qualité N95 lors de la manipulation
d’hydroxyde de sodium (NaOH)Fisher ScientificS318-1Le NaOH est un irritant pour les yeux et la peau sous forme de solution solide et corrosive. Manipuler dans une hotte chimique à l’aide de gants, d’une blouse de laboratoire et de lunettes de protection
SpermidineSigma AldrichS2626
Microscope standard à lumière inverséeLeica11526213
Matériaux de gel d’agarose de laboratoire standardVarie
Matériaux de laboratoire standard tels que les pipettes sérologiques et les pointes de pipetteVarie
T4 ADN LigaseNouveau Angleterre BiolabsM0202S
T4 ADN polyméraseNew England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Vortexer de tableFisher Scientific2215414
Taq DNA polyméraseNew England BiolabsM0273S
ThermomixeurEppendorf5384000020Alternativement, peut utiliser un bain-marie
Base TrisFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 est dangereux ; utilisez une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation
trypsineFisher ScientificMT25052
RotatorVWR10136084
USER enzymeNew England BiolabsM5505S
Plaques de de cellules à de la

Références

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