Article de méthode

Formulation et caractérisation d’un système de transport de dopamine à base d’exosomes

DOI :

10.3791/63624

⸱

4 avril 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons cherché à obtenir une formulation par chargement dopaminergique des exosomes isolés de cellules souches issues des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton. L’isolement et la caractérisation des exosomes, la charge du médicament dans les exosomes résultants et l’activité cytotoxique de la formulation développée sont décrits dans ce protocole.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les exosomes d’une taille comprise entre 40 et 200 nm constituent le plus petit sous-groupe de vésicules extracellulaires. Ces vésicules bioactives sécrétées par les cellules jouent un rôle actif dans la cargaison et la communication intercellulaires. Les exosomes se trouvent principalement dans les fluides corporels tels que le plasma, le liquide céphalo-rachidien, l’urine, la salive, le liquide amniotique, le colostrum, le lait maternel, le liquide articulaire, le sperme et l’acide pleural. Compte tenu de la taille des exosomes, on pense qu’ils peuvent jouer un rôle important dans les maladies du système nerveux central car ils peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, cette étude visait à développer un système de nanotransporteurs à base d’exosomes en encapsulant la dopamine dans des exosomes isolés des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton (WJ-MSCs). Les exosomes qui ont passé le processus de caractérisation ont été incubés avec de la dopamine. Les exosomes chargés en dopamine ont été recaractérisés en fin d’incubation. Les exosomes chargés de dopamine ont été étudiés dans des tests de libération de médicaments et de cytotoxicité. Les résultats ont montré que la dopamine pouvait être encapsulée avec succès dans les exosomes et que les exosomes chargés de dopamine n’affectaient pas la viabilité des fibroblastes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les exosomes, des vésicules bioactives aux caractéristiques significatives, ont une taille comprise entre 40 nm et 200 nm. Les exosomes proviennent de la membrane cellulaire et se forment en raison de la libération des endosomes1. Ces structures servent de communicateurs de cellule à cellule et interagissent avec les cellules voisines pour faciliter le transfert de molécules actives. Les exosomes peuvent être isolés à partir de nombreuses sources différentes. Il s’agit notamment des fluides corporels tels que le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ainsi que des lignées cellulaires cultivées dans des conditions in vitro . Les exosomes jouent un rôle important dans l’élimination des lésions nerveuses, grâce aux biomacromolécules qu’ils contiennent, telles que les lipides, les protéines et les acides nucléiques2. Les glies, qui sont les cellules de soutien du système nerveux3, transfèrent des protéines et des micro-ARN aux axones des neurones via les exosomes4.

Les lipides formant la gaine de myéline, qui sont un élément caractéristique de la conduction nerveuse, sont également libérés par les oligodendrocytes via les exosomes 4,5. Les exosomes sont également impliqués dans des processus tels que la plasticité synaptique, la réponse neuronale au stress, la communication cellule-cellule et la neurogenèse dans le cerveau 6,7. Le fait que les exosomes possèdent des dimensions nanométriques leur permet de passer à travers la BHE. Il existe une voie de transition spéciale entre le liquide interstitiel et le liquide céphalo-rachidien après avoir pénétré cette membrane8. Grâce à leurs propriétés de surface, les exosomes peuvent interagir efficacement avec les cellules cibles en tant que système d’administration de médicaments et délivrer activement les médicaments chargés.

En raison de l’expression de diverses protéines adhésives (tétraspanines et intégrines) à la surface des exosomes, ces vésicules extracellulaires peuvent facilement interagir et fusionner avec les membranes des cellules hôtes9. On pense que les exosomes peuvent être utilisés comme système d’administration de médicaments, en particulier dans le traitement des maladies du système nerveux central en raison de leur capacité à pénétrer dans la BHE et de leurs propriétés de surface. Les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses (CSM) présentent un risque de rejet immunitaire plus faible que les thérapies cellulaires allogéniques et, à cet égard, ils peuvent constituer un élément important des applications de traitement sans cellules10.

