Imagerie tissulaire hautement multiplexée avec des colorants Raman

Summary

L’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel est une nouvelle plate-forme pour l’imagerie de protéines à base d’épitopes hautement multiplexées. Ici, nous présentons un guide pratique comprenant la préparation des anticorps, la coloration des échantillons de tissus, l’assemblage du microscope SRS et l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Abstract

La visualisation d’un vaste éventail de biomarqueurs spécifiques dans les tissus joue un rôle essentiel dans l’exploration des organisations complexes de systèmes biologiques complexes. Par conséquent, les technologies d’imagerie hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées. Nous décrivons ici une plate-forme émergente d’imagerie vibratoire hautement multiplexée de protéines spécifiques avec une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard via l’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel. Cette méthode contourne la limite des canaux résolvables spectralement dans l’immunofluorescence conventionnelle et fournit une approche optique unique pour interroger plusieurs marqueurs dans les tissus avec une résolution subcellulaire. Il est généralement compatible avec les préparations tissulaires standard, y compris les tissus fixés au paraformaldéhyde, les tissus congelés et les tissus humains incorporés dans de la paraffine fixée au formol (FFPE). Nous envisageons que cette plate-forme fournira une image plus complète des interactions protéiques des spécimens biologiques, en particulier pour les tissus épais intacts. Ce protocole fournit le flux de travail de la préparation des anticorps à la coloration des échantillons de tissus, à l’assemblage du microscope SRS, à l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Introduction

Les systèmes tissulaires complexes sont composés de sous-populations cellulaires distinctes dont les emplacements spatiaux et les réseaux d’interaction sont profondément liés à leurs fonctions et à leurs dysfonctionnements ^1,2. Pour révéler l’architecture tissulaire et interroger sa complexité, la connaissance des emplacements spatiaux des protéines à résolution unicellulaire est essentielle. Par conséquent, les technologies d’imagerie protéique hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées et pourraient devenir une pierre angulaire pour l’étude de la biologie tissulaire

Protocol

Le protocole a été mené conformément au protocole expérimental animal (AC-AABD1552) approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia.

1. Préparation d’anticorps conjugués Raman-dye

1. Préparer le tampon de conjugaison comme ~0,1 M NaHCO₃ dans un tampon PBS, pH = 8,3, conserver à 4 °C.
2. Préparer la solution de sonde MARS fonctionnant sous forme d’ester (matériau supplémentaire) de N-hydroxysuccinimidy (NHS) sous forme de 3 mM dans du DMSO anhydre. La synthèse des sondes MARS peut être renvoyée aux rapports antérieurs 13,17,18.

Results

La figure 3 montre des exemples d’images d’epr-SRS dans différents échantillons, y compris des cellules fixes (figure 3A), des tissus de souris fixés au paraformaldéhyde (PFA) (figure 3B) et des échantillons humains incorporés à de la paraffine fixée au formol (FFPE) (figure 3C). La résolution spatiale de la microscopie SRS est limitée par diffraction, la résolution latérale typique est d’environ 300 nm.......

