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Article de méthode

Mesure de la migration et de la formation du biofilm de diverses bactéries

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DOI :

10.3791/63595

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2 mai 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 2Desa Mahkota Form Six College, Ministry of Education Malaysia, 3Department of Critical Care Medicine, The Second Affiliated Hospital School of Medicine, Southern University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode pratique pour l’isolement et l’identification des micro-organismes au sein de l’hôte. De cette façon, les propriétés physicochimiques des micro-organismes et les modes de vie possibles chez l’hôte sont clairement décrits.

Résumé

Comme les microbes qui se développent dans le corps de l’hôte ont principalement des capacités d’adaptation qui facilitent leur survie, les méthodes de classification et d’identification de leur nature seraient bénéfiques pour faciliter leur caractérisation. À l’heure actuelle, la plupart des études ne se concentrent que sur une méthode de caractérisation spécifique ; Cependant, l’isolement et l’identification des microorganismes de l’hôte sont un processus continu qui nécessite généralement plusieurs méthodes de caractérisation combinatoire. Dans cet article, nous décrivons des méthodes permettant d’identifier la capacité de formation de biofilms microbiens, l’état de respiration microbienne et leur comportement en chimiotaxie. Les méthodes sont utilisées pour identifier cinq microbes, dont trois ont été isolés dans le tissu osseux de rats Sprague-Dawley (SD) (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus et Enterococcus faecalis) et deux de l’American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Enterococcus faecalis V583. Les microbes isolés du tissu osseux du rat SD comprennent les microbes à Gram positif. Ces microbes se sont adaptés pour prospérer dans des environnements stressants et limitant les nutriments au sein de la matrice osseuse. Cet article vise à fournir aux lecteurs le savoir-faire spécifique nécessaire pour déterminer la nature et le comportement des microbes isolés en laboratoire.

Introduction

L’hôte mammifère représenté par le corps humain contient un grand nombre de micro-organismes. Ces micro-organismes sont largement distribués dans la bouche, le tube digestif, l’intestin et le sang de l’hôte et ont des effets différents sur la santé de l’hôte. La cavité buccale est l’hôte d’une pléthore de microbes qui peuvent moduler la susceptibilité de l’hôte aux infections. Des microbes tels que les streptocoques (p. ex., S. mitis/oralis, S. pseudopneumoniae et S. infantis) et Prevotella spp. colonisent la cavité buccale, formant un biofilm multi-espèces à la surface de la langue, provoquant une mauvaise haleine et fonctionnant comme un réservoir microbien pour les infections microbiennes. Ces agents pathogènes peuvent infecter l’os de la mâchoire en infiltrant les ligaments parodontaux qui maintiennent la racine de la dent dans l’os de la mâchoire1. La caractérisation de ces microbes isolés du corps de l’hôte est souvent un processus fastidieux, en particulier lorsque les microbes présentent des traits individuels nécessitant un traitement et des conditions de croissance spécifiques. Les microbes, tels que les pathogènes Helicobacter pylori, Clostridium difficile et Fusobacterium nucleatum, se développent dans l’environnement hostile de l’intestin, avec des besoins spécifiques en oxygène, en nutriments et en croissance, ce qui présente un défi dans les processus de caractérisation, en particulier dans l’étude de la pathogénicité de ces microbes. Par conséquent, une méthode standardisée d’isolement et d’étude de ces micro-organismes est nécessaire pour que les scientifiques et les praticiens puissent développer de nouveaux traitements médicaux.

Ce protocole utilise des microbes qui se développent dans la matrice osseuse des rats. Traditionnellement, à l’exception du système osseux représenté par la mâchoire, où la présence de dents rend la matrice osseuse plus sensible aux infections que les autres os1, on croit généralement que l’os sain de l’hôte est un environnement stérile. Cependant, des études ont montré que les micro-organismes pénètrent dans la circulation systémique à travers la paroi intestinale, affectant finalement la minéralisation osseuse2. À titre de preuve de concept, nous utilisons le protocole décrit pour caractériser les propriétés biochimiques d’isolats microbiens provenant du fémur et du tibia de rats SD sains (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. et Enterococcus faecalis). Ces isolats microbiens ont été sélectionnés car l’os est un environnement fermé et hypoxique, et la caractérisation de ces microbes à partir de l’os peut être une tâche difficile. Divers articles ont détaillé les processus utilisés dans l’étude de ces microbes ; Cependant, il existe peu de protocoles complets permettant d’identifier les microorganismes isolés par l’hôte.

