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Article de méthode

Guérison des plaies cornéennes du poisson-zèbre: de l’abrasion à l’analyse d’imagerie de fermeture de plaie

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DOI :

10.3791/63605

⸱

1 mars 2022

 ,  , 
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Dans cet article

Résumé

Ce protocole se concentre sur l’endommagement de la surface oculaire du poisson-zèbre par abrasion pour évaluer la fermeture ultérieure de la plaie au niveau cellulaire. Cette approche exploite une bavure oculaire pour enlever partiellement l’épithélium cornéen et utilise la microscopie électronique à balayage pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire pendant la fermeture de la plaie.

Résumé

En tant que surface transparente de l’œil, la cornée est essentielle à une vision claire. En raison de son emplacement, ce tissu est sujet aux insultes environnementales. En effet, les lésions oculaires les plus fréquemment rencontrées cliniquement sont celles de la cornée. Bien que la cicatrisation des plaies cornéennes ait été largement étudiée chez les petits mammifères (c.-à-d. les souris, les rats et les lapins), les études de physiologie cornéenne ont négligé d’autres espèces, y compris le poisson-zèbre, bien que le poisson-zèbre soit un modèle de recherche classique.

Ce rapport décrit une méthode d’abrasion cornéenne sur le poisson-zèbre. La plaie est réalisée in vivo sur des poissons anesthésiés à l’aide d’une bavure oculaire. Cette méthode permet d’obtenir une plaie épithéliale reproductible, laissant le reste de l’œil intact. Après abrasion, la fermeture de la plaie est surveillée pendant 3 heures, après quoi la plaie est réépithélialisée. En utilisant la microscopie électronique à balayage, suivie du traitement de l’image, la forme des cellules épithéliales et les protubérances apicales peuvent être étudiées pour étudier les différentes étapes de la fermeture de la plaie épithéliale cornéenne.

Les caractéristiques du modèle du poisson-zèbre permettent d’étudier la physiologie du tissu épithélial et le comportement collectif des cellules épithéliales lorsque le tissu est mis à l’épreuve. De plus, l’utilisation d’un modèle privé de l’influence du film lacrymal peut produire de nouvelles réponses concernant la réponse cornéenne au stress. Enfin, ce modèle permet également la délimitation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans tout tissu épithélial soumis à une plaie physique. Cette méthode peut être appliquée à l’évaluation de l’efficacité des médicaments dans les tests précliniques.

Introduction

Comme la plupart des épithéliums sont en contact avec l’environnement extérieur, ils sont sujets aux blessures physiques, ce qui les rend bien adaptés à l’étude des processus de cicatrisation des plaies. Parmi les tissus bien étudiés, la cornée est un modèle extrêmement utile dans l’étude des aspects cellulaires et moléculaires de la cicatrisation des plaies. En tant que surface externe transparente, il fournit une protection physique à l’œil et est le premier élément à concentrer la lumière sur la rétine. Bien que la structure et la composition cellulaire de la rétine diffèrent d’une espèceà l’autre, ces éléments de la cornée sont généralement similaires dans tous les yeux de type caméra, quelle que soit l’espèce.

La cornée est composée de trois couches principales2. La première couche et la plus externe est l’épithélium, qui est constamment renouvelé pour assurer sa transparence. La deuxième couche est le stroma, qui contient des cellules dispersées, appelées kératocytes, dans une épaisse couche de fibres de collagène strictement organisées. La troisième couche, la plus interne, est l’endothélium, qui permet la diffusion des nutriments et des liquides de la chambre antérieure vers les couches externes. Les cellules épithéliales et stromales interagissent via des facteurs de croissance et des cytokines3. Cette interaction est mise en évidence par l’apoptose rapide et la prolifération subséquente des kératocytes après une lésion épithéliale 4,5. En cas de plaie plus profonde, telle qu’une ponction, les kératocytes participent activement au processus de guérison6.