La dopamine est une molécule dont la carence dans le cerveau est le trait caractéristique de la maladie de Parkinson (MP), s’aggravant de jour en jour11,12,13. On sait que la maladie de Parkinson est associée à la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans la substance noire du mésencéphale et à la perte des fonctions des motoneurones14,15. La mort des neurones dopaminergiques empêche l’apport du neurotransmetteur dopamine au striatum cérébral. Ceci, à son tour, entraîne l’apparition de symptômes spécifiques à la maladie de Parkinson16. Ces symptômes de la maladie de Parkinson sont la bradykinésie, l’instabilité posturale, la rigidité et surtout les tremblements au repos12,13. Bien que la maladie de Parkinson ait été décrite pour la première fois il y a plus de deux siècles, les études visant à comprendre la pathologie et l’étiologie de la maladie sont toujours en cours et il est actuellement admis que la maladie de Parkinson est une maladie systémique complexe17. Il est prédit qu’une carence en dopamine se produit et que des symptômes cliniques de la maladie de Parkinson sont observés lorsque plus de 80 % des neurones dégénèrent18. Dans le traitement de la maladie, une supplémentation incomplète en dopamine est préférée pour réduire les symptômes moteurs. Des études in vivo ont montré que l’infusion directe de dopamine dans le cerveau réduit considérablement les symptômes chez les animaux19. Les précurseurs de la dopamine tels que la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphénylalanine) et les médicaments à base de récepteurs de la dopamine sont utilisés en clinique parce que la perfusion directe de dopamine dans le cerveau n’est pas possible chez l’homme et que la dopamine entrant dans le système ne peut pas traverser le BHS20. Ces types de médicaments perdent de leur efficacité avec le temps. Cependant, il n’existe toujours pas d’approche curative pour la maladie de Parkinson. Il est donc absolument nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et modalités de traitement pour révéler la physiopathologie de la maladie et réduire l’impact de la maladie de Parkinson sur les patients.

Les études basées sur les exosomes ont récemment attiré l’attention pour la collecte d’informations sur les approches thérapeutiques et les pathologies des maladies du système nerveux. Il a été démontré que les exosomes dérivés de CSM réduisent l’inflammation des lésions nerveuses et contribuent à la régénération neuronale21,22,23. De plus, il a été rapporté que les sécrétomes d’exosomes dérivés de CSM réduisent l’apoptose en montrant des effets neurotrophiques et neuroprotecteurs, en particulier sur les neurones dopaminergiques24,25. La recherche sur les plateformes dans lesquelles les exosomes sont utilisés comme systèmes d’administration de médicaments thérapeutiques s’est intensifiée ces dernières années. Dans de nombreuses études, il a été observé que les médicaments pertinents peuvent être facilement encapsulés dans des exosomes et administrés en toute sécurité dans les cellules, les tissus et les organes cibles26,27. Différentes méthodes telles que l’incubation, les cycles de congélation/décongélation, la sonication et l’extrusion pourraient être utilisées pour le chargement du médicament dans les exosomes28.

La coincubation avec des exosomes ou des vésicules de type exosome permet d’encapsuler passivement de petites molécules lipophiles dans ces systèmes d’administration28,29,30. En particulier, diverses molécules telles que la curcumine31, la catalase 30, la doxorubicine 32 et le paclitaxel33 ont été efficacement chargées dans les exosomes. Il a été observé que les exosomes contenant de la catalase, qui ont une activité antioxydante, s’accumulaient efficacement dans les neurones et les cellules microgliales du cerveau et présentaient de fortes activités neuroprotectrices30. Dans la même étude, la saponine, ajoutée au complexe pour augmenter l’efficacité de la charge, a augmenté le pourcentage de charge du médicament pendant l’incubation30,34. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour établir les normes de charge des médicaments dans les exosomes.

