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Article de méthode

Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés

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DOI :

10.3791/63570

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2 mai 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Illinois Wesleyan University, 2Department of Biosciences, Rice University

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Les cornées régénérantes ou entièrement restaurées peuvent être analysées pour leur potentiel de régénération à l’aide de diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.

Résumé

Les plaies cornéennes embryonnaires de poussins présentent une capacité remarquable à se régénérer complètement et rapidement, tandis que les cornées blessées adultes subissent une perte de transparence due à des cicatrices fibrotiques. L’intégrité tissulaire des cornées embryonnaires blessées est intrinsèquement restaurée sans formation de cicatrice détectable. Compte tenu de son accessibilité et de sa facilité de manipulation, l’embryon de poussin est un modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes sans cicatrice. Ce protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire en ovo. Tout d’abord, les œufs sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour accéder à l’œil. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil jusqu’aux stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées. Troisièmement, les plaies cornéennes linéaires qui pénètrent dans la couche épithéliale externe et le stroma antérieur sont fabriquées à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure. Les études à ce jour utilisant ce modèle ont révélé que les cornées embryonnaires blessées présentent une activation de la différenciation kératocytaire, subissent un remodelage coordonné des protéines ECM à leur macrostructure tridimensionnelle native et sont réintricées de manière adéquate par les nerfs sensoriels cornéens. À l’avenir, l’impact potentiel des facteurs endogènes ou exogènes sur le processus de régénération pourrait être analysé dans la guérison des cornées en utilisant des techniques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus, l’électroporation, l’infection rétrovirale ou l’implantation de billes. La stratégie actuelle identifie le poussin embryonnaire comme un paradigme expérimental crucial pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires coordonnant la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.

Introduction

La cornée est le tissu transparent et le plus externe de l’œil qui transmet et réfracte la lumière propice à l’acuité visuelle. Dans la cornée adulte, des dommages ou une infection du stroma cornéen entraînent une réponse rapide et robuste à la cicatrisation des plaies caractérisée par une prolifération kératocytaire, une fibrose, une inflammation accrue conduisant à une apoptose induite par les cytokines, la génération de myofibroblastes réparateurs et un remodelage global de la matrice extracellulaire (ECM)1,2 . Après une blessure, une telle réparation du tissu cornéen entraîne un tissu cicatriciel opaque qui réduit la transparence cornéenne et obstrue le passage de la lumière, déformant ainsi la vision et, dans les cas les plus graves, conduisant à la cécité cornéenne3. Ainsi, il est clairement nécessaire de développer des modèles animaux fiables pour aborder les complexités de la cicatrisation des plaies et identifier les facteurs cellulaires et moléculaires responsables de la fermeture des plaies et de la régénération des tissus.

À ce jour, la plupart des études portant sur la cicatrisation des plaies cornéennes ont utilisédes modèles animaux postnatals 4 ou adultes 1,2,5,6,7. Bien que ces études aient conduit à une avancée significative dans la compréhension de la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes et des mécanismes sous-jacents à la formation de cicatrices, les tissus cornéens endommagés dans ces modèles de guérison ne parviennent pas à se régénérer complètement, limitant ainsi leur utilité pour identifier les facteurs moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de la récapitulation complète de la morphologie et de la structure de la cornée après une blessure. En revanche, les plaies fœtales générées avec un couteau dans la cornée embryonnaire du poussin possèdent une capacité intrinsèque à guérir complètement de manière sans cicatrice8. Plus précisément, la cornée embryonnaire du poussin présente une régénération non fibrotique avec la récapitulation complète de la structure de la matrice extracellulaire et des modèles d’innervation 8,9.

Le présent protocole décrit une séquence d’étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Tout d’abord, les ovules sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour faciliter l’accès à l’embryon. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil à des stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées et où la blessure est souhaitée. Troisièmement, les incisions linéaires de la cornée centrale pénétrant à travers l’épithélium cornéen et dans le stroma antérieur sont faites à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.

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Protocole

La souche d’œufs utilisée dans ce protocole était White Leghorn, et toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Illinois Wesleyan University.