Pour établir les conditions de culture appropriées, les besoins en oxygène du microbe doivent être compris via l’utilisation d’un milieu de thioglycolate fluide (FTM). Les microbes ayant des besoins différents en oxygène forment des couches stratifiées dans le liquide FTM clair3. Sur la base du profil de stratification, les besoins en oxygène du microbe sont ensuite utilisés pour étudier la croissance des cellules. Les microbes qui se développent à la surface du liquide FTM sont des aérobies obligatoires, tandis que les microbes qui se développent au fond sont des anaérobies obligatoires. Les microbes qui se développent en suspension dans le liquide FTM sont des anaérobies facultatifs ou aérotolérants. Le taux de croissance microbienne est établi en observant la phase de croissance exponentielle des cellules microbiennes. Le profil de croissance est ensuite comparé à la formation du biofilm du microbe. Les biofilms sont en grande partie composés de plusieurs espèces qui affectent directement et indirectement la santé des autres. Au cours de ce processus, les interactions bénéfiques entre les communautés microbiennes sélectionnent l’attachement, fournissant une structure spatiale qui favorise l’évolution des interactions réciproques actives. Par exemple, la co-culture de Paenibacillus amylolyticus et de Xanthomonas retroflexus présente des interactions symbiotiques facultatives dans un environnement statique, favorisant la croissance rapide du biofilm13. Les microbes s’adaptent aux tissus de l’hôte via la formation de biofilms pour une localisation durable, se protégeant contre les environnements difficiles et échappant au système immunitaire de l’hôte 4,5,6,7. Les biofilms sont généralement des structures denses et multicouches qui aident les micro-organismes à résister aux stimuli sous-critiques externes ; par exemple, E. faecalis dans la pulpe dentaire augmente sa résistance aux antibiotiques en augmentant la formation de biofilm lorsqu’il est confronté à des sous-concentrations de tétracycline et de vancomycine8.

La chimiotaxie permet aux micro-organismes de se déplacer en fonction de gradients chimiques, et les voies de signalisation sont largement distribuées dans une variété de bactéries pathogènes. Certains micro-organismes pathogènes migrent vers des sites spécifiques, sous la direction de signaux chimiques, pour provoquer des maladies infectieuses14. Par exemple, Xanthomonas spp. expriment 19 chimiorécepteurs et 11 flagellines dans l’hôte, déclenchant la liaison bactérienne et, finalement, l’ulcération15. Il existe également des protéines spécifiques dans les bactéries (protéines de liaison à la pectine) qui guident la migration spécifique des bactéries vers les nutriments, ce qui peut conduire à une meilleure croissance16. Ceci est également essentiel pour les bactéries qui peuvent exister dans des environnements pauvres en nutriments. Les cellules microbiennes s’appuient souvent sur la motilité chimiotactique pour se concentrer sur un environnement de croissance propice tout en échappant aux autres cellules prédatrices et aux toxines qui nuisent à la viabilité cellulaire. En nous appuyant sur des approches de gélose molle précédemment établies pour déterminer la chimiotaxie, nous développons une méthode diffusible pour générer un gradient de chimioattractant afin de tester la chimiotaxie microbienne.

Cet article décrit les méthodes de détermination des conditions de croissance, de la formation du biofilm et du tropisme chimique des bactéries, en utilisant Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 et Enterococcus faecalis V583 comme exemples (voir Figure 1). L’optimisation des conditions de croissance microbienne utilise la FTM pour déterminer les besoins en oxygène du microbe, tandis que la formation du biofilm utilise des surfaces en verre comme support solide, et la masse du biofilm est contre-colorée avec du violet cristallin. Le tropisme chimique du microbe repose sur son comportement chimiotactique, où, grâce à l’impression 3D (figure supplémentaire S1), une méthode standardisée est utilisée pour générer un réservoir chimique pour le chimioattractant dans une matrice de gélose molle (figure supplémentaire S2).

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Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole. Utilisez des techniques aseptiques pour éviter la contamination.