Cet article décrit le développement d’un système de nanotransporteurs par encapsulation de la dopamine dans des exosomes qui ont été isolés à partir de CSM-WJ. Toutes les étapes, y compris la culture des CSM-WJ, l’isolement et la caractérisation des exosomes, les expériences de chargement de médicaments, la caractérisation des exosomes chargés en dopamine avec diverses techniques et l’analyse de cytotoxicité in vitro sont expliquées en détail.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Culture et cryoconservation des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton

  1. Retirez les WJ-MSC (de l’ATCC) du congélateur à -80 °C. Semez les cellules dans une fiole contenant du milieu DMEM-F12 complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Incubez-les à 37 °C dans un incubateur contenant 5 % de CO2.
  2. Changez le milieu de culture tous les 2 jours. Faire passer les cellules lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence. Laver les cellules à faire passer avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    REMARQUE : Le lavage avec du PBS avant d’ajouter de la trypsine assure une séparation facile des cellules de la surface du flacon.
  3. Retirer le PBS et ajouter 5 mL de solution de trypsine-EDTA dans le flacon. Incuber le flacon pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur contenant 5 % de CO2.
  4. Recueillir le surnageant dans le tube et centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min. Après centrifugation, retirer le surnageant et ajouter 1 mL de DMEM-F12 + 10 % de FBS dans le tube par pipetage.
  5. Transférez les cellules dans un flacon plus grand et poursuivez la culture en ajoutant du DMEM-F12 + 10 % de FBS jusqu’à l’obtention d’un nombre suffisant d’exosomes35.
    REMARQUE : Les cellules cultivées sont congelées à une densité de 1 million/mL avec 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et stockées à -80 °C.

2. Production d’exosomes à partir de cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton

REMARQUE : Les exosomes sont isolés à partir de CSM-WJ en culture. L’isolement des exosomes est effectué lorsque les cellules recouvrent la surface du flacon et atteignent une densité d’environ 80 %.

  1. Retirer le milieu surnageant contenant 10 % de FBS de la fiole et laver les cellules avec 5 mL de PBS. Ajoutez le milieu DMEM-F12 sans sérum aux cellules après avoir rincé avec du PBS. Incuber les flacons pendant 48 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Après l’incubation, recueillir le milieu sans sérum dans le tube et conserver à -20 °C.
    REMARQUE : À l’étape 2.1, 180 mL de milieu sans sérum sont collectés et stockés à -20 °C. Après la décongélation, un processus de centrifugation par lots est lancé, comme décrit ci-dessous.
  2. Isolement des exosomes
    1. Centrifuger le milieu sans sérum collecté à 300 x g pendant 10 min à +4 °C. Retirez délicatement le surnageant et transférez-le dans un autre tube.
    2. Centrifuger le surnageant collecté à 2 000 × g pendant 10 min à +4 °C. Retirez délicatement le surnageant et transférez-le dans un autre tube.
    3. Centrifuger le surnageant collecté à 10 000 × g pendant 30 min à +4 °C. Retirez délicatement le surnageant et transférez-le dans un autre tube.
    4. Transvaser le surnageant collecté dans des tubes d’ultracentrifugation et ultracentrifuger à 110 000 × g pendant 130 min. Retirez lentement le surnageant et ajoutez 1 mL de PBS à la pastille.
    5. Vortex la pastille et l’ultracentrifugeuse à 110 000 × g pendant 70 min à +4 °C36 (Figure 1). Retirez lentement le surnageant et ajoutez 1 mL de PBS à la pastille.
      REMARQUE : Une fois les étapes d’ultracentrifugation terminées, les exosomes obtenus peuvent être stockés à -80 °C. La pastille obtenue est maintenant prête à être caractérisée.

figure-protocol-1
Figure 1 : Isolement des exosomes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Caractérisation des exosomes

  1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    REMARQUE : Une analyse de suivi des nanoparticules est effectuée pour déterminer la taille et la concentration des exosomes isolés. Les comprimés utilisés pour 1x solution PBS doivent être dans la plage de pH 7,3-7,5. 1x La solution PBS contient 10 mM de tampon phosphate, 137 mM de chlorure de sodium et 2,7 mM de chlorure de potassium. La solution est préparée en ajoutant 1 comprimé de PBS dans 100 mL d’eau distillée. Cette solution préparée est stérilisée à l’autoclave.
    1. Diluez les exosomes 100 fois en ajoutant 990 μL de PBS à 10 μL d’exosomes. Prenez la suspension diluée dans une seringue jetable.
    2. Allumez le périphérique NTA et connectez l’ordinateur. Ouvrez le logiciel.
    3. Injectez l’échantillon dans la seringue dans le tube de la section cassette de l’appareil. Fermez le couvercle de la cassette de l’appareil.
    4. Dans le logiciel qui s’ouvre, cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse . Enregistrez les résultats obtenus en appuyant sur le bouton Enregistrer .
  2. Analyse dynamique de la diffusion de la lumière
    REMARQUE : Les exosomes isolés pour la mesure du potentiel zêta et de la taille sont également dilués de la même manière que pour l’analyse NTA.
    1. Ajouter 980 μL de PBS à 20 μL d’exosomes.
    2. Ouvrez le périphérique de dimensionnement zêta et l’ordinateur connecté. Ouvrez le logiciel.
    3. Ajoutez la suspension de l’étape 3.2.1 à la cuvette jetable. Ouvrez le couvercle de l’appareil, placez la cuvette dans la cassette et fermez le couvercle.
    4. Sélectionnez le type de cuvette dans le logiciel de l’appareil. Cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse pour l’analyse du potentiel zêta et de l’analyse dimensionnelle.
      REMARQUE : Les analyses sont effectuées séparément pour l’analyse dimensionnelle et le potentiel zêta.

