Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

La communication entre l’épithélium intestinal et le système immunitaire résident de l’intestin est essentielle au maintien de l’homéostasie intestinale¹. Les perturbations de ces interactions sont associées à des maladies locales et systémiques, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et les cancers gastro-intestinaux². Un exemple notable d’un régulateur critique de l’homéostasie décrit plus récemment provient de l’étude des cellules lymphoïdes innées (ILC), qui sont devenues des acteurs clés du paysage immunitaire intestinal³. Les ILC sont un groupe de cellules immunitaires innées hétérogènes qui régulent l’homéostasie intestinale et orchestrent l’inflammation en grande partie par la signalisation médiée par les cytokines⁴.

Les ILC murins sont largement divisés en sous-types en fonction des profils d’expression du facteur de transcription, des récepteurs et des cytokines⁵. Les ILC de type 1, qui comprennent les cellules cytotoxiques Natural Killer (NK) et les ILC de type auxiliaire de type 1 (ILC1s), sont définis par l’expression du facteur de transcription (eomesodermine) Eomes et de la protéine T-box exprimées dans les lymphocytes T (T-bet)⁶, respectivement, et sécrètent des cytokines associées à l’immunité T helper de type 1 (T_H1) : interféron-γ (IFNγ) et facteur de nécrose tumorale (TNF), en réponse à l’interleukine (IL)-12, IL-15 et IL-18⁷. Au cours de l’homéostasie, les ILC1 résidant dans les tissus sécrètent des β transformant le facteur de croissance (TGF-β) pour stimuler la prolifération épithéliale et le remodelage de la matrice⁸. Les ILC de type 2 (ILC2) répondent principalement à l’infection par les helminthes par la sécrétion de cytokines associées au T helper de type 2 (T_H2) : IL-4, IL-5 et IL-13, et sont caractérisées par l’expression du récepteur orphelin (ROR) lié à l’acide rétinoïque α (ROR-α)⁹ et de la protéine de liaison GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Chez la souris, les ILC2 « inflammatoires » intestinaux sont en outre caractérisés par l’expression du récepteur de type lectine des cellules tueuses (sous-famille G membre 1, KLRG)¹³ où ils répondent à l’IL-25^14,15 dérivée des cellules épithéliales de la touffe. Enfin, les ILC de type 3, qui comprennent les cellules inductrices du tissu lymphoïde et les ILC de type 3 auxiliaires (ILC3), dépendent du facteur de transcription ROR-γt¹⁶ et se regroupent en groupes qui sécrètent soit un facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 en réponse aux signaux locaux IL-1β et IL-23¹⁷. Les cellules inductrices du tissu lymphoïde se regroupent dans les patchs de Peyer et sont cruciales pour le développement de ces organes lymphoïdes secondaires au cours du développement¹⁸, tandis que les ILC3 sont le sous-type d’ILC le plus abondant dans la lamina propria de l’intestin grêle murin adulte. L’un des premiers systèmes de co-culture organoïde intestinale murine avec des ILC3 a été exploité pour distinguer l’impact de la cytokine IL-22 sur le transducteur de signal et l’activateur de transcription 3 (STAT-3) médié par la répétition riche en leucine contenant le récepteur couplé à la protéine G 5 (Lgr5) ⁺ prolifération des cellules souches^{intestinales 19}, un exemple puissant d’une interaction ILC-épithéliale régénérative. Les ILC présentent une hétérogénéité d’empreinte entre les organes^20,21 et ^présentent une plasticité entre les sous-ensembles en réponse à des cytokines polarisantes²². Ce qui motive ces empreintes tissulaires et ces différences de plasticité, et quel rôle elles jouent dans les maladies chroniques telles que la^{MII 23}, restent des sujets passionnants qui pourraient être abordés à l’aide de co-cultures organoïdes.

Les organoïdes intestinaux sont apparus comme un modèle réussi et fiable pour étudier l’épithélium intestinal^24,25. Ceux-ci sont générés par la culture de cellules souches Lgr5⁺ épithéliales intestinales, ou de cryptes isolées entières, qui incluent des cellules Paneth comme source endogène de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Ces structures 3D sont maintenues soit dans des hydrogels synthétiques²⁶, soit dans des biomatériaux qui imitent la lamina propria basale, par exemple, la matrice extracellulaire basale à réticulation thermique (TBEM), et sont complétées par des facteurs de croissance qui imitent la niche environnante, notamment le facteur de croissance épithélial (EGF), l’inhibiteur de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) Noggin, et un ligand Lgr5 et un agoniste Wnt R-Spondin1²⁷ . Dans ces conditions, les organoïdes maintiennent la polarité apico-basale épithéliale et récapitulent la structure crypte-villosité de l’épithélium intestinal avec des cryptes de cellules souches bourgeonnantes qui se différencient en phase terminale en cellules absorbantes et sécrétoires au centre de l’organoïde, qui se déversent ensuite dans le pseudollumen interne par anoikis²⁸. Bien que les organoïdes intestinaux seuls aient été extrêmement avantageux en tant que modèles réductionnistes du développement épithélial et de la dynamique isolément^29,30, ils recèlent un énorme potentiel futur pour comprendre comment ces comportements sont régulés, influencés ou même perturbés par le compartiment immunitaire.

Dans le protocole suivant, une méthode de co-culture entre des organoïdes murins de l’intestin grêle et des ILC1 dérivés de la lamina propria est décrite, qui a récemment été utilisée pour identifier comment cette population diminue de manière inattendue les signatures intestinales de l’inflammation et contribue plutôt à une prolifération épithéliale accrue via le TGF-β dans ce système⁸.

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément à toutes les lignes directrices réglementaires et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation des animaux. L’approbation éthique de l’étude décrite dans l’article et la vidéo suivants a été obtenue conformément à toutes les directives réglementaires et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation des animaux.