1. Incubation des œufs de poussins

  1. Gardez les œufs à ~10 °C jusqu’à 1 semaine après leur ponte pour arrêter le développement. Lorsque vous êtes prêt à lancer le développement de l’embryon de poussin, essuyez toute la coquille d’œuf avec des lingettes non pelucheuses (voir tableau des matériaux) saturées d’eau à température ambiante pour éliminer la saleté et les débris.
  2. Assurez-vous que la coquille d’œuf est désinfectée. Essuyez toute la surface de l’œuf avec des lingettes non pelucheuses humidifiées avec 70% d’éthanol. Essuyez rapidement l’éthanol pour sécher l’œuf et éviter l’absorption de l’éthanol par la coquille de l’œuf jusqu’à l’embryon.
  3. Disposer les œufs horizontalement sur un plateau. Marquez le haut de l’œuf pour indiquer la position attendue de l’embryon. Incuber les œufs horizontalement, avec la fonction de bascule activée, dans un incubateur humidifié à 38 °C.

2. Fenêtrer les œufs pour se préparer à la dissection de la membrane

  1. Retirer les œufs de l’incubateur le troisième jour du développement embryonnaire (E3). Stériliser le dessus des œufs avec des lingettes non pelucheuses humidifiées avec 70% d’éthanol. Séchez l’éthanol des surfaces de la coquille d’œuf.
    REMARQUE: Pour s’assurer que le développement n’a pas été retardé pendant la procédure de fenêtrage, 6 à 12 œufs ont été retirés et la procédure a été rapidement effectuée sur ceux-ci pendant que les œufs restants étaient laissés dans l’incubateur.
  2. Placez un œuf horizontalement dans un porte-œufs sécurisé (voir Table des matières). En utilisant l’extrémité tranchante des ciseaux de dissection, créez un petit trou dans le haut de la coquille d’œuf près de l’extrémité pointue de l’œuf.
    REMARQUE: Ce trou facilitera l’élimination de l’albumen, ce qui est nécessaire pour faire tomber le jaune et l’embryon loin de la surface interne de la coquille d’œuf. Pour les porte-œufs, des plateaux de remplissage d’œufs en pâte à papier, dans lesquels les œufs sont expédiés, ont été utilisés.
  3. À travers le trou (étape 2.2.), insérez une aiguille hypodermique biseautée de 18 G. Avec l’aiguille poussée vers la surface interne inférieure de l’œuf et le côté biseauté de l’aiguille face à l’extrémité pointue de l’œuf (par exemple, loin de l’emplacement prévu du jaune et de l’embryon près du milieu de l’œuf), retirez 2 à 3 ml d’albumine de l’œuf de poule et jetez-le.
    REMARQUE: Si l’aiguille entaille l’embryon ou son système vasculaire associé au cours de cette étape, il en résultera une aspiration du sang avec l’albumen. Cela entraînera la mort de l’embryon. De plus, si le jaune est aspiré par inadvertance avec l’albumen au cours de cette étape, l’embryon ne sera pas viable. Dans les deux cas, l’ovule doit être jeté si l’embryon ne peut pas être immédiatement utilisé à d’autres fins.
  4. Nettoyez la surface de la coquille d’œuf entourant le trou avec des lingettes non pelucheuses légèrement humidifiées avec de l’éthanol à 70% et essuyez-les. Scellez le trou fait pour enlever l’albumen avec du ruban adhésif transparent.