1. Récupération bactérienne pour obtenir une seule colonie

  1. Préparez des plaques de gélose solide.
    1. Préparez un milieu de bouillon formidable (TB) contenant de l’agar, chaque litre de liquide contenant 11,8 g de tryptone, 23,6 g d’extrait de levure, 9,4 g de K2HPO4, 2,2 g de KH2PO4 et 15 g d’agar, pH = 7.
    2. Autoclavez la solution à 121 °C pendant 20 min à l’aide d’un bouchon perméable à l’air ou d’un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
    3. Avant que le liquide ne refroidisse et ne se solidifie, verser le bouillon de tuberculose contenant de la gélose dans des boîtes de Pétri en plastique de 10 cm à un volume de 25 ml par assiette.
      REMARQUE : Le bouillon doit être versé dans la plaque avant qu’il ne se solidifie à des températures inférieures à 60 °C. Utilisez des techniques aseptiques pour prévenir la contamination.
  2. Inoculation bactérienne à la plaque
    1. Prélever les souches cibles stockées à −80 °C et les décongeler à température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique.
    2. À l’aide d’une pipette de 10 μL, prélever 10 μL de suspension bactérienne et l’étaler sur la plaque de tuberculose par stries.
    3. Scellez la plaque pour éviter toute contamination. Placez la plaque dans un incubateur biochimique à 37 °C. Vérifiez visuellement la croissance de la colonie après ~24 h. Choisissez des colonies uniques et amplifiez-les par PCR pour confirmer qu’elles ne contiennent qu’un seul type de bactérie.

2. Culture liquide bactérienne jusqu’à la phase de croissance logarithmique

  1. Préparez le milieu de culture liquide.
    1. Reportez-vous à la préparation des plaques de gélose solide à l’étape 1.1.1. pour préparer un milieu liquide TB, dont 1 L contient 11,8 g de tryptone, 23,6 g d’extrait de levure, 9,4 g de K2HPO4 et 2,2 g de KH2PO4, pH ~7.
      REMARQUE : N’ajoutez pas d’agar. Les bactéries se développent plus rapidement dans un environnement de nutriments liquides.
    2. Autoclavez la solution à 121 °C pendant 20 min à l’aide d’un bouchon perméable à l’air ou d’un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
    3. Stocker le milieu de culture liquide à 4 °C.
  2. Inoculation et culture bactériennes
    1. Dans l’enceinte de sécurité biologique, prélever une seule colonie à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’une pipette de 10 μL et inoculer les bactéries dans le milieu liquide de TB préparé dans un erlenmeyer.
    2. Fermez l’erlenmeyer avec de la gaze et placez-le dans un agitateur (200 tr/min) à 37 °C pour cultiver les bactéries.
      REMARQUE : Le milieu liquide devient progressivement trouble sur 5 h ; Le temps nécessaire pour devenir trouble varie selon les bactéries.

3. Expérience FTM et détermination de la courbe de croissance

  1. Préparation du milieu fluide à base de thioglycolate (FTM)
    1. Préparez un milieu de thiolglycolate (TM), dont chaque litre contient 15 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de glucose, 0,5 g de L-cystéine, 0,5 g de thioglycolate de sodium, 2,5 g de chlorure de sodium, 0,001 g de résazurine et 0,75 g d’agar.
      REMARQUE : Le milieu solide disponible dans le commerce peut facilement être reconstitué avec de l’eau et stérilisé (étape 3.1.2.).
    2. Pesez 29,3 g de milieu solide au thioglycolate, ajoutez 1 L d’eau distillée, chauffez et remuez jusqu’à dissolution complète et jusqu’à ce que la solution devienne rose.
    3. Ajouter TM (19 ml) dans un tube à essai avec un bouchon d’étanchéité. Après le scellement, autoclavez la solution à 121 °C pendant 20 min à l’aide d’un bouchon perméable à l’air ou d’un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
      REMARQUE : Après chauffage, la solution devient jaune clair.
  2. Inoculation, culture et observation de bactéries
    1. Préparez la suspension bactérienne pour qu’elle atteigne une DO de 0,6 à 0,8 dans un milieu liquide pour la tuberculose (voir l’étape 2.2.).
    2. Ouvrez le bouchon d’étanchéité du tube à essai dans des conditions aseptiques dans l’enceinte de sécurité biologique, ajoutez dès que possible 1 ml de la culture bactérienne dans le tube à essai contenant du FTM et refermez immédiatement le tube à essai.
    3. Agitez doucement le tube pour vous assurer que les bactéries sont réparties uniformément dans le liquide et placez le tube à essai à 37 °C pour une culture statique.
    4. Après 48 h d’incubation, observez la croissance de différentes bactéries dans le FTM dans divers tubes à essai et prenez des photos.
  3. Détermination de la courbe de croissance dans des conditions aérobies
    1. Préparez la culture bactérienne initiale avec une valeur de DO appropriée (voir étape 2.2.) et cultivez les bactéries jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance logarithmique.
      REMARQUE : Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 et Enterococcus faecalis V583 utilisés dans ce protocole ont mis ~5 h pour atteindre la phase logarithmique.
    2. Ajouter 200 μL de la culture bactérienne (de l’étape 3.3.1) dans un milieu liquide TB dans chaque puits d’une plaque de 96 puits en trois exemplaires. À l’aide d’un lecteur de microplaques, déterminez la valeur de DO à 600 nm et diluez les différentes cultures bactériennes de sorte que la différence de DO entre les différents puits contenant des bactéries et le milieu liquide de la tuberculose (à blanc) soit comprise entre 0,01 et 0,02.
    3. Prenez une nouvelle plaque à 96 puits, ajoutez un milieu de tuberculose, transférez les différentes cultures bactériennes diluées de l’étape 3.3.2., en trois exemplaires, sur la plaque et placez-la sur un établi ultra-propre.
    4. Scellez la plaque à 96 puits avec du ruban adhésif d’étanchéité, placez-la dans le lecteur de microplaques et réglez le programme comme suit :
      1. Réglez la température à 37 °C ± 0,5.
      2. Réglez la boucle cinétique sur un total de 60 cycles, chacun d’une durée de 30 min.
      3. Réglez l’absorbance à 600 nm.
      4. Réglez l’agitation sur 1 600 s par cycle.
      5. Exécutez le programme et arrêtez-le lorsque la courbe de croissance se stabilise.
  4. Détermination de la courbe de croissance dans des conditions anaérobies
    1. Suivez l’étape 3.3. mais conservez la plaque à 96 puits avec le milieu TB et les suspensions bactériennes dans un incubateur anaérobie avant de sceller la plaque avec du ruban d’étanchéité. Pompez et remplissez la boîte anaérobie avec de l’azote pour réduire la concentration d’oxygène à <3 %. Scellez la plaque à 96 puits avec du ruban adhésif et laissez-la dans la boîte anaérobie.