Étant en contact avec l’environnement extérieur, les blessures physiques cornéennes sont fréquentes. Beaucoup d’entre eux sont causés par de petits corps étrangers7, tels que le sable ou la poussière. Le réflexe de frottement des yeux peut entraîner des abrasions épithéliales étendues et un remodelage cornéen8. Selon la taille et la profondeur de la plaie, ces blessures physiques sont douloureuses et prennent plusieurs jours pour guérir9. Les caractéristiques optimales de cicatrisation d’un modèle facilitent la compréhension des aspects cellulaires et moléculaires de la fermeture de la plaie. En outre, de tels modèles se sont également révélés utiles pour tester de nouvelles molécules ayant le potentiel d’accélérer la guérison de la cornée, comme démontré précédemment10,11.

Le protocole décrit ici vise à utiliser le poisson-zèbre comme modèle pertinent pour étudier les lésions physiques cornéennes. Ce modèle est très pratique pour les études de dépistage pharmacologique car il permet d’ajouter des molécules directement à l’eau du réservoir et, par conséquent, d’entrer en contact avec une cornée cicatrisante. Les détails fournis ici aideront les scientifiques à effectuer leurs études sur le modèle du poisson-zèbre. La blessure in vivo est réalisée avec une bavure oculaire émoussée. L’impact sur les cellules épithéliales adjacentes ou éloignées de celui-ci peut être analysé en enlevant spécifiquement l’épithélium cornéen central. Au cours des dernières années, de nombreux rapports se sont concentrés sur une telle méthode sur la cornée de rongeurs 12,13,14,15,16,17; toutefois, à ce jour, un seul rapport a appliqué cette méthode au poisson-zèbre18.

En raison de sa simplicité, la plaie physique est utile pour délimiter le rôle des cellules épithéliales dans la fermeture de la plaie. Un autre modèle bien établi de lésion cornéenne est la brûlure chimique, en particulier la brûlure alcaline 19,20,21. Cependant, une telle approche endommage indirectement toute la surface de l’œil, y compris la cornée périphérique et le stroma cornéen19. En effet, les brûlures alcalines induisent potentiellement des ulcères cornéens, des perforations, une opacification épithéliale et une néovascularisation rapide22, et le résultat incontrôlable des brûlures alcalines disqualifie cette approche pour les études générales de cicatrisation des plaies. De nombreuses autres méthodes sont également utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes en fonction de l’objectif particulier de l’étude en question (par exemple, le débridement épithélial complet23, la combinaison de lésions chimiques et mécaniques pour la plaied’épaisseur partielle 24, l’ablation au laser excimère pour les plaies s’étendant jusqu’au stroma25). L’utilisation d’une bavure oculaire limite le point focal à la réponse épithéliale à la plaie et fournit une plaie hautement reproductible.

Comme pour chaque méthode d’infliction de plaie, l’utilisation d’une bavure oculaire présente des avantages et des inconvénients. Le principal inconvénient est que la réponse étant principalement épithéliale, elle ne reflète pas parfaitement les abrasions observées dans le cadre clinique. Cependant, cette méthode présente de nombreux avantages, notamment la facilité avec laquelle elle peut être mise en place et exécutée, sa précision, sa reproductibilité et le fait qu’elle est non invasive, ce qui en fait une méthode bien tolérée par les animaux.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le conseil national de l’expérimentation animale.