Discussion

Ici, nous présentons le protocole immuno-eprSRS qui est largement applicable aux types de tissus courants, y compris les tissus de souris fraîchement conservés, les tissus humains FFPE et les tissus de souris congelés. Immuno-eprSRS a été validé pour un panel d’épitopes dans les cellules et les tissus, comme indiqué dans le tableau 1. Cette plate-forme one-shot est particulièrement adaptée aux applications où les stratégies cycliques ne fonctionnent pas bien. Par exemple, la fluorescence cyclique est exi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 % Paraformaldéhyde, grade EM	Microscopie électronique Sciences	15710
&alpha ;-tubuline	Abcam	ab18251	Anticorps primaires
&alpha ;-tubuline	BioLegend	625902	Anticorps primaires
&beta ;-III-tubuline	BioLegend	657402	Anticorps primaires
&beta ;-III-tubuline	Abcam	ab41489	Anticorps primaires
&bêta ;-tubuline	Abcam	ab131205	Anticorps primaires
Agarose, basse température gélifiante	Sigma Aldrich	A9414	Pour l’intégration cérébrale
Anticorps anti-a-tubuline produit chez le lapin (&alpha ;-tubuline)	Abcam	ab52866	Anticorps primaires
Anticorps anti-calbindine produit chez la souris (Calbindin)	Abcam	ab82812	Anticorps primaires
Anticorps anti-GABA B R2 (récepteur B du GABA R2)	Millipore Sigma	AB2255	Anticorps primaires
Anticorps anti-GFAP produits chez la chèvre (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Anticorps primaires
anti-Glucagon produits chez la souris (Glucagon)	Biotechnologie	de Santa Cruzsc-514592	Anticorps primaires
Anticorps anti-insuline produits chez le cobaye (insuline)	DAKO	IR00261-2	Anticorps primaires
Anticorps anti-MBP produits chez le rat (MBP)	Abcam	ab7349	Anticorps primaires
Anticorps anti-NeuN produits chez le lapin (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Anticorps primaires
Anticorps anti-polypeptide pancréatique (PP) produit chez la chèvre- Polypeptide pancréatique (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Anticorps primaires
Anticorps anti-Pdx1 produit chez le lapin (Pdx1)	Milipore	06-1379	Anticorps primaires
Anticorps anti-somatostatine produit chez le rat (Somatostatine)	Abcam	ab30788	Anticorps primaires
Anticorps anti-Vimentine produit chez le poulet ( Vimentin)	Abcam	ab24525	Anticorps primaires
Filtre passe-bande	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm	Terminator Mini Circuits	STRM-50
Câble BNC	Thorlabs	2249-C	Câble coaxial, BNC Mâle /
Mâle Miroir diélectrique à large bande	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J souris	Jackson Laboratory	000664
Centrifugeuse
Condenseur	Olympus		immersion dans l’huile, 1.4 N.A.
Cytokératine 18	Abcam	ab7797	Anticorps primaires
Cytokératine 18	Abcam	ab24561	Anticorps primaires
Alimentation DC	TopWard	6302D	La tension de polarisation est de 64 V
Monture dichroïque	Thorlabs	KM100CL	Monture cinématique pour optique rectangulaire jusqu’à 1,3" (33 mm) de hauteur,
âne gaucher anti-poulet IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Anticorps secondaires pour la conjugaison MARS IgG
anti-chèvre d’âne (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Anticorps secondaires pour la conjugaison de MARS
IgG anti-cobaye d’âne (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Anticorps secondaires pour la conjugaison de MARS
IgG anti-souris d’âne (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Anticorps secondaires pour la conjugaison MARS
IgG anti-Rabbit (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Anticorps secondaires pour la conjugaison MARS
IgG anti-Rat d’âne (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Anticorps secondaires pour la conjugaison MARS
IgG anti-mouton Donkey (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondaire anticorps pour la conjugaison MARS
DPBS Fisher	Scientific	14-190-250
EpCAM		Abcam ab71916	Anticorps primaires
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Amplificateur de recherche à vitesse rapide	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Anticorps primaires
Giantin	Abcam	ab24586	Anticorps primaires
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticorps primaires
H2B	Abcam	ab1790	Anticorps primaires
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
Filtre passe-bande à haute OD	Chroma Technologie	ET890/220m	Filtrer le faisceau de Stokes et transmettre le faisceau de pompe
Stylo hydrophobe	Fisher	Scientific NC1384846
Insuline	ThermoFisher	701265	Anticorps primaires
Système laser SRS intégré	Physique appliquée & Électronique, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD fournit un train d’impulsions de sortie à 1 064 nm avec une largeur d’impulsion de 6 ps et un taux de répétition de 80 MHz, qui sert de faisceau de Stokes. Le faisceau à fréquence doublée à 532 nm est utilisé pour amorcer de manière synchrone un oscillateur paramétrique optique (OPO) picoseconde afin de produire un train d’impulsions à mode verrouillé avec une largeur d’impulsion de cinq ~ 6 ps (le faisceau de renvoi de l’OPO est bloqué par un filtre interférométrique). La longueur d’onde de sortie de l’OPO est réglable à partir de 720&ndash ; 950 nm, qui sert de faisceau de pompe. L’intensité du faisceau Stokes de 1 064 nm est modulée de manière sinusoïdale par une EOM intégrée à 8 MHz avec une profondeur de modulation supérieure à 90 %. Le faisceau de la pompe est superposé spatialement avec le faisceau de Stokes en utilisant un miroir dichroïque à l’intérieur de picoEMERALD. Le chevauchement temporel entre la pompe et les trains d’impulsions Stokes est obtenu à l’aide d’un étage de retard intégré et optimisé par le signal SRS de D2O pur au microscope.
Microscope à balayage laser inversé	Olympus	FV1200MPE
Monture de miroir cinématique	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Ajusteurs hexagonaux à profil bas
Lectine de Triticum vulgaris (blé)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Séparateur de faisceau dichroïque passe-long	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine  ; séparateur de faisceau dichroïque plat laser à une arête
MAP2	BioLegend	801810	Anticorps primaires
Logiciel d’imagerie par microscopie	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		Pour des analyses de petits volumes basées sur l’absorbance dans un lecteur de plaques.
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objectif Olympus		XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, distance de travail&thinsp ;=&thinsp ; 2&thinsp ; mm
Pinceau
Périscope	Thorlabs	RS99	comprend les unités supérieure et inférieure, & Oslash ; Poteau de 1" et fourche de serrage.
pH-mètre
Lecteur de plaques	Tecan	Infinite 200 PRO	Un lecteur de plaques multimode facile à utiliser. Capacités de mesure de l’absorbance sur une plage spectrale de 230 &ndash ; 1000 milles marins.
Réactif anti-décoloration ProLong Gold	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Anticorps primaires
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	de filtration sur gel pour le dessalage et l’échange de tampon
Boîtier blindé avec connecteurs BNC	Pomona Electronics	2902	Boîte en aluminium avec couvercle, BNC femelle/femelle
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350&ndash ; 1100 nm, 10 mm x 10 mm Zone active
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Anticorps primaires
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Lame adhésive pour attirer et lier chimiquement fermement des sections de tissus frais ou fixées au formol à la surface de la lame (lames de verre de liaison tiisue)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin		Abcam ab8069	Anticorps primaires
Xylenes	Sigma Aldrich	214736