4. Test de capacité de formation de biofilm

  1. Cultivez les bactéries jusqu’à la phase de croissance logarithmique en milieu liquide.
    1. Se référer à la section 2 pour inoculer la bactérie dans le milieu liquide de la tuberculose.
    2. Cultivez les bactéries pendant la nuit dans un agitateur à 37 °C, en veillant à ce que la DO600 du milieu de culture bactérienne soit comprise entre 0,6 et 0,8.
  2. Divisez la culture bactérienne et cultivez dans différentes conditions.
    1. Lorsque la DO600 de la culture bactérienne est comprise entre 0,6 et 0,8, ajoutez 10 mL de cette suspension bactérienne dans un tube à essai en verre.
    2. Divisez chaque culture bactérienne en deux groupes : les conditions aérobies et anaérobies, et effectuez toutes les opérations en trois exemplaires.
      1. Pour le groupe aérobie, enveloppez le tube à essai contenant la suspension bactérienne avec du papier d’aluminium et incubez-le dans un bain-marie à 37 °C à température constante.
      2. Pour le groupe anaérobie, enveloppez le tube contenant la suspension bactérienne avec du papier d’aluminium et transférez-le dans un incubateur anaérobie. Retirez la feuille d’étain dans l’incubateur anaérobie et réduisez la concentration d’oxygène dans l’incubateur à <3 % en la pompant et en la remplissant d’azote. Fermez l’éprouvette à l’aide d’un bouchon en verre dépoli, retirez-la après l’étanchéité et incuberez-la dans un bain-marie à 37 °C.
    3. Toutes les 6 h, prélever trois tubes à essai de chacun des deux groupes (aérobie/anaérobie) pour observer la croissance du biofilm au fond, et colorer après l’étape 4.3.
  3. Jetez la suspension bactérienne et séchez le biofilm.
    1. Sortez les tubes à essai à différents moments et aspirez soigneusement la couche supérieure de la suspension bactérienne. Observez le biofilm blanc adhérer au fond du tube à essai.
      REMARQUE : Veillez à ne pas perturber le biofilm lors de l’aspiration de la suspension bactérienne.
    2. Ajoutez soigneusement 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) le long de la paroi du tube à essai, secouez-le doucement pour éliminer les bactéries planctoniques adsorbées dans le biofilm et aspirez soigneusement le tampon PBS.
    3. Mettez le tube à essai avec le biofilm adsorbé sur le fond dans le four pour qu’il sèche pendant 30 min.
  4. Coloration
    1. Sortez les tubes à essai, ajoutez 2 ml de solution de coloration violette cristalline à 0,1 % dans chaque tube à essai et colorez les biofilms pendant 30 minutes à température ambiante.
    2. À l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la solution de colorant violet cristallin. Ajoutez soigneusement de l’eau distillée le long de la paroi du tube à essai pour éliminer la solution de colorant violet cristallin restante, en répétant 3x-5x jusqu’à ce que l’eau distillée ajoutée devienne presque incolore. Observez le biofilm violet au fond du tube à essai.
    3. Séchez à nouveau le tube à essai.
  5. Dissoudre le biofilm avec de l’éthanol à 95 % et mesurer la DO600 de la solution de biofilm.
    1. Sortez le tube à essai séché, ajoutez 10 ml d’éthanol à 95 % dans chaque tube à essai et secouez soigneusement pour vous assurer que le violet cristallin a été complètement dissous dans l’éthanol.
    2. Avec un volume de 200 μL par puits, ajoutez du violet de cristal dans de l’éthanol à une plaque de 96 puits et mesurez son absorbance à une longueur d’onde de 600 nm.
      REMARQUE : Selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est linéairement liée à la concentration de la solution, de sorte que la valeur de OD600 peut refléter la concentration de violet cristallin, qui reflète la quantité de biofilm dans la suspension bactérienne à différents moments.