1. Préparatifs

  1. Préparer à l’avance la solution mère de tricaïne utilisée pour l’anesthésie26 (solution mère à 0,4 % utilisée dans ce protocole). Utilisez des gants et conservez les matériaux dans une hotte chaque fois que possible.
    1. Pour 50 mL d’une solution à 0,4%, peser 200 mg de poudre de tricaïne dans un tube de 50 mL. Dissoudre la poudre dans environ 45 mL d’eau double distillée.
    2. Ajuster le pH de la solution mère de tricaïne à 7 avec 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Ajouter la solution de Tris au bouillon de tricaïne en aliquotes, bien mélanger le bouillon après chaque aliquote et vérifier le pH après chaque ajout de Tris.
  2. Avant l’expérience, préparez une solution de travail à 0,02% de tricaïne.
    1. Décongeler 2 mL de solution mère à 0,4 % et ajouter à 40 mL d’eau de système (concentration finale 0,02 %). Placez la solution dans un petit récipient.
  3. Avant l’expérience, préparez l’eau de récupération contenant un analgésique. Utilisez des gants et gardez les matériaux dans la hotte chaque fois que possible.
    1. Pour un litre d’eau de récupération, peser 2,5 mg de poudre de chlorhydrate de lidocaïne et la dissoudre dans de l’eau douce du système. Vérifiez le pH et ajustez-le à 7 si nécessaire.
  4. Avant l’expérience, préparer la solution fixatrice (2,5% de glutaraldéhyde dans une solution de phosphate de sodium (Na-PO4) à 0,1 M à pH 7,4). Utilisez des gants et conservez les matériaux dans une hotte aspirante.
    1. Pour 10 mL de la solution de fixation, pipeter 5 mL de 0,2 M Na-PO4 dans un tube. Ajouter 0,5 mL de glutaraldéhyde à 50 % et ajouter de l’eau double distillée pour obtenir le volume final de 10 mL. Protégez la solution de la lumière et conservez-la sur la glace ou au réfrigérateur avant utilisation.
      REMARQUE: Si les échantillons doivent être prélevés pendant plusieurs heures après la blessure, préparez la solution de fixation juste avant utilisation.
  5. Préparer l’équipement pour la blessure (Figure 1).
    1. Remplissez les réservoirs de récupération ou les petits contenants avec de l’eau du système.
    2. Préparez la bavure ophtalmique. Vérifiez que la pointe de la bavure est propre. Si nécessaire, enlevez les débris cellulaires avec un coton-tige humide.
    3. Faites une incision sur le côté d’une éponge molle et humidifiez l’éponge avec de l’eau du système. Placez l’éponge sur la base/la scène d’un microscope à dissection. Assurez-vous d’avoir suffisamment d’espace de travail pour utiliser la bavure et suffisamment d’éclairage sur les côtés et/ou au-dessus pour voir correctement la surface des yeux.

2. Anesthésie

  1. Transférer un poisson de l’aquarium à la solution de tricaïne à 0,02% avec un filet aussi doucement que possible.
  2. Surveillez l’anesthésie, en vérifiant l’absence de réponse au stimulus mécanique léger.
    REMARQUE: Pour une anesthésie uniforme, une exposition de 2 minutes à la tricaïne est utilisée avant l’abrasion avec les poissons AB adultes de type sauvage. Avec des poissons d’un autre fond génétique, une durée différente peut être nécessaire.

3. Abrasion

  1. Placez doucement le poisson anesthésié avec une cuillère dans l’incision sur l’éponge, la tête dépassant de la surface de l’éponge.
  2. Allumez la bavure et concentrez la vue du microscope sur la surface de l’œil.
  3. Approchez-vous soigneusement de la surface des yeux avec la pointe de la bavure. Lorsque vous touchez la surface de l’œil, commencez à déplacer la pointe de la bavure sur la surface de l’œil avec un mouvement circulaire. Évitez les mouvements brusques, car cela pourrait entraîner l’inclinaison de l’œil dans l’alvéole et le glissement de la pointe de la bavure.
  4. Lorsque l’abrasion est terminée, placez soigneusement le poisson dans l’eau du système contenant l’analgésique pour la récupération.
  5. Nettoyez la bavure juste après utilisation avec un coton-tige humide.

4. Prélèvement d’échantillons

  1. Au moment souhaité, ramassez le poisson avec un filet et placez-le dans une solution de tricaïne à 0,02%. Gardez l’animal dans la solution jusqu’à ce que le mouvement operculaire ait complètement cessé et que le poisson ne réagisse pas au toucher.
  2. Placez le poisson sur une boîte de Pétri avec une cuillère et tenez-le avec une pince à épiler. Décapitez le poisson avec des ciseaux disséquants. Évitez de faire des rayures sur la surface des yeux lorsque vous manipulez l’échantillon.
  3. Placer le tissu dans un tube d’échantillonnage contenant 0,1 M de Na-PO4.
    1. Rincez le tissu en remplaçant le Na-PO4 de 0,1 M par un tampon propre afin qu’il ne reste pas de sang dans la solution.