Toutes les souris ont été abattues par luxation cervicale selon la procédure éthique standard, menée par des individus formés. Avant le prélèvement d’organes et de tissus, le tranchage de l’artère fémorale ou la décapitation ont été effectués (selon le protocole en main) en tant qu’évaluations confirmatoires du décès. Les animaux ont été hébergés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (sauf indication contraire) dans une unité commerciale accréditée et dans l’unité animale du King’s College de Londres conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) (licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni (PPL: 70/7869 à septembre 2018; P9720273E à partir de septembre 2018).

1. Établissement d’organoïdes murins de l’intestin grêle

REMARQUE: Cette section du protocole décrit la génération d’organoïdes intestinaux à partir de l’intestin grêle murin. Les cryptes sont d’abord isolées des tissus, remises en suspension dans TBEM, puis incubées avec des milieux contenant de l’EGF, du Noggin et de la R-Spondine (ENR). L’établissement d’organoïdes murins de l’intestin grêle a également été bien décrit ailleurs 24,25,27.

1. Placer TBEM sur de la glace pour décongeler (40 μL/puits) et mettre une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire standard (c’est-à-dire des plaques avec une surface hydrophile et chargée négativement) dans un incubateur à 37 °C pour préchauffer.
   REMARQUE: 500 μL de TBEM dégèleront en environ 2-4 h; ne le laissez pas à température ambiante.
2. Préparer environ 4 mL ou 550 mL par puits de milieu ENR en ajoutant de l’EGF, du Noggin et de la R-Spondine au milieu basal (tableau 1) et placer dans un incubateur à 37 °C.
3. Abattez un animal de 6 à 12 semaines et disséquez l’intestin grêle à l’aide d’une pince et de ciseaux à microdissection. Placez-le dans 15 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur de la glace.
4. En utilisant l’estomac et le caecum comme points d’orientation, isolez la région souhaitée de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum ou iléon). Dans ce protocole, l’iléon est isolé.
5. Immergez l’intestin dans le PBS sur une boîte de Petri de 10 cm² sur de la glace. À l’aide d’une pince, retirez la graisse doucement, mais complètement, de l’intestin.
6. Coupez le tissu longitudinalement à l’aide de ciseaux à microdissection (de préférence avec des pointes arrondies pour éviter toute perforation). Garder l’intestin immergé dans le PBS, agiter pour éliminer les matières fécales et maintenir le côté muqueux vers le haut pour suivre l’orientation des tissus.
7. Transférer le tissu sur le couvercle sec d’une boîte de Petri sur de la glace, en plaçant le côté muqueux / villosités de l’intestin vers le haut. En tenant une extrémité de l’intestin avec une pince, grattez doucement le mucus à l’aide du bord incliné d’une lame de verre propre.
8. Remplissez la plaque de PBS glacé et rincez le tissu.
9. Pré-enduire un tube de 50 mL de PBS2 (PBS + 2% FCS; voir tableau 1) pour empêcher l’adhérence du tissu au plastique et ajouter 10 mL de PBS glacé à ce tube. Couper l’intestin en petits segments (~2 mm) et les transférer dans le tube de 50 mL pré-enduit de PBS2.
10. À l’aide d’une pipette de 25 mL pré-enduite de PBS2, pipettez les segments de haut en bas 5 à 10 fois pour nettoyer les fragments de tissu.
11. Laissez les segments se déposer pendant 15 à 30 s, retirez et jetez le surnageant PBS et répétez les étapes 1.10 et 1.11 jusqu’à ce que la solution soit claire (environ 3-4 fois).
12. Laissez les segments se déposer et jetez le surnageant PBS. Ajouter 30 mL de tampon d’isolation de crypte glacée (tableau 1).
13. Placez les tubes sur un rouleau horizontal ou une bascule à 30-60 tr/min (ou doucement) pendant 30 min à 4 °C. N’incubez pas à des vitesses plus rapides, à des températures plus élevées ou à une durée plus longue, car les cryptes se délogeront prématurément et deviendront des cellules uniques avec une viabilité et un rendement inférieurs.
    REMARQUE: À partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux stériles et de réactifs.
14. Laissez les segments intestinaux se déposer à la base du tube de 50 mL. Retirez le tampon d’isolation de la crypte sans perturber les segments décantés et transférez-le dans un tube de 50 mL sur de la glace.
    REMARQUE: Si le processus d’isolation de la crypte était trop rigoureux, les cryptes peuvent être vues dans cette fraction. Il peut donc être conservé en réserve mais sera éliminé de manière optimale à la fin du protocole.
15. Ajouter 20 mL de PBS glacé aux segments intestinaux. À l’aide d’une pipette de 25 mL pré-enduite de PBS2, pipette les segments intestinaux de haut en bas 5 à 8 fois.