  5. Avec l’extrémité tranchante des ciseaux de dissection, faites un deuxième trou de « fenêtre » dans le haut de la coquille d’œuf sur le site de marquage (étape 1.3.). Assurez-vous que les ciseaux ne s’étendent pas trop loin dans la coquille de l’œuf pour éviter de contacter et d’endommager l’embryon ou le système vasculaire embryonnaire, qui sera souvent positionné dans l’œuf directement sous le site du deuxième trou.
  6. À l’aide de pinces à iris incurvées, élargissez le trou de la « fenêtre » pour s’étendre sur environ 2 à 3 cm de diamètre et servir de « fenêtre » à l’embryon en développement sous la coquille.
    1. Insérez une extrémité de la pince dans le trou, en la gardant parallèle et étroitement juxtaposée à la coquille d’œuf. Avec l’autre extrémité de la pince positionnée à l’extérieur de la coquille d’œuf, pincez soigneusement les deux extrémités de la pince ensemble, ce qui leur permet de se briser et d’enlever de petits morceaux de la coquille d’œuf. Continuez à casser et à retirer les fragments de coquille d’œuf jusqu’à ce qu’il reste une fenêtre de 2 à 3 cm qui recouvre directement l’embryon.
      REMARQUE: Oeufs dans lesquels les embryons ne pondent pas directement sous le trou fait à l’étape 2.6. ne doit pas être utilisé car les dissections membranaires à venir seraient difficiles à réaliser. Même en berçant les œufs horizontalement, environ 10% des œufs sont inutilisables en raison du mauvais positionnement de l’embryon. Ces embryons peuvent être utilisés à d’autres fins.
  7. Pour limiter la contamination bactérienne, ajouter par le trou de la fenêtre (par exemple, dans l’œuf) ~ 100-200 μL de solution de Ringer (8 g de NaCl, 0,37 g de KCl et 0,23 g de CaCl2,2H 20 par L de H20 distillé) contenant des antibiotiques à base de pénicilline/streptomycine (50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine, voir Tableau des matériaux).
  8. Scellez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent. Effectuez le scellement des œufs en alignant un coin du ruban sur le long axe du trou et en pressant le ruban sur la coquille à environ 1-2 cm du bord du trou.
    1. Continuez à sceller autour de l’ouverture jusqu’à ce qu’un rabat de ruban adhésif suspendu soit laissé d’un côté. Pressez les deux morceaux de ruban adhésif ensemble, créant une forme de dôme sur le trou, et appuyez sur le rabat de ruban adhésif trop suspendu à la coquille pour finir de sceller l’œuf.
      REMARQUE: Les œufs doivent être fenêtrés à E2 ou E3. Selon l’expérience, le fenêtrage avant E2 entraîne une faible viabilité embryonnaire. De plus, par E4, l’embryon et les membranes extraembryonnaires se fixent à la coquille d’œuf10, et toute tentative de fenêtre à E4 ou plus tard entraîne souvent des dommages embryonnaires ou une déchirure des vaisseaux sanguins extraembryonnaires, l’un ou l’autre événement conduisant à l’issue de la mort de l’embryon.
  9. Retournez les œufs « fenêtrés » à l’incubateur pour un développement ultérieur. Assurez-vous de garder les œufs horizontaux et de désactiver la fonction de bascule de l’incubateur.
  10. Répétez les étapes 2.2.-2.9. pour chaque œuf.

