Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus

Résumé

Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.

Résumé

En tant qu’endosymbiote domestique de la mère, Wolbachia infecte de grandes proportions de populations d’insectes. Des études ont récemment rapporté la régulation réussie de la transmission du virus à ARN à l’aide de moustiques transfectés par Wolbachia. Les stratégies clés pour contrôler les virus comprennent la manipulation de la reproduction de l’hôte par incompatibilité cytoplasmique et l’inhibition des transcriptions virales par l’amorçage immunitaire et la concurrence pour les ressources dérivées de l’hôte. Cependant, les mécanismes sous-jacents des réponses des moustiques transfectés par Wolbachia à l’infection virale sont mal compris. Cet article présente un protocole pour l’identification in vitro de l’infection à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines dans les cellules Aa23 d’Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) afin d’améliorer la compréhension des interactions entre Wolbachia et ses insectes vecteurs. Grâce à l’utilisation combinée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la PCR quantitative, du transfert western et des méthodes d’analyse immunologique, un protocole morphologique standard a été décrit pour la détection des cellules infectées par Wolbachia qui est plus précis que l’utilisation d’une seule méthode. Cette approche peut également être appliquée à la détection de l’infection à Wolbachia dans d’autres taxons d’insectes.

Introduction

Le moustique tigre asiatique Aedes albopictus (Skuse) (Diptères: Culicidae), qui est un vecteur clé du virus de la dengue (DENV) en Asie et dans d’autres parties du monde¹, est un hôte naturel de deux types de bactéries intracellulaires, Wolbachia (wAlbA et wAlbB), qui sont réparties dans toute la lignée germinale et le tissu somatique ^2,3. La lignée cellulaire Aa23 dérivée d’embryons d’A. albopictus se compose d’au moins deux types de cellules morphologiques, qui soutiennent tous deux l’infection⁴ et peuvent être guér....

Protocole

1. Matériaux et réactifs

1. Utilisez des solutions et des milieux sans pyrogène pour la culture cellulaire (voir le Tableau des matériaux).
2. Utilisez de l’eau ultrapure pour préparer toutes les solutions.
3. Soyez prudent dans le choix du sérum fœtal bovin (FBS) pour la culture cellulaire, en suivant un processus de vérification du lot.
   REMARQUE: Comme les lots FBS sont sujets à des changements réguliers, il est impossible d’indiquer le catalogue et les numéros de lot pertinents dans ce protocole.
4. Sélectionner des souches de cellules Aa23 dérivées d’œufs d’A. albopictus , correspondant à Aa....

Résultats

Avant la détection de Wolbachia , les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et Aa23-T ont au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique évidente entre les deux types de cellules (Figure 1). Ici, les cellules Aa23 ont été utilisées comme système modèle pour détecter l’infection à Wolbachia en utilisant .......

Discussion

La détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia est essentielle pour l’étude des interactions Wolbachia-hôte et la confirmation de la transfection réussie des cellules avec de nouvelles souches. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines. Ces quatre méthodes expérimentales ont corroboré et amélioré la précision de détection de l’infection à Wolbachia des cel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Boîte de Pétri	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis Logiciel d’analyse	dopé au
cérium développé en interne	MSE Supplies		Substrats monocristallins Ce :Y3Al5O12, YAG
Porte-puce	Logiciel de contrôle développé
Huile	développée
	Cargille Laboratories	16482	Type A faible viscosité 150 cSt
Plateforme inSituX	Source
	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED avec lentille en verre, 1085 nm, 5 mW, anneau extérieur TO-18
	Lasers
;	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW et Oslash ; 9 mm, E Pin Code, Diode Laser
Raspberry Pi	Anneau
	Raspberry Pi Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 Anneau de retenue pour Ø ; Tubes d’objectif et montures
1" Cristal de quartz sans pépins	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25,4 mm de diamètre Coupe en Z 0,05 mm d’épaisseur Polissage double face 8 mm sur -
X Cale	développé
	en interne

en interne par immersion en interne lumineuse IR développée en interne à pompe développés en interne de retenue de fondation Arrêt de faisceau de rayons X