16. Laissez les segments se contenter de 30 s. Pré-enduire un tube de 50 mL et une pipette de 25 mL avec PBS2. À l’aide de cette pipette, recueillir le surnageant (fraction 1) dans le tube pré-enduit de 50 mL et placer le tube sur de la glace.
    REMARQUE: Cette fraction sert à rincer le tampon d’isolation de crypte restant. Cependant, il sert également d’étape supplémentaire de contrôle de la qualité; si le pipetage était trop vigoureux, les cryptes seront abondantes dans cette fraction de rinçage, et si elle était trop douce, il y aura très peu de débris dans cette fraction. Idéalement, la fraction 1 est rejetée à la fin du protocole, mais elle peut être utilisée pour fabriquer des organoïdes si des problèmes surviennent avec les fractions 2 à 4 obtenues ci-dessous.
17. Répétez les étapes 1.15 et 1.16, mais ajoutez 10 mL de PBS glacé au lieu de 20 mL et placez le surnageant dans un tube frais de 50 mL pré-enduit de PBS2 (fraction 2).
18. Répétez l’étape 1.17 deux fois de plus, mais regroupez le surnageant résultant avec la fraction 2 (dans le même tube de 50 mL de l’étape 1.17) pour obtenir les fractions 2 à 4. Ce tube unique de 50 mL devrait contenir les cryptes délogées dans 30 mL de PBS glacé.
19. Retirez une aliquote de 50 μL des 2 à 4 fractions regroupées et placez-la sur un couvercle. Évaluer la présence de cryptes épithéliales à l’aide d’un microscope à lumière inversée.
    REMARQUE: Si les cryptes ne sont pas présentes, répétez les étapes 1.17 et 1.18 en utilisant plus de force pendant le pipetage jusqu’à ce que les cryptes soient libérées. Assurez-vous que les cryptes n’ont pas été délogées prématurément dans le tampon d’isolation des cryptes à partir de l’étape 1.14 ou dans la fraction 1 à partir de l’étape 1.16.
20. Pré-enduire une passoire de 100 μm et un tube de 50 mL avec PBS2. Passez les fractions de crypte regroupées à travers cette passoire et dans le tube pré-enduit de 50 mL.
21. Faire tourner les fractions de crypte tendues à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
22. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cryptes dans 10 mL de DMEM/F12 avancé glacé. Déplacez les cryptes dans un tube de 15 mL.
23. Faites tourner les cryptes à 210 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les cellules individuelles et les lymphocytes.
24. Resuspendez les cryptes dans 1 mL de DMEM/F12 avancé glacé.
25. Retirez une aliquote de 10 μL et placez-la sur un couvercle. À l’aide d’un microscope à lumière inversée, comptez le nombre de cryptes pour déterminer la concentration de crypte.
26. Calculez le volume requis pour ~400 et ~1 500 cryptes. Pré-enduire une pointe p1000 avec DU PBS2 et utiliser cette pointe pour pipeter les volumes requis (contenant ~400 et ~1 500 cryptes) dans des tubes séparés de 1,5 mL.
27. Faire tourner les cryptes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
28. Retirez autant de surnageant que possible, puis remettez en suspension les cryptes dans 80 μL de TBEM placé sur de la glace (embouts de pipette pré-refroidissables à 4 °C pour éviter la gélification de la matrice, qui se produit à 12 °C).
29. Retirez la plaque de 24 puits, placée à l’étape 1.1, de l’incubateur. Pipettez doucement 40 μL de cryptes au centre d’un puits dans un mouvement lent et circulaire pour former une structure de dôme plate mais 3D, ou en trois petits dômes séparés.
    REMARQUE: La viabilité des organoïdes est la plus faible au centre du dôme où les nutriments et les gaz pénètrent moins efficacement³¹; il est donc essentiel de maximiser la surface exposée aux médias tout en maintenant des structures 3D claires.
30. Répétez l’étape 1.29 pour créer un total de deux puits d’une densité d’environ 200 cryptes par puits et de deux autres puits d’une densité d’environ 750 cryptes par puits. Placez directement la plaque dans un incubateur (37 °C et 5% de CO₂) pendant 15-20 min, en prenant soin de ne pas perturber les dômes à matrice visqueuse mais toujours liquide.
31. Ajouter 550 μL de milieux ENR préchauffés par puits (à partir de l’étape 1.2) et incuber pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO_2. À ce stade, il est suggéré de compléter le milieu ENR avec 5 μM d’agoniste Wnt (CHIR 99021) et 5 μM d’inhibiteur de rho kinase (Y-27632) pendant les 24 premières heures de culture après l’isolement afin d’améliorer le rendement et l’efficacité de la génération organoïde de cryptes fraîchement isolées à partir de tissus.
    REMARQUE: Les cryptes doivent se fermer pour former des structures arrondies dans les 24 heures, et les bourgeons de crypte doivent apparaître dans les 2-4 jours (Figure 1A).
32. Remplacer par un milieu ENR frais à la fin de l’incubation à l’étape 1.31, puis tous les ~2 jours ou lorsque l’indicateur de pH phénol dans le milieu de culture devient orange pâle mais avant qu’il ne jaunisse.