3. Microdissections des membranes extraembryonnaires

  1. Retirez un œuf fenêtré E5.5 de l’incubateur. Exposez l’embryon en coupant le ruban adhésif de la fenêtre avec des ciseaux à dissection stérilisés.
  2. Utilisez un microscope à dissection pour observer l’embryon et ses membranes extraembryonnaires à travers la fenêtre. Si nécessaire, utilisez des ciseaux ou des pinces à iris incurvées pour élargir la fenêtre afin que l’embryon soit bien positionné sous la fenêtre, en prenant soin de ne pas endommager le système vasculaire embryonnaire.
    1. Ajouter deux gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
  3. Utilisez un microscope à dissection pour vous assurer que l’embryon est au bon stade de développement (hamburger Hamilton stade 27, ~ E5.5)11,12 et localiser les positions de la membrane amniochorionique (ACM) et de la membrane chorioallantoïque (CAM).
    REMARQUE: À ce stade, l’embryon est entouré par l’ACM, qui comprend la membrane amniotique et la membrane chorionique sus-jacente fusionnée et partiellement recouverte par l’allantoïde hautement vascularisé, qui s’étend de la région intestinale de l’embryon et fusionne avec le chorion superposé pour former le CAM11,12. L’ACM n’est pas fortement vascularisé, ce qui permet de disséquer ces membranes pour exposer l’embryon sans endommager les vaisseaux sanguins et nuire à l’embryon.
  4. Effectuer des dissections membranaires extraembryonnaires à ce stade (E5.5).
    REMARQUE: E5.5 est le moment idéal pour effectuer les dissections de membrane extraembryonnaire. La dissection des membranes plus tôt (p. ex., à E4) avant la formation de la CAM réduit l’accessibilité de l’embryon aux stadesultérieurs 11. De plus, à E5.5, l’embryon n’est que partiellement couvert par la CAM hautement vascularisée, mais au cours des 1-2 jours suivants, la CAM enveloppe rapidement et empêche tout accès ultérieur à l’embryon11,12. Pour cette raison, la dissection membranaire à E6 ou plus tard est difficile car le risque de déchirure des vaisseaux sanguins augmente.
    1. Utilisez une paire de pinces fines stérilisées pour saisir doucement l’ACM et l’éloigner de l’embryon. Utilisez ensuite des ciseaux à micro-dissection stérilisés pour percer un trou dans l’ACM directement au-dessus du membre antérieur qui s’étend de la membrane recouvrant le membre antérieur à la membrane recouvrant la tête.
      REMARQUE: Cette étape détend les membranes chorion et amnion, les rendant ainsi plus faciles à saisir et à disséquer davantage avec des pinces dans les étapes suivantes. Voir la figure 1 pour un schéma utile de la façon dont les membranes sont disséquées à travers la fenêtre de la coquille d’œuf.
  5. Utilisez deux paires de pinces fines et stériles pour saisir doucement l’amnion dans deux positions adjacentes entre l’ACM et le CAM (par exemple, une zone entre la coupe faite au-dessus du membre antérieur et le bord le plus proche du CAM).
    1. Déplacez soigneusement chaque paire de pinces, les deux saisissant fermement la membrane amniotique, loin l’une de l’autre, l’une se déplaçant dorsalement vers l’embryon et l’autre ventralement.
      REMARQUE: Ce mouvement sert à déchirer davantage l’amnion tout en séparant l’ACM (qui est tiré dans la direction dorsale par rapport à l’embryon par une paire de pinces) et le CAM (qui est tiré dans la direction ventrale par rapport à l’embryon par l’autre paire de forceps).
    2. Assurez-vous que les membranes sont séparées lorsque le CAM ne recouvre plus l’embryon et que l’artère et la veine allantoïques, qui émanent de l’intestin embryonnaire au CAM, sont facilement apparentes.
  6. Utilisez des pinces fines stérilisées pour disséquer et retirer toute membrane d’amnion restante recouvrant l’embryon. On observe le plus souvent que l’amnion restant couvrira partiellement la moitié caudale de l’embryon.
    1. À l’aide d’une pince stérilisée, saisissez l’amnion près de la région mi-crânienne de l’embryon et tirez soigneusement l’amnion dans une direction caudale par rapport à l’embryon vers la CAM déplacée antérieurement. L’embryon sera maintenant complètement exposé et la croissance ultérieure du CAM se produira principalement loin de l’embryon en développement.
      REMARQUE : Voir la figure 1 pour un schéma utile sur la façon dont l’embryon exposé apparaîtra après la dissection de la membrane. Reportez-vous également à un rapport11 publié précédemment pour obtenir des diagrammes schématiques utiles des étapes 3.3.-3.6.
  7. Ajouter quelques gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
  8. Refermez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent, comme décrit à l’étape 2.8. Retournez l’œuf dans l’incubateur pour un développement ultérieur, en gardant l’œuf horizontal et en maintenant la fonction de bascule de l’incubateur inactivée.
  9. Répétez les étapes 3.1.-3.8. pour chaque œuf.
    REMARQUE: Les dissections de membrane extraembryonnaire à E5.5 décrites ci-dessus permettront l’accès à l’embryon par E7, c’est-à-dire lorsque la blessure peut être effectuée 8,9. À l’E8, la croissance continue du tissu CAM commence à couvrir la région crânienne de l’embryon, empêchant ainsi un accès ultérieur à la cornée. Si l’on souhaite effectuer des plaies dans des cornées E8-E9 plus âgées, il est possible de repositionner le CAM en croissance par rapport à l’embryon (étape 3.10.). Si l’on souhaite blesser à E7, étape 3.10. n’est pas nécessaire à effectuer et on peut passer à l’étape 4, plaie cornéenne.
  10. Retirer un œuf E7 de l’incubateur dont les membranes extraembryonnaires ont été précédemment disséquées à E5.5 (étapes 3.1.-3.8.). Saisissez avec des pinces stérilisées tous les tissus membranaires amnion disponibles fusionnés au CAM et éloignez doucement la membrane amnion de la région crânienne de l’embryon dans une direction ventrale par rapport à l’embryon.
    REMARQUE: Étant donné que la membrane amnionique déplacée loin de l’embryon est fusionnée au CAM, le CAM en croissance et hautement vascularisé suivra la pince à amnion et s’éloignera de la région crânienne. Répétez cette étape quotidiennement pour déplacer continuellement le CAM loin de l’embryon jusqu’à ce que l’embryon soit à l’âge souhaité pour la blessure.