4. Charge de dopamine dans les exosomes

NOTE : Une fois la caractérisation des exosomes des CSM-WJ terminée, des exosomes chargés en dopamine ont été obtenus en tant que système d’administration de médicaments. Le chargement du médicament dans les exosomes est effectué à l’aide de la méthode d’incubation.

  1. Ajouter 3 mL de PBS à la suspension d’exosomes de l’étape 2.2.5. Stériliser la suspension diluée par filtration à l’aide de filtres de 0,22 μm. Transférez 500 μL de la suspension d’exosomes stérilisée dans un autre tube.
  2. Préparer une solution de dopamine (0,5 mg/mL) avec de l’eau distillée. Ajouter 500 μL de solution de dopamine dans les tubes contenant les exosomes.
  3. Ajouter de la saponine à la suspension à l’étape 4.2. Incuber la suspension d’exosome-dopamine préparée pendant 24 h à 37 °C.
    REMARQUE : La concentration de saponine ne doit pas dépasser 0,002% de la solution totale.
  4. Ultracentrifugez la suspension à 90 000 × g pendant 70 min pour éliminer la dopamine libre et la saponine du milieu. Conserver les exosomes isolés à -20 °C jusqu’à leur utilisation pour une analyse plus approfondie37.
    REMARQUE : Ajouter 0,02% d’acide ascorbique pour la stabilité de la solution de dopamine préparée.

5. Caractérisation des exosomes chargés en dopamine

  1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    REMARQUE : L’analyse de suivi des nanoparticules est effectuée pour déterminer la taille et la concentration des exosomes isolés.
    1. Suivez les étapes 3.1.1 à 3.1.4 pour diluer les exosomes et effectuer un NTA.
  2. Analyse dynamique de la diffusion de la lumière
    REMARQUE : Les exosomes isolés pour la mesure du potentiel zêta et de la taille sont également dilués de la même manière que pour l’analyse NTA.
    1. Suivez les étapes 3.2.1 à 3.2.4 pour diluer les exosomes et effectuer une analyse dynamique de la diffusion de la lumière.
      REMARQUE : La taille et les potentiels zêta de chaque solution (saponine, dopamine, exosome-dopamine) sont analysés séparément.

6. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

REMARQUE : Les quantités de dopamine chargées dans les exosomes sont mesurées par la méthode de chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Pour détecter la présence de dopamine dans la formulation obtenue, les exosomes sont déclenchés par un processus spécial.

  1. Mettez la formulation dans un appareil de chauffage à 75 °C pour qu’elle s’évapore. Ajouter de l’acétonitrile (rapport 50 :50) à la suspension et au vortex. Soniser la solution pendant 10 min.
  2. Centrifuger la solution pendant 10 min à 10 000 × g. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 μm.
  3. Analyser tous les analytes à l’aide d’une colonne C18 à 30 °C à un débit de 1 mL/min (la phase mobile H2O/acétonitrile). Mesurer l’absorbance à 230 nm38.