2. Entretien des organoïdes murins de l’intestin grêle

REMARQUE: Cette section du protocole décrit l’entretien et le passage des organoïdes murins de l’intestin grêle. Les organoïdes sont d’abord prélevés, puis perturbés mécaniquement à l’aide d’une pointe p1000 courbée. Ce processus brise les grands organoïdes constitués de nombreuses cryptes en plusieurs fragments plus petits pour l’expansion et libère des cellules mortes qui se sont accumulées dans le pseudolumen. L’entretien organoïde de l’intestin grêle murin a également été bien décrit ailleurs 24,25,27. Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux stériles et de réactifs. Passage ou expansion des organoïdes une fois tous les 4-5 jours, avant que l’éclatement des organoïdes ne se produise à partir d’une accumulation substantielle de débris dans la lumière organoïde. Les organoïdes peuvent être passés à un rapport de 1: 2-1: 3 en fonction de la densité organoïde, qui sera idéalement comprise entre 100 et 200 organoïdes par puits.

1. Comme aux étapes 1.1 et 1.2, décongeler le TBEM sur de la glace (40 μL/puits) et préparer le milieu ENR (550 μL par puits). Placer la plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire moyenne et standard dans un incubateur à 37 °C.
2. Retirez la plaque contenant des organoïdes de l’incubateur. Jetez les médias du puits pour les passer.
3. Ajouter 500 μL de DMEM/F12 avancé glacé au puits. À l’aide d’une pointe p1000 (pré-enduite de support pour éviter que les organoïdes ne collent à l’intérieur de la pointe), prélèvez les organoïdes dans un tube de 15 mL.
4. Rincer le fond du puits avec 250 à 300 μL de DMEM/F12 avancé glacé en veillant à ce qu’aucun organoïde ne reste dans le puits, et s’accumuler dans le tube de 15 mL contenant les organoïdes prélevés à l’étape 2.3. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 lorsque vous passez plusieurs puits et regroupez les organoïdes de plusieurs puits dans le même tube de 15 mL.
5. Faire tourner les organoïdes à 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
6. Lors de la centrifugation, assurez-vous qu’il y a quatre fractions visibles : une fraction de base avec des organoïdes sains, une fraction de matrice centrale et claire, une fraction de matrice contenant des cellules simples et mortes, et une couche supérieure surnageante contenant des cellules simples et mortes. Retirez le surnageant, la fraction de débris et autant de fragments de matrice claire que possible sans perturber la pastille d’organoïdes.
7. Pliez doucement la pointe d’une pointe de pipette p1000 (courbure d’environ 2 à 5 mm). Pré-enduisez cette pointe en PBS2 ou Advanced DMEM/F12. À l’aide de cette pointe, pipettez les organoïdes de haut en bas 10 à 20 fois pour perturber mécaniquement les organoïdes et la matrice restante.
8. Tourner vers le bas à 210 x g pendant 3 min à 4 °C.
9. Comme à l’étape 2.6, retirez le surnageant, la fraction de débris et autant de fragment de matrice claire que possible sans perturber la pastille des cryptes dissociées. Si des cryptes saines ou de petits organoïdes n’ont pas formé de pastille claire, centrifuger à nouveau à 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
10. Calculer le volume requis de TBEM (80-120 μL par puits d’organoïdes prélevés selon qu’un rapport de passage de 1:2 ou 1:3 est utilisé).
11. Remettez en suspension la pastille dans le volume calculé de TBEM et appliquez 40 μL par puits sur la plaque préchauffée de 24 puits pour former un dôme. Placez directement la plaque dans l’incubateur (37 °C; 5% de CO₂) pendant 15-20 min.
12. Ajouter 550 μL de milieu ENR par puits et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂. Vérifier la formation d’organoïdes dans les cultures après 24 h_. Remplacer par un support ENR frais tous les 2-3 jours après le passage.

3. Isolement des cellules lymphoïdes innées de lamina propria de l’intestin grêle

REMARQUE: Cette section du protocole décrit l’isolement de l’ILC1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin des souris rapporteures RORγt^GFP. Cela implique l’élimination des cellules épithéliales, la digestion des tissus, la séparation du gradient de densité des lymphocytes et l’isolement de l’ILC1 via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). L’isolement du FACS selon la stratégie de contrôle de la figure 2 nécessite le mélange maître de coloration extracellulaire (tableau 4), avec les contrôles de coloration supplémentaires décrits dans les tableaux 2 et 3 pour la machine (tableau 2) et le système de contrôle (tableau 3). Les souris rapporteures RORγt^GFP sont utilisées pour isoler l’ILC1 pur vivant et exclure RORγt^GFP+ ILC3. Le traitement tissulaire pour l’isolement des lymphocytes de lamina propria a également été bien décrit ailleurs³².