5. Test de chimiotaxie bactérienne

  1. Préparer des plaques de gélose eutrophe différentielle.
    1. Reportez-vous à l’étape 1 pour préparer un milieu MH demi-dose contenant 0,5 % d’agar, dont chaque litre contient 11,8 g de tryptone, 23,6 g d’extrait de levure, 9,4 g de K2HPO4, 2,2 g de KH2PO4 et 5 g d’agar, pH ~ 7.
    2. Reportez-vous à l’étape 1 pour préparer 5 milieux TB contenant 0,5 % d’agar, dont chaque litre contient 59 g de tryptone, 118 g d’extrait de levure, 47 g de K2HPO4, 11 g de KH2PO4 et 5 g d’agar, pH ~ 7.
    3. Autoclavez la solution à 121 °C pendant 20 min à l’aide d’un bouchon perméable à l’air ou d’un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
    4. Avant que le liquide ne soit refroidi et solidifié, versez 25 ml de bouillon MH demi-dose (contenant 0,5 % d’agar) par assiette, couvrez l’assiette avec un couvercle imprimé en 3D et placez-la dans une enceinte de sécurité biologique. Après refroidissement, retirez le couvercle pour observer le puits cylindrique (1,4 cm de diamètre) dans le milieu semi-solide.
      REMARQUE : Le couvercle imprimé en 3D avec un matériau en résine ne peut pas être stérilisé à l’aide de vapeur à haute température. Pour tuer les bactéries de surface, il peut être pulvérisé avec de l’éthanol à 95 %, puis irradié avec une lampe UV pendant 30 min dans une enceinte de sécurité biologique. Lorsque vous retirez le couvercle, appliquez une force dans le sens vertical et soulevez-le avec précaution pour éviter d’endommager la gélose semi-solide.
    5. Avant que le bouillon 5x TB (contenant 0,5 % d’agar) ne se solidifie, utilisez une pipette pour ajouter le bouillon 5x TB dans le puits de la plaque semi-solide jusqu’à ce que le bouillon affleure la surface du milieu.
    6. Refroidir la plaque dans une enceinte de sécurité biologique pour obtenir une plaque de gélose semi-solide contenant des corps eutrophes. Veillez à éviter la contamination de la plaque par des micro-organismes environnementaux.
      REMARQUE : Le milieu semi-solide est encore un peu fluide et, par conséquent, doit être complètement refroidi avant d’être stocké à l’envers.
  2. Inoculation bactérienne, culture et photographie
    1. Placez la plaque de gélose avec le milieu de culture semi-solide dans une enceinte de sécurité biologique et laissez-la refroidir pendant ~30 min sous irradiation UV pour éviter la contamination bactérienne.
    2. Utilisez une pipette de 10 μL pour prélever 4 μL de la suspension bactérienne cultivée à une DO de ~0,6-0,8, insérez la pointe de la pipette au centre des boîtes de Pétri en plastique et retirez la suspension bactérienne à la pipette.
    3. Attendez que la suspension bactérienne soit absorbée dans le milieu pendant 1 min. Lorsque la suspension bactérienne a été complètement absorbée, divisez la plaque en deux groupes (aérobie/anaérobie) en trois exemplaires.
    4. Scellez le groupe aérobie avec du ruban adhésif et placez ces plaques à l’envers dans un incubateur biochimique à 37 °C pour la culture statique. Scellez le groupe anaérobie dans une boîte anaérobie comme décrit à l’étape 4.2, en inversant les plaques à 37 °C pour la croissance.
    5. Vérifiez la propagation et la migration des bactéries toutes les 12 h (à 0 h, 12 h, 24 h, 36 h et 48 h) et utilisez le système d’imagerie pour prendre des images de la plaque.
  3. Utilisez le logiciel ImageJ pour calculer les distances de migration bactérienne.
    1. Importez le fichier image acquis à l’aide du système d’imagerie.
    2. Réglez la barre d’échelle et appliquez-la à toutes les images.
      1. Lorsque vous prenez des images, ajoutez une règle, créez un segment de ligne, sélectionnez un segment de ligne droite (par exemple, 1 cm, puis réglez la longueur de ce segment de ligne sur 1 cm) et marquez la longueur du tableau.
      2. Ouvrez la fenêtre Définir l’échelle ; cliquez sur Analyser | Réglez l’échelle.
      3. Saisissez la longueur réelle dans Distance connue et Unité de longueur.
      4. Vérifiez Global.
      5. Entrez l’adresse du dossier de l’image d’origine et l’adresse du fichier de sortie.
    3. À l’aide de l’outil de ligne droite , sélectionnez les communautés une par une et ajustez la tolérance jusqu’à ce que la ligne d’outil droite s’adapte à la limite de la colonie bactérienne s’étendant des deux côtés.
    4. Mesurez la distance de migration de la colonie du centre aux deux extrémités séparément et dérivez la longueur en ligne droite en cliquant sur Analyser | Mesurer.
    5. Répétez les étapes 5.3.3 et 5.3.4 jusqu’à ce que toutes les communautés soient mesurées et enregistrez les résultats dans un fichier .csv pour une analyse plus approfondie.