5. Traitement des échantillons pour la microscopie électronique

  1. Fixer le tissu dans 2,5 % de glutaraldéhyde/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) pendant ~24 h à +4 °C. Conservez l’échantillon sur un porte-échantillon rotatif ou agité pour assurer une bonne fixation.
  2. Retirez la solution de fixation et rincez l’échantillon plusieurs fois avec 0,1 M Na-PO4.
  3. Disséquez l’échantillon à ce stade.
    1. Placer l’échantillon sur une goutte de 0,1 M Na-PO4 sur une plaque de dissection. Si les deux yeux du même poisson doivent être imagés, coupez l’échantillon de tête en deux avec de fins ciseaux à disséquer.
    2. Alternativement, collectez les yeux uniquement en plaçant soigneusement les pointes de la pince à épiler fine dans l’orbite du côté de l’œil, en prenant soin de ne pas rayer la surface de l’œil. Ensuite, retirez l’œil de l’orbite.
    3. Transférer l’échantillon disséqué dans un tube contenant 0,1 M de Na-PO4. Assurez-vous qu’il n’y a pas de tissu supplémentaire dans le tube d’échantillonnage, car il peut adhérer au sommet de l’œil pendant le traitement de l’échantillon.
  4. Conserver l’échantillon dans 0,1 M Na-PO4 (maximum une semaine) à +4 °C.
  5. Traiter les échantillons pour l’imagerie par microscopie électronique.
    1. Postfixer les échantillons dans du tétroxyde d’osmium à 2 % dans un tampon Na-PO4 de 0,1 M pendant 1 h à température ambiante (RT).
    2. Lavez les échantillons 3 fois pendant 5 minutes chaque lavage dans 0,1 M Na-PO4 à RT.
    3. Déshydrater les échantillons successivement dans de l’éthanol à 30%, 50% et 70% pendant 1 h dans chaque solution à TA.
    4. Immerger les échantillons dans de l’éthanol à 96% pendant 2-3 h à TA.
    5. Ensuite, incuber les échantillons deux fois dans de l’éthanol à 100 %, d’abord pendant 1 h, puis dans de l’éthanol frais à 100 % pendant la nuit à +4 °C.
    6. Soumettez les échantillons à 30 cycles dans un sécheur automatisé de points critiques.
  6. Intégrez et recouvrez les échantillons de platine.
    1. Placez une languette adhésive sur un support. Si l’échantillon doit être marqué sur le dessus de la monture, laissez un morceau de papier de couverture d’onglet sur l’onglet et écrivez l’ID de l’échantillon sur le papier.
    2. Placez la monture avec la languette sur la base d’un microscope à dissection.
    3. Placez doucement l’échantillon de tissu sur la monture avec une pince à épiler fine, la cornée vers le haut.
    4. Enduire l’échantillon de platine à l’aide du dispositif approprié. Après le revêtement, conservez les échantillons à température ambiante jusqu’à l’imagerie.

6. Imagerie (Figure 2)

  1. Utilisez les appareils comme conseillé dans le manuel de l’utilisateur et par des experts en imagerie.
  2. Acquérez des images du grossissement souhaité et utilisez des images 2 000 à 2 500x pour l’analyse.
  3. Ajustez la luminosité et le contraste de sorte qu’il n’y ait pas de zones surexposées dans l’image, et que les bordures de cellules et les micro-réfrigérateurs soient vus aussi clairement que possible.
    REMARQUE: La position et l’angle du tissu affectent les paramètres de luminosité et de contraste. Ils peuvent avoir besoin d’être ajustés d’un échantillon à l’autre et entre différentes régions du tissu.

7. Mesure de la forme, de la taille et du motif de microgravure de la cellule

  1. Ouvrez l’image TIFF dans Fiji ImageJ 1.5327. Définissez l’échelle à l’aide de la barre d’échelle de l’image : créez une ligne de taille égale à la barre d’échelle à l’aide de l’outil Ligne . Sélectionnez Analyser | Définissez l’échelle et tapez la distance connue. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement à partir de la | Analyser Menu Outils .
  2. Pour la taille et l’arrondi des cellules, sélectionnez Analyser | Définir les | de mesures Descripteurs de forme. Utilisez l’outil Loupe pour voir les cellules sous grossissement. Sélectionnez des cellules à l’aide de l’outil Polygone et ajoutez chaque sélection au gestionnaire de retour sur investissement. Enfin, mesurez les cellules sélectionnées et enregistrez la mesure.
  3. Analyse de microridge (Figure 3 et Figure 4)
    1. Assurez-vous que l’image est au format 8 bits à partir de l’image | Tapez menu.
    2. Sélectionnez une cellule à l’aide de l’outil Polygone et effacez l’arrière-plan de la | Modifier Clair à l’extérieur.
    3. Lissez l’image une à trois fois en sélectionnant Traiter | Lissez et ajustez la luminosité et le contraste à partir de l’image | Ajuster | Luminosité/Contraste pour que les microgravures se démarquent le plus clairement possible.
    4. Convolve l’image de Process | Filtres | Convolve, transformez en binaire à partir de Process | | binaire Rendez binaire et squelettez l’image en noir et blanc en sélectionnant Traiter | | binaire Squeletter.
    5. Utilisez la fonction Analyser le squelette dans le | Analyser Menu squelette pour mesurer les paramètres de la microgravure et enregistrer les valeurs.
      REMARQUE: Dans SEM, les images individuelles peuvent différer en luminosité et en contraste. Ainsi, les étapes de l’analyse peuvent nécessiter des ajustements d’image en image.