1. Traitement des tissus
   REMARQUE: Les tissus provenant de répliques animales biologiques individuelles sont séparés dans ce protocole. Ces échantillons doivent être étiquetés de façon appropriée et conservés sur la glace dans la mesure du possible. Tous les réactifs, à l’exception des enzymes de digestion, doivent atteindre la température ambiante pour assurer une digestion rapide des tissus.
   1. Placer TBEM sur la glace pour qu’il dégèle (40 μL/puits). Conservez une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire standard dans un incubateur à 37 °C pour préchauffer.
   2. Préparer un tampon d’élimination épithélial frais et un tampon de digestion (voir le tableau 1). Préparer un milieu isotonique à gradient de faible densité de viscosité (LVDGM) (90 % de LVDGM et 10 % de PBS 10x), 40 % de LVDGM isotonique et 80 % de LVDGM isotonique dans un tampon neutralisant (tableau 1).
   3. Abattez un animal âgé de 6 à 12 semaines, disséquez l’intestin grêle à l’aide d’une pince et de ciseaux à microdissection et placez l’intestin dans 15 ml de PBS sur de la glace.
   4. Immergez l’intestin dans le PBS sur une boîte de Petri de 10 cm² sur de la glace et utilisez une pince pour éliminer la graisse doucement mais complètement de l’intestin.
   5. Retirez les patchs de Peyer (~ 5-10; en cours d’exécution dans une ligne opposée à la ligne du tissu adipeux) à l’aide de ciseaux à microdissection pour épuiser les cellules inductrices du tissu lymphoïde et les cellules B.
      REMARQUE: Les taches de Peyer sont absentes chez les animaux ^appauvris en chiffon et autres lignées. Contrairement aux bulles d’air, les patchs de Peyer resteront en place s’ils sont poussés.
   6. Coupez le tissu longitudinalement à l’aide de ciseaux à microdissection (de préférence avec des pointes arrondies pour éviter toute perforation). En gardant l’intestin immergé dans le PBS, secouez pour éliminer les matières fécales.
   7. Coupez le tissu en morceaux de 2 à 4 cm de longueur et transférez-les dans un tube de 50 ml.
   8. Ajouter environ 20 à 40 mL de PBS glacé et agiter vigoureusement pendant 5 à 15 s pour éliminer le mucus et les débris.
   9. Jeter le contenu du tube sur une boîte de Petri fraîche et remplacer les fragments intestinaux dans le même tube de 50 mL à l’aide d’une pince.
   10. Répétez les étapes 3.1.8 et 3.1.9 3 à 4 fois, ou jusqu’à ce que le PBS soit clair.
2. Élimination de l’épithélium
   1. Placez les fragments intestinaux dans une boîte de Petri fraîche sur de la glace. À l’aide de pinces, ramassez les segments intestinaux et éliminez l’excès de liquide en tapotant sur une surface sèche.
   2. Coupez le tissu en morceaux d’environ 0,75 à 1 cm et transférez-les dans un tube frais de 50 ml. Ajouter 5 à 7 mL de tampon d’élimination épithéliale (tableau 1). Vortex le tube et s’assurer que tous les segments intestinaux sont immergés dans le tampon.
   3. Incuber les échantillons à 37 °C avec bascule (100-150 tr/min) pendant 12-15 min. Vortex le tube pendant 20-30 s.
   4. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.3 une fois de plus, en éliminant le surnageant trouble (la fraction contient des cellules épithéliales et intra-épithéliales) et en le remplaçant par un tampon d’élimination épithéliale frais.
3. Digestion des tissus
   1. Versez le contenu sur une boîte de Petri fraîche. À l’aide d’une pince, ramassez les segments intestinaux et tapotez sur une surface sèche pour éliminer l’excès de liquide. Placez les segments dans une boîte de Petri fraîche sur de la glace.
   2. Regroupez les segments au centre de la boîte de Pétri en une masse dense. À l’aide de deux scalpels ou de ciseaux tranchants, déchiquetez finement le tissu jusqu’à ce qu’il atteigne une consistance visqueuse qui pourrait passer à travers une pointe de pipette p1000.
   3. À l’aide d’une pince à épiler, placez le tissu haché dans un tube propre de 50 ml. Rincez la boîte de Pétri avec 1 à 2 mL de tampon de digestion (tableau 1) pour prélever tout tissu restant et regroupez-le dans le tube de 50 mL avec le tissu déchiqueté.
   4. Ajouter 5 à 7 mL de tampon de digestion au tissu déchiqueté et s’assurer que tous les tissus sont recueillis au fond du tube.
   5. Incuber les échantillons à 37 °C, avec un basculement moyen (~100-150 tr/min) pendant 15 min. Vortex le tube pendant 20-30 s toutes les 5 minutes pour faciliter la digestion.
   6. Pendant l’incubation des échantillons, placez une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube frais de 50 mL pour chaque échantillon. Enduisez les filtres de 1 à 2 mL de tampon neutralisant (tableau 1).
   7. Vortex les échantillons pendant 20 à 30 s après la fin de l’incubation.
   8. Filtrer le tissu partiellement digéré à travers le filtre enduit de 40 μm dans le tube de 50 mL contenant un tampon neutralisant.
   9. Utilisez une pince à épiler pour prélever les tissus non digérés du filtre de 40 μm et replacez-les dans le tube de 50 mL dans lequel la digestion a été effectuée, pour le deuxième cycle de digestion. Retirez les filtres et rincez-les avec un tampon de digestion pour déloger tout tissu non digéré adhérant au filtre.
   10. Une fois que le plus de tissu non digéré possible a été retiré du filtre et replacé dans le tube de 50 mL dans lequel la digestion a été effectuée, rincez le filtre avec un tampon neutralisant de 1 à 2 mL sur le tube de 50 mL contenant le surnageant filtré.
   11. Ajouter 20 à 25 mL de tampon neutralisant au surnageant filtré et le placer sur la glace pour maintenir la viabilité des cellules isolées lors de la deuxième série de digestion des tissus.
   12. Ajouter 5 à 10 mL de tampon de digestion supplémentaire au tissu non digéré et répéter les étapes 3.3.5-3.3.10, en veillant à filtrer le tissu digéré dans le même tube que celui utilisé à l’étape 3.3.8 (le même filtre peut également être réutilisé). Rincez le filtre avec un tampon neutralisant jusqu’à ce que la ligne de 50 mL soit atteinte, puis jetez tout tissu non digéré restant.
4. Isolement lymphocytaire par gradient de densité
   1. Faire tourner les surnageants collectés pour chaque réplique biologique à 500 x g pendant 10 min.
   2. Au cours de l’étape 3.4.1, ajouter 5 mL de LVDGM isotonique à 80 % à un tube de 15 mL pour chaque réplique biologique.
   3. Après la centrifugation, jeter le surnageant du tissu filtré et digéré. Remettre en suspension la pastille dans 10 mL de LVDGM isotonique à 40 %, en veillant à ce que la pastille soit bien homogénéisée et qu’il ne reste pas de gros morceaux.
   4. Réglez l’aide de la pipette à son réglage le plus lent, inclinez le tube de 15 mL contenant 80% de LVDGM isotonique et superposez très doucement les 10 mL de suspension cellulaire dans 40% de LVDGM isotonique en veillant à ce que la suspension de cellule ne se mélange pas avec la fraction de 80%.
      REMARQUE: Si jamais les fractions se mélangent accidentellement, répartissez rapidement les lymphocytes qui ont atteint la fraction de 80% entre deux tubes de 50 mL remplis de PBS et centrifugez pendant 10 min à 500 x g. Ensuite, jetez le surnageant et répétez les étapes 3.4.3 à 3.4.4.