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Résultats

Ce travail décrit les approches adoptées pour caractériser les microbes isolés du microbiome hôte (Figure 1). À titre de preuve de concept, trois microbes ont été isolés de l’hôte du rat SD (C. stationis, S. cohnii et E. faecalis), et deux micro-organismes acquis commercialement (S. aureus ATCC 25923 et E. faecalis V583) ont été testés à l’aide de ce protocole. Pour établir les besoins en oxygène de chaque microbe à l’aide de la FTM, nous avons aj...

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Discussion

Nous avons isolé et identifié cinq espèces de bactéries par des méthodes séquentielles. La croissance des bactéries a des besoins minimaux en nutriments : le milieu minimal - un milieu contenant uniquement des sels inorganiques, une source de carbone et de l’eau. Bien que les bactéries du groupe expérimental aient été trouvées sur des plaques solides MH, nous avons utilisé un milieu MH à demi-dose pour vérifier la chimiotaxie des bactéries et avons obtenu de bons résultats. Cependant, no...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le développement de cette technique a été soutenu par les fonds du Fonds de recherche pour les jeunes scientifiques internationaux de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (22050410270), du Fonds spécial de Shenzhen pour l’innovation et l’entrepreneuriat des talents de haut niveau à l’étranger (KQTD20170810111314625) et du programme d’équipe de recherche innovante et entrepreneuriale du Guangdong (2019ZT08Y191). Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude à Mlle Chen Xinyi pour son aide dans la relecture du document et la gestion du laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
chimique/en solution
1 % solution de colorant violet cristallinSolarbioG1062100 mL
AgarSigma-AldrichV900500Utilisé pour obtenir des plaques semi-solides, 20 g
Tube à centrifugerCorning43079015 mL
Thioglycolate fluide moyenKinghuntK000129,3 g
Mueller Hinton II Bouillon moyenSolarbioNO.11865100 g
Boîtes de PétriBkmanB-SLPYM90-15Boîtes de Pétri en plastique, circulaires, 90 mm x 15 mm
Chlorure de potassiumVETECWXBC4493V0,2 g
Dihydrogénophosphate de potassiumaladdin04-11-77580,24 g
Chlorure de sodiumMacklinS8052758.0 g
Phosphate de sodium dibasiquealaddin7558-79-41.44 g
Terrific Broth moyenSolarbioLA2520200 g
Kits/ Equipment
Incubateur anaérobieLongyue
Incubateur biochimiqueBlue pardLRH-70
Lecteur de microplaques
Tanon 5200multi système d’imagerieTanon5200CE
Bain-marie thermostatiqueJinghongDK-S28
Spark

Références

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