7. Mesure de la capacité de charge médicamenteuse (DL) et cinétique de libération du médicament in vitro

  1. Capacité de chargement du médicament (DL)
    REMARQUE : La quantité de dopamine chargée dans les exosomes est quantifiée à l’aide de la spectroscopie UV-Vis. L’absorbance est lue à 280 nm. Les surnageants collectés lors de la synthèse sont utilisés pour mesurer la quantité de médicament non chargée. La concentration de dopamine dans le surnageant est déterminée par une courbe d’étalonnage standard de la dopamine.
    1. Préparer une solution mère de 1 mg/mL de dopamine. Préparer des concentrations de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 mg/mL à partir de la solution mère en utilisant de l’eau distillée.
      REMARQUE : Ajouter 0,02% d’acide ascorbique pour la stabilité de la solution de dopamine préparée.
    2. Générez une courbe d’étalonnage standard en mesurant l’absorbance de chaque dilution de dopamine à 280 nm dans un spectrophotomètre UV.
    3. Mesurer l’absorbance du surnageant à 280 nm.
    4. Calculer la capacité de charge médicamenteuse pour la dopamine à l’aide de l’équation (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      REMARQUE : L’analyse est effectuée en trois exemplaires.
  2. Cinétique de libération de médicaments in vitro
    REMARQUE : La cinétique de libération du médicament des exosomes chargés en dopamine est réalisée à l’aide d’une membrane de dialyse. Le PBS, pH 7,4, est utilisé comme milieu de libération pour simuler un microenvironnement physiologique.
    1. Ajouter 1 mL d’exosomes chargés en dopamine à la membrane de dialyse. Placez la membrane dans un bécher. Ajouter 15 mL de PBS dans le bécher.
    2. Prélever 1 mL de milieu antiadhésif dans un bécher à 0,5, 1, 2, 4, 6 et 8 h. À chaque point de temps, remplacez le volume de l’échantillon par du PBS frais. Analysez les échantillons prélevés à des intervalles spécifiés à 280 nm à l’aide d’un spectromètre UV-Vis.
    3. Calculez les résultats à l’aide de l’égaliseur (2)40.
      Rejet (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      NOTA : Une courbe d’étalonnage est préparée pour la détermination de la cinétique de libération du médicament in vitro . La solution de dopamine est préparée à des concentrations de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 et 5,0 mg/mL. La valeur d’absorbance UV de chaque concentration est déterminée à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.