   5. Faites tourner les tubes à 900 x g et 20 °C, l’accélération et la désaccélération étant réglées au réglage le plus bas pour s’assurer que les fractions ne sont pas perturbées. Centrifuger pendant 20 min (sans compter le temps de pause).
      REMARQUE: Toutes les procédures à partir de cette étape doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire aseptique à l’aide de matériaux stériles et de réactifs.
   6. Pré-enduire un tube de 50 mL pour chaque échantillon avec du PBS2 et ajouter 45 mL de PBS glacé.
   7. Après centrifugation, retirer délicatement la couche supérieure de débris du tube de 15 mL. Enduisez une pointe p1000 de PBS2 et utilisez-la pour recueillir l’interphase chargée de lymphocytes entre les gradients de 40% à 80% dans le tube de 50 mL contenant 45 mL de PBS glacé.
   8. Faire tourner les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
   9. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon FACS (PBS, 2 % FCS, 0,5 mM EDTA et 10 mM HEPES; voir tableau 1). Pré-enduire un filtre de 40 μm avec tampon FACS et l’utiliser pour filtrer la suspension cellulaire dans un tube d’écoulement. Rincez le tube de 50 mL avec un tampon FACS supplémentaire de 500 μL et filtrez dans le même tube d’écoulement.
   10. Retirer une aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire résultante de 1 mL. Comptez le rendement lymphocytaire à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre et calculez la concentration cellulaire pour chaque échantillon.
5. Préparation des échantillons pour le tri - coloration extracellulaire
   REMARQUE: Les anticorps utilisés dans le mélange maître de coloration extracellulaire, ainsi que les réactifs pour préparer le colorant de viabilité réparable et la solution de bloc Fc, sont utilisés à des concentrations suffisantes pour jusqu’à 5 x 10⁶ cellules par 100 μL. Les volumes doivent être ajustés en conséquence. Pour que la compensation de la machine FACS trie l’ILC1, des contrôles unicolores pour chacun des fluorophores du mastermix de coloration extracellulaire sont nécessaires. Pour les anticorps, des billes de compensation contenant une population de billes de liaison aux anticorps positives et une population de billes non liantes d’anticorps négatives peuvent être utilisées. Pour le contrôle monocolore du colorant de viabilité fixable ultraviolet (UV), des billes de compensation contenant des populations réactives aux amines (pour le signal positif) et non réactives (pour le signal négatif) peuvent être utilisées. Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules du RORγt^GFPsouris rapporteures pour le contrôle monocolore du colorant de viabilité fixable UV, car ces cellules contiendront un GFP⁺ signal.
   1. Retirez une petite aliquote d’environ 10 μL de chaque échantillon et regroupez-la dans un tube d’écoulement séparé contenant 250 μL de tampon FACS. Placez le tube sur de la glace. Cela sera utilisé pour le contrôle non taché.
   2. Ajouter 1 mL de PBS au volume restant dans les tubes d’échantillonnage. Centrifuger à 300-400 x g pendant 3-5 min.
   3. Préparer 200 μL de solution de colorant de viabilité fixable aux UV par échantillon. Colorant de viabilité fixable UV dilué (remis en suspension dans du DMSO en suivant les instructions du fabricant) 1:500 dans PBS (ou en suivant les instructions du fabricant).
   4. Jeter le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 200 μL de solution de colorant de viabilité fixable aux UV. Vortex les tubes et incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 10-15 min.
   5. Ajouter 2 mL de tampon FACS aux tubes pour éteindre le colorant de viabilité fixable UV, vortex pendant 10 s et centrifuger les tubes à 300-400 x g pendant 3-5 min à 4 °C. Jetez le surnageant des tubes centrifugés.
   6. Préparer 200 μL de solution de bloc Fc par échantillon (0,25 mg/mL de bloc Fc dans le tampon FACS).
   7. Ajouter 200 μL de solution de bloc Fc à chacun des échantillons de l’étape 3.5.5, vortex pendant 10 s, et incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 10 min.
   8. Ajouter 500 μL de tampon FACS à un tube d’écoulement frais. Retirez une aliquote de 2 à 5 μL de chaque échantillon et regroupez-la dans le tube pour les témoins de fluorescence moins un (FMO).
   9. Vortex le tube FMO pendant 10 s et répartir uniformément (100 μL par tube) dans des tubes d’écoulement frais étiquetés pour chacun des contrôles FMO (Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO et NK1.1 FMO; voir tableau 3). Ajouter tous les anticorps sauf l’anticorps d’intérêt à chaque tube (tel que décrit dans le tableau 3) et vortex pendant 10 s. Placez les commandes FMO de côté dans l’obscurité à 4 °C.
   10. Centrifuger les échantillons (pas les contrôles FMO) à 300-400 x g pendant 3-5 min à 4 °C.
   11. Préparer le mastermix de coloration extracellulaire (200 μL par échantillon) avec les dilutions finales d’anticorps décrites dans le tableau 4. Ajustez le volume de coloration pour la concentration cellulaire appropriée (jusqu’à 5 x 10⁶ cellules par 100 μL) en fonction du nombre de cellules à partir de l’étape 3.4.10.
   12. Ajouter le mastermix de coloration extracellulaire aux échantillons, vortex pendant 10 s, et les placer de côté dans l’obscurité à 4 °C.
   13. Préparez un nouveau contrôle de couleur unique pour chaque anticorps destiné à être utilisé dans la stratégie de contrôle (Figure 2). Les billes de compensation d’anticorps Vortex pendant 20 s, ajouter 1 goutte de perles à un tube d’écoulement, tacher avec 0,5 μL d’anticorps (comme indiqué dans le tableau 2, ou en suivant les instructions du fabricant) et le vortex pendant 10 s.
   14. Préparez un colorant de viabilité fixable UV à l’aide d’un kit de billes de compensation réactif aux amines. Les billes de compensation vortex-réactives aux amines pendant 20 s, ajouter 1 μL de colorant UV vivant/mort (comme indiqué dans le tableau 2, ou en suivant les instructions du fabricant) et le vortex pendant 10 s.
   15. Incuber les échantillons, les FMO et les commandes monochromes dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
   16. Pendant ce temps, préparez des tubes pour collecter les cellules triées. Ajouter 400-500 μL de FBS à 10 % dans des tubes Advanced DMEM/F12 à 1,5 mL pour chaque échantillon.
   17. Après l’incubation, ajoutez 2 mL de PBS2 à chacun des échantillons, contrôles FMO et contrôles monocolores.
   18. Centrifugez les échantillons, les contrôles FMO et les contrôles monocolores à 300-400 x g pendant 3-5 min à 4 °C.
   19. Jetez le surnageant de tous les tubes centrifugés. Remettre en suspension les échantillons et les contrôles FMO dans 250 μL de tampon FACS et de vortex pendant 10 s.
   20. Remettez en suspension les commandes monocolores dans 250 μL de PBS2. Ajouter 1 goutte de billes d’amine non réactives au contrôle de la viabilité fixable UV du colorant monocolore uniquement. Vortex toutes les commandes pendant 10 s.
   21. Les cellules sont maintenant prêtes à être triées. Conservez les échantillons, les contrôles FMO et les contrôles monocolores sur la glace dans l’obscurité chaque fois que possible pour améliorer la viabilité des cellules et prévenir la perte de signal due au photoblanchiment.