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Résultats

Cette étude décrit une méthode utilisant une bavure ophtalmique dans des expériences de cicatrisation des plaies cornéennes du poisson-zèbre. La méthode est modifiée par rapport à des études antérieures sur des souris, où il a été démontré que la bavure enlevait efficacement les couches de cellules épithéliales13. Les défis de la blessure cornéenne du poisson-zèbre comprennent la taille relativement petite de l’œil et, dans le cas d’expériences fastidieuses, la nécessité de maintenir un flux d’eau...

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Discussion

Les blessures physiques cornéennes sont la cause la plus fréquente de visites de patients en ophtalmologie à l’hôpital. Par conséquent, il est important d’établir des modèles pertinents pour l’étude de différents aspects de la physiopathologie cornéenne. Jusqu’à présent, la souris est le modèle le plus couramment utilisé pour l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes. Cependant, l’ajout de gouttes oculaires sur les yeux blessés murins pour valider l’impact de médicaments spécifiques sur la cicatrisation des plaie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Pertti Panula pour l’accès à l’unité Zebrafish et Henri Koivula pour les conseils et l’aide pour les expériences sur le poisson-zèbre. Cette recherche a été soutenue par l’Académie de Finlande, la Fondation Jane et Aatos Erkko, la Fondation culturelle finlandaise et le programme ATIP-Avenir. L’imagerie a été réalisée à l’unité de microscopie électronique et à l’unité de microscopie optique de l’Institut de biotechnologie, avec le soutien de HiLIFE et du Biocenter Finland.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 M de Na-PO4 (tampon de phosphate de sodium), pH 7,4interneest préparée à partir de 1 M de tampon de phosphate de sodium (1 M de Na2 HPO<>4 ajusté à pH 7,4 avec 1M de NaH2 PO4 ).
0,2 M de Na-PO4 (tampon de phosphate de sodium), pH 7,4interneest préparée à partir de 1 M de tampon de phosphate de sodium (1 M de Na2 HPO4 ajusté à pH 7,4 avec 1 M de NaH2 PO<>4 ).
Pointes de meule 0,5 mmAlger Equipment CompanyBU-5S
1M Tris, pH 8,8
Agar ScientificG3347N
Meule Algerbrush, Instrument completAlger Equipment CompanyBR2-5
Échanges de cotonHeinz Herenz Hamburg1030128
Plaquede dissection
Outils
eau doublement distilléetubes Eppedorf
, 2 mltout fournisseur
Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoateSigmaA5040Attention : provoque une irritation.
Glutaraldéhyde, solution aqueuse à 50 %, grade ISigmaG7651Attention : toxique.
Chlorhydrate de lidocaïneSigmaL5647Attention : toxique.
supportsAgar ScientificG301P
Boîte de PétriThermo Scientific101VR20
Bandelettes indicatrices de pHMacherey-Nagel92110
Cuillères en plastiquetout fournisseur
Tubes en plastique, 15 mlGreiner Bio-One188271
Tubes en plastique, 50 mlGreiner Bio-One227261
Microscope électronique à balayageFEIQuanta 250 FEG
Éponge doucetout fournisseur
Revêtement par pulvérisation cathodiqueQuorum TechnologiesGQ150TS
StéréomicroscopeLeica
La solution La solution languettes adhésives maison outils de dissection internes de science fine

Références

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