4. Blessure cornéenne

  1. Obtenez un ovule de l’incubateur pour la blessure à l’âge embryonnaire souhaité, E7-E9. Exposez l’embryon en coupant le ruban adhésif de la fenêtre avec des ciseaux à dissection stérilisés. Ajouter quelques gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
  2. Utilisez un couteau à micro-dissection pour faire une incision qui couvre l’étendue de la cornée de l’œil droit (en raison de la façon dont l’embryon pond dans l’œuf, l’œil gauche n’est pas accessible mais peut servir de contrôle non blessé), qui est parallèle et en ligne avec la fissure choroïde (Figure 1). La première coupe traversera l’épithélium cornéen.
    1. Utilisez le couteau à micro-dissection pour lacérer à nouveau la cornée au même endroit que la première incision 2x plus (par exemple, trois coupes au total, avec la coupe 2 et la coupe 3 se produisant avec la même position dans la cornée que la coupe 1)11. La deuxième lacération traversera la membrane basale et la troisième pénétrera dans le stroma antérieur.
      REMARQUE: Si l’embryon s’est installé sous le CAM disséqué, on peut utiliser une pince à iris incurvée stérilisée pour déplacer soigneusement la tête sous le CAM. Placez les pinces à iris incurvées sous la tête, en entrant en contact avec le côté gauche de la tête. Bercez toute la tête sur des pinces à iris incurvées fermées et soulevez doucement la tête autour et au-dessus du CAM. Pour aider à la viabilité, utilisez une technique similaire avec les pinces à iris incurvées pour recoller l’embryon sous le CAM après la chirurgie afin de favoriser la bonne croissance du CAM.
  3. Ajouter 3-4 gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
  4. Refermez le trou de la fenêtre avec du ruban adhésif transparent et retournez à l’incubateur, en laissant l’œuf à l’horizontale. Laissez l’embryon se développer et la plaie cornéenne guérir pendant la période souhaitée (par exemple, 0,5 à 11 jours), puis euthanasiez l’embryon sans cruauté par décapitation.
  5. Utilisez des pinces à iris incurvées pour prélever l’œil d’un embryon euthanasié flottant dans une boîte de Pétri de la solution saline de Ringer en saisissant doucement l’œil sur son côté postérieur, où l’œil et le tissu facial se rencontrent, et en soulevant soigneusement tout l’œil loin et libre du tissu facial.
    1. Utilisez une pince fine pour percer un petit trou (3-5 cm) à l’arrière de l’œil entier et fixez tout l’œil dans du paraformaldéhyde à 4% à 4 ° C pendant la nuit avec une légère agitation.

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Résultats

À la suite de la dissection antérieure de l’ACM et du CAM à E5.5 pour exposer la région crânienne de l’embryon en développement, une série de lacérations qui couvraient la cornée centrale E7 a été faite en ovo (Figure 1). Une plaie idéale pour étudier la régénération de la cornée se produit après trois lacérations, chacune faite au même endroit de la cornée. La première lacération traverse l’épithélium cornéen, tandis que les deuxième et troisième lacérations pénètrent respectivemen...

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Discussion

Le poussin est un système modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes fœtales et sans cicatrice. Contrairement aux mammifères, le poussin est facilement accessible tout au long du développement en utilisant les stratégies in ovo8 ou ex ovo 24. La cornée embryonnaire du poussin est beaucoup plus grande que les cornées de rongeurs, avec près de 50% du volume crânien dédié à l’œil25, ce qui la rend très sensible aux m...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents concernant les informations présentées dans ce manuscrit.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de développement artistique et savant de l’Illinois Wesleyan University à TS et financé en partie par NIH-R01EY022158 (PL).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille hypodermique de 18 gFisher Scientific14-826-5D
Couteau de microdissection à 30 degrésFine Science Tools10056-12
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Sondes moléculairesD1306
Seringue de 5 mLFisher Scientific14-829-45
Anticorpssecondaires marqués au fluor AlexaSondes
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2-H20)SigmaC8106
Plateaux à œufs de pouleGQFO246
Pince à dissectionner, pointe fine, denteléeVWR82027-408
Ciseaux à dissectionner, pointe acéréeVWR82027-578
Iris 1 x 2 Dents Tissu Pince courbéeVWR100494-908
Ciseaux de microdissectionVWR 470315-228
Anti-fibronectine de souris (IgG1)Etudes de développement Banque d’hybridomesB3/D6
Anti-laminine de souris (IgG1)Etudes de développement Banque d’hybridomes3H11
Protéine bêta-tubuline spécifique aux antineurones de souris (Tuj1, IgG2a)Biolegend801213
Anti-ténascine de souris (IgG1)Etudes développementales Banque d’hybridomesM1-B4
ParaformaldéhydeSigma158127
Pénicilline/StreptomycineSigmaP4333
Chlorure de potassium (KCl)SigmaP5405
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ScientificBP358
Sportsman 1502 incubateur d’œufsGQF1502
Déchirable à la main (largeur 1,88 pouce)Scotchn/a
moléculaires Kimwipes Sigma Z188956

Références

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Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés
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