4. Co-culture d’organoïdes de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

REMARQUE: Cette section décrit la co-culture d’ILC1 de l’intestin grêle murin trié (isolé selon le protocole de la rubrique 3) avec des organoïdes murins de l’intestin grêle (décrits aux rubriques 1 et 2). Les organoïdes doivent être utilisés de manière optimale 1 à 2 jours après le passage. La co-culture consiste à prélever les organoïdes, à ajouter le nombre approprié d’ILC1, à les centrifuger pour assembler les organoïdes de granulés et l’ILC1 et à les réutiliser dans TBEM. Complétez cette section dès que possible une fois que l’ILC1 a été isolée. Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux stériles et de réactifs.

1. Assurez-vous que TBEM de l’étape 3.1.1 a été décongelé.
2. Prélevez des organoïdes âgés de 1 à 2 jours comme décrit aux étapes 2.3 et 2.4.
3. Remettre en suspension la pastille organoïde dans 1 mL de DMEM/F12 avancé froid et glacé. Ne pliez pas la pointe p1000 comme cela a été fait lors du passage des organoïdes, car l’intention ici est de maintenir la structure organoïde pour la co-culture. Si nécessaire, placer les organoïdes dans des tubes séparés de 1,5 mL revêtus de PBS2 sur de la glace pendant une courte période pour être répartis entre différentes conditions de co-culture.
   REMARQUE: Ne commencez la préparation des organoïdes qu’une fois que les échantillons d’ILC sont prêts pour la co-culture; travailler sur la glace et rapidement dès que les organoïdes ont été prélevés pour minimiser la mort des cellules épithéliales.
4. Pré-enduire un tube de 1,5 mL avec PBS2 par échantillon répliqué ILC. Répartir ~100-200 organoïdes (environ 1 puits d’une plaque de 24 puits) dans chaque tube.
5. Pré-enduire une pointe p1000 en PBS2 et l’utiliser pour évaluer le volume d’ILC1 après purification FACS (250-300 μL + volume trié). Déterminer la concentration d’ILC1 par mL en utilisant le nombre de cellules enregistrées à partir du tri et déterminer le volume requis.
6. En utilisant la même pointe p1000 revêtue de PBS2, ajoutez pas moins de 500 ILC1 au tube de 1,5 mL revêtu de PBS2 contenant les organoïdes. Si le nombre d’ILC1 produits par le tri est inférieur à 500, ajoutez l’organoïde directement au tube contenant le tri d’origine pour minimiser la perte de cellules du transfert.
7. Faire tourner l’ILC1 et les organoïdes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Si possible, évitez les centrifugeuses de table de petit diamètre, car elles regrouperont les cellules le long du bord de l’intérieur du tube au lieu de créer une pastille à l’extrémité du tube. Étant donné que le nombre de cellules est très faible, il est impératif de minimiser la perte de cellules au cours de ces étapes.
8. Retirez lentement et doucement la plus grande partie possible du surnageant sans perturber la pastille (qui peut ne pas être visible à l’œil, en particulier dans les contrôles sans ILC organoïde uniquement). Placez l’échantillon sur de la glace.
9. Remettre en suspension la pastille froide dans 30 μL par puits de TBEM. Tout en maintenant le tube sur une surface froide (p. ex., une petite boîte de glace placée dans la hotte de culture tissulaire), mélangez les organoïdes et l’ILC au moins 10 à 15 fois pour assurer une distribution uniforme. Triturez fréquemment mais doucement, pour éviter d’endommager les organoïdes et la formation de bulles.
10. Appliquer 30 μL par puits d’ilc-organoïdes dans TBEM sur une plaque préchauffée de 24 ou 48 puits pour former un seul dôme. Placez directement la plaque dans l’incubateur (37 °C et 5% de CO₂) pendant 10-20 min.
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de mettre en place des contrôles DE L’ILC uniquement et des contrôles organoïdes uniquement pour l’analyse en aval. Les ILC1 sont rares, mais les ^GFP-ILC2 peuvent être substitués à l’immunofluorescence ou aux contrôles de cytométrie en flux FSC/SSC lorsque cela est scientifiquement approprié.
11. Ajouter 550 μL (par puits) de milieu ILC1 complet (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoéthanol; voir tableau 1) avec les cytokines expérimentales ou les anticorps bloquants souhaités et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
12. Après 24 h, retirez doucement la plaque de l’incubateur et laissez la plaque reposer dans une hotte de culture tissulaire pendant 1 min pour s’assurer que les lymphocytes sont déposés.
13. Retirez 200 à 250 μL de média et placez-le dans un puits vide d’une plaque de 24 puits. Vérifiez ce surnageant avec un microscope inversé pour vous assurer qu’aucun lymphocyte n’a été enlevé.
    1. Si le surnageant est clair, ajouter 300 μL de milieu ILC1 frais à la co-culture dans le puits d’origine. Si des lymphocytes sont présents dans le surnageant, centrifuger à 300-400 x g pendant 3-5 min à 4 °C et remettre en suspension dans 300 μL de milieu ILC1 frais et ajouter ceci aux 200-250 μL restants de milieu dans le puits d’origine. Assurez-vous de reconstituer le média tous les 1-2 jours ou lorsque le média devient orange pâle/jaune.
       REMARQUE: Ne laissez pas le support s’évaporer suffisamment pour que l’extrémité du dôme de la matrice brise la surface du support. Assurez-vous toujours que la matrice est complètement immergée. L’évaporation excessive peut être évitée en utilisant des puits centraux dans les plaques de culture tissulaire et en ajoutant environ 600 μL de PBS aux puits environnants. Les co-cultures avec l’ILC adulte sont stables pendant 1 à 4 jours, après quoi les organoïdes qui ont été ensemencés sans perturbation majeure se rompront et se réensemenceront en tant que nouvelles cryptes. Lors de l’analyse de l’épithélium, il est recommandé d’analyser les cultures dans les 1 à 4 jours suivant l’établissement des co-cultures.
    2. Effectuer une analyse en aval à l’aide de l’immunofluorescence, de la cytométrie en flux ou de la purification FACS des populations cibles dans un tampon de lyse pour l’analyse de l’expression génique par séquençage d’ARN unicellulaire ou en vrac ou RT-qPCR, comme décrit à la référence⁸.