8. Test de cytotoxicité in vitro

  1. Revitalisation et culture de fibroblastes
    1. Retirez les fibroblastes du congélateur à -80 °C. Ensemencez les cellules dans un flacon contenant du DMEM-F12 + 10 % de FBS.
    2. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur contenant 5 % de CO2. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.
    3. Faire passer les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence. Suivez les étapes 1.3 à 1.5. Après centrifugation à 1 500 × g pendant 5 min, retirer le surnageant, ajouter 1 mL de DMEM-F12 + 10 % de FBS et ensemencer 10 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
      1. Ajouter le milieu DMEM-F12 + 10 % de FBS et incuber les cellules à 37 °C pendant 18 h dans un incubateur contenant 5 % de CO2. Changez le milieu des puits à la fin de l’incubation.
    4. Préparez le bouillon de suspension d’exosomes chargée en dopamine. Diluer la formulation d’exosomes chargés en dopamine avec un milieu pour obtenir des concentrations de 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL et 1 000 μL/mL.
    5. Ajouter les concentrations préparées sur les cellules à l’intérieur de chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h dans un incubateur contenant 5 % de CO241.
  2. Test de viabilité des cellules MTT
    REMARQUE : À la fin de l’incubation, les rapports de viabilité des cellules sont déterminés par le test MTT.
    1. Préparez la solution de MTT (5 mg/mL) avec du PBS. Ajouter 10 μL de solution MTT dans chaque puits. Incuber pendant 4 h à 37 °C.
    2. À la fin de l’incubation, ajoutez 100 μL de DMSO dans chaque puits. Incubez les plaques pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité. Mesurer les valeurs d’absorbance dans le lecteur ELISA à 570 nm42,43.
      REMARQUE : Le test de viabilité MTT est effectué en trois exemplaires.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolement et caractérisation des exosomes
Les cellules souches gelées de Wharton sont cultivées et incubées dans un milieu sans sérum pendant 48 h lorsque la culture atteint une densité suffisante. Après la fin de l’incubation, le surnageant est stocké à -20 °C. Les surnageants collectés sont dilués avec du PBS et soumis à une ultracentrifugation (Figure 1). La solution obtenue est analysée par des analyses NTA et DLS. Les exosomes sont stérilisés en passant à travers un...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les exosomes sont de petites vésicules membranaires de dimensions de 40 à 200 nm sécrétées par la plupart des types de cellules, par exemple, les CSM1. Capables de permettre la communication entre les cellules, les exosomes peuvent pénétrer dans les cellules de différentes manières telles que l’endocytose, la phagocytose, la micropinocytose, l’internalisation à médiation lipidique et la fusion33,44. Par rapport à d’autres systèmes nanoport...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les travaux ont été principalement financés par des fonds de recherche fournis par les projets de recherche scientifique de l’Université technique de Yıldız (TSA-2021-4713).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m filtre à membraneAisimoUtilisé pour le processus de stérilisation
0,45 & micro ; Filtre à seringue mAisimoUtilisé pour le processus de stérilisation
15 mL Tube FalconNestUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
25 cm2 flacons de culture cellulaire (Falcon, TPP flacons de culture tissulaireNestUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
50 mL Tube FalconNestUtilisé dans l’étape
de culture cellulaireFioles de culture cellulaire de 75 cm2 (Falcon, fioles de culture tissulaire TPPNestUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
Plaques à 96 puits (Falcon, microplaques TPP)Merck MilliporeUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
AcetonitrileSigma271004-1LUtilisé pour l’analyse HPLC
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilisé pour le processus de stérilisation
Cellule Cabine de cultureHera Safe KSUtilisé pour le processus de culture cellulaire
CentrifugeHitachiCF16RNUtilisé dans l’étape d’isolement des exosomes
Incubateur CO2 avec Safe Cell UVPanasonic Utilisépour le processus de culture cellulaire
Chlorhydrate de dopamine H8502-10GSigmaH8502-10GUtilisé dans le chargement
en dopamine des exosomesMilieu d’aigle modifié de Dulbecco-F12SigmaRNBJ7249Utilisé comme milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal-FBSCapricornFBS-16AIl a été utilisé en ajoutant au milieu de culture cellulaire.
Congélateur -80 ° ; CPanasonicMDF-U5386S-PEPour stocker les cellules et les exosomes qui en résultent
RéfrigérateurPanasonicMPR-215-PEUtilisé pour stocker la culture cellulaire et d’autres matériaux
Chromatographie liquide à haute performance-HPLCAgilent TechnologiesLa présence de dopamine dans le contenu de la formulation obtenue a été étudiée.
Microscope- PrimovertZeissUtilisé pour observer les cellules en culture cellulaire.
Dosage MTTBiomatikUtilisé pour mesurer la viabilité cellulaire
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalUtilisé pour la caractérisation des exosomes
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman CoulterUtilisé dans l’étape d’isolement des exosomes
CompriméPBS Biomatik43602Dans la préparation de la solution PBS
Péniciline/ Solution de streptomycineCapricornPB-SIl a été ajouté au milieu pour éviter la contamination lors de la culture cellulaire.
Aide à la pipetteIsolab
Balance de précision-KernKern-ABJ220-4NMUtilisé dans la préparation de solutions
Q500 SonicatorQsonica, LLCUtilisé pour digérer les exosomes dans l’analyse HPLC
SaponinSigma47036-50G-FIl a été utilisé en l’ajoutant à la solution totale dans le processus de chargement de la dopamine des exosomes.
Spectrostar-Nano-SpectrophotométrieBMG LABTECHUtilisé pour les analyses MTT et de libération de médicaments Programme
package statistiqueSPSS 22
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexUtilisé pour mélanger les solutions de manière homogène
Bain d’eau 37 ° ; C-SenovaSenovaUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
Wharton' s jelly cellules souches mésenchymateusesATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSUtilisé pour la caractérisation des exosomes
de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Syst me de transport d exosomesencapsulation de la dopaminev sicules extracellulairesbarri re h mato enc phaliqueexosomes de la gel e de Whartonsuivi des nanoparticulescentrifugation s quentielleessai de lib ration de m dicamentessai de cytotoxicitessai MTT

Articles connexes