Une fois terminées avec succès, les cryptes fraîchement isolées devraient former des structures de crypte naissantes dans les 2 à 4 jours (Figure 1A). Les cultures organoïdes saines et robustes doivent être en croissance active et peuvent être passées et étendues comme détaillé dans le protocole.

Ce protocole décrit l’isolement de l’ILC1 de l’intestin grêle de la lignée transgénique transgénique murine RORγtGFP , ce qui permet l’isolement de l’ILC1 vivante par FACS (Figure 2). En utilisant le protocole décrit ici, la plage de comptage d’ILC1 attendue est de 350 à 3 500 cellules isolées.

Après avoir été ensemencées avec des organoïdes, les co-cultures peuvent être visualisées par immunocytochimie (Figure 3A-B). Les ILC et les cellules épithéliales peuvent également être analysés par cytométrie en flux, comme le montre la figure 3C. L’ILC1 régule à la hausse le CD44 épithélial, caractérisé par cytométrie en flux (figure 4A-B) et immunocytochimie (figure 4C). Plus précisément, l’ILC1 induit l’expression de la variante d’épissure CD44 v6 chez les organoïdes, comme le démontre la RT-qPCR (Figure 4D).

Tableau 1 : Compositions des supports et des tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Contrôles monocolores. Composition de témoins monocolores pour isoler la lamina propria ILC1 de l’intestin grêle à l’aide de la stratégie de contrôle définie à la figure 2. Les détails des anticorps utilisés se trouvent dans la Table des matériaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Mélanges maîtres de fluorescence moins un (FMO). Composition de mastermix fMO pour Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO et NK1.1 FMO. Les mastermix fMO contiennent tous les anticorps utilisés à l’exception de l’anticorps d’intérêt et sont utilisés pour colorer une aliquote d’échantillon. Le cocktail de lignée est défini comme CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Les détails des anticorps utilisés se trouvent dans la Table des matériaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Mastermix de coloration extracellulaire. Les concentrations sont ajustées pour colorer jusqu’à 5 x 106 cellules dans 200 μL de tampon FACS. Les détails des anticorps utilisés se trouvent dans la Table des matériaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1 : Organoïdes murins de l’intestin grêle. Image représentative de (A) organoïdes de l’intestin grêle générés avec succès 2-3 jours après le passage et (B) culture infructueuse. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Stratégie de contrôle pour isoler les ILC1 de la lamina propria de l’intestin grêle des souris rapporteures transgéniques RORγtGFP. Diagramme cytométrique en flux représentatif de l’isolement de l’ILC1 à partir de la lamina propria de l’intestin grêle des souris transgéniques RORγtGFP par FACS. Les ILC1 sont définis comme live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ et NK1.1+. Représentant de N = >50 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Co-cultures organoïdes et ILC1. Images en champ clair (A), images de microscopie confocale (B) et diagrammes FACS (C) d’organoïdes de l’intestin grêle (SIO) cultivés seuls (en haut) ou avec des ILC1 (en bas) (représentatifs des expériences avec des ILC1 de N = 3 souris). (B) La coloration avec CD45 illustre les ILC1 et la protéine Zonula occludens 1 (ZO-1) marque les cellules épithéliales dans les organoïdes. Barres d’échelle: 50 μm. (C) Précédemment fermées sur des cellules vivantes simples. La molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM) marque les cellules épithéliales intestinales (CEI) dans les organoïdes et CD45 marque les ILC1. La figure est adaptée de la référence8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les ILC1 en co-culture avec des organoïdes de l’intestin grêle entraînent une régulation à la hausse des CD44 dans les cellules épithéliales intestinales. (A) Un diagramme cytométrique représentatif de l’expression de CD44 dans les cellules épithéliales positives de la molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM) (vivantes, CD45-, EpCAM+) provenant d’organoïdes de l’intestin grêle (SIO) cultivés seuls (à gauche) ou avec des ILC1 pendant 4 jours (à droite). (B) Quantification du débit de l’expression de CD44 dans les cellules épithéliales intestinales (CEI) (ILC1 de N = 5 souris). (C) Image représentative en microscopie confocale de la localisation de CD44 dans d4 SIO seul (à gauche) ou en co-culture avec des ILC1 (à droite) (représentant de N = 3 souris). Barres d’échelle : 50 μm. (D) RT-qPCR avec amorces spécifiques à l’exon pour les variantes d’épissure CD44 v4 et v6 (N = 3). Ce chiffre est adapté de la référence8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.