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Article de méthode

La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

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DOI :

10.3791/63664

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28 avril 2022

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1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Dans cet article

Résumé

La spectroscopie de rétrodiffusion neutronique offre un accès non destructif et sans marquage à la dynamique ps-ns des protéines et de leur eau d’hydratation. Le flux de travail est présenté avec deux études sur les protéines amyloïdes: sur la dynamique résolue dans le temps du lysozyme pendant l’agrégation et sur la dynamique de l’eau d’hydratation de tau lors de la formation de fibres.

Résumé

La diffusion neutronique offre la possibilité de sonder la dynamique dans les échantillons pour une large gamme d’énergies d’une manière non destructive et sans marquage autre que le deutérium. En particulier, la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique enregistre les signaux de diffusion à plusieurs angles de diffusion simultanément et est bien adaptée pour étudier la dynamique des systèmes biologiques sur l’échelle de temps ps-ns. En utilisant des composants tampons D2O et éventuellement deutérés, la méthode permet de surveiller à la fois la diffusion du centre de masse et les mouvements du squelette et de la chaîne latérale (dynamique interne) des protéines à l’état liquide.

De plus, la dynamique de l’eau d’hydratation peut être étudiée en utilisant des poudres de protéines perdeutérées hydratées avecH2O. Cet article présente le flux de travail utilisé sur l’instrument IN16B à l’Institut Laue-Langevin (ILL) pour étudier la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation. La préparation d’échantillons de solution et d’échantillons de poudre de protéines hydratées par échange de vapeur est expliquée. La procédure d’analyse des données pour la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation est décrite pour différents types d’ensembles de données (spectres quasi-élastiques ou balayages à fenêtre fixe) qui peuvent être obtenus sur un spectromètre de rétrodiffusion de neutrons.

La méthode est illustrée par deux études portant sur des protéines amyloïdes. L’agrégation du lysozyme en agrégats sphériques de taille μm - notés particules - se produit dans un processus en une étape sur l’espace et la plage temporelle sondés sur IN16B, tandis que la dynamique interne reste inchangée. De plus, la dynamique de l’hydratation de l’eau de tau a été étudiée sur des poudres hydratées de protéines perdeutérées. Il est montré que les mouvements de translation de l’eau sont activés lors de la formation de fibres amyloïdes. Enfin, les étapes critiques du protocole sont discutées quant à la position de la diffusion neutronique par rapport à l’étude de la dynamique par rapport à d’autres méthodes biophysiques expérimentales.

Introduction

Le neutron est une particule massive et sans charge qui a été utilisée avec succès au fil des ans pour sonder des échantillons dans divers domaines allant de la physique fondamentale à la biologie1. Pour les applications biologiques, la diffusion neutronique aux petits angles, la diffusion inélastique des neutrons, la cristallographie et la réflectométrie neutroniques sont largement utilisées 2,3,4. La diffusion inélastique des neutrons fournit une mesure de la dynamique en moyenne d’ensemble sans nécessiter de marquage spécifique en soi, et une qualité de signal qui ne dépend pas de la taille ou de la protéine5. La mesure peut être effectuée en utilisant un environnement très complexe pour la protéine étudiée qui imite le milieu intracellulaire, comme un lysat bactérien deutéré ou même in vivo 3,6,7. Différentes configurations expérimentales peuvent être utilisées pour étudier la dynamique, à savoir i) le temps de vol donnant accès à la dynamique sous-ps-ps, ii) l’accès à la rétrodiffusion donnant accès à la dynamique ps-ns, et iii) l’accès spin-echo-donnant accès à la dynamique de ns à des centaines de ns. La rétrodiffusion neutronique utilise la loi de Bragg 2d sinθ = nλ, où d est la distance entre les plans d’un cristal, θ l’angle de diffusion, n l’ordre de diffusion et λ la longueur d’onde. L’utilisation de cristaux pour la rétrodiffusion vers les détecteurs permet d’obtenir une haute résolution en énergie, typiquement ~0,8 μeV. Pour mesurer l’échange d’énergie, soit un entraînement Doppler transportant un cristal en rétrodiffusion est utilisé pour définir et régler la longueur d’onde neutronique entrante 8,9,10 (Figure 1), soit une configuration de temps de vol peut être utilisée au prix d’une diminution de la résolution d’énergie 11.

figure-introduction-1
Figure 1 : Croquis d’un spectromètre de rétrodiffusion à neutrons avec un entraînement Doppler. Le faisceau entrant frappe le hacheur42 de transformation de l’espace de phase (PST), ce qui augmente le flux à la position de l’échantillon. Il est ensuite rétrodiffusé vers l’échantillon par le lecteur Doppler, qui sélectionne une énergieE1 (flèche cyan). Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon (avec différentes énergies représentées par la couleur des flèches) et les analyseurs, constitués de cristaux de Si 111, ne feront que rétrodiffuser des neutrons avec une énergie spécifique E0 (flèches de couleur rouge ici). Par conséquent, le transfert de quantité de mouvement q est obtenu à partir de la position détectée du neutron sur le réseau de détecteurs, et le transfert d’énergie est obtenu à partir de la différence E1- E0. Le temps de vol prévu pour l’impulsion de neutrons produite par le PST est utilisé pour rejeter le signal des neutrons diffusés directement vers les tubes détecteurs. Abréviation : PST = transformation de l’espace de phase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour la spectroscopie de rétrodiffusion, la principale contribution au signal des échantillons riches en protons d’hydrogène, tels que les protéines, provient de la diffusion incohérente, pour laquelle l’intensité de diffusion Sinc(q, ω) est représentée par Eq (1)12

figure-introduction-2 (1)

Où σinc est la section efficace incohérente de l’élément considéré, k' est la norme du vecteur d’onde diffusé, k la norme du vecteur d’onde entrant, q (= k - k') le transfert de quantité de mouvement, r j(t) le vecteur position de l’atome j au temps t, et ω la fréquence correspondant au transfert d’énergie entre le neutron entrant et le système. Les crochets angulaires indiquent la moyenne de l’ensemble. Par conséquent, la diffusion incohérente sonde l’auto-corrélation d’une seule particule moyenne d’ensemble des positions des atomes avec le temps et donne l’autodynamique moyenne sur tous les atomes du système et différentes origines temporelles (moyenne d’ensemble). La fonction de diffusion est la transformée de Fourier dans le temps de la fonction de diffusion intermédiaire I(q, t), qui peut être vue comme la transformée de Fourier dans l’espace de la fonction de corrélation de van Hove représentée par Eq (2):

figure-introduction-3 (2)

Où ρ(r,t) est la densité de probabilité de trouver un atome à la position r et au temps t 13.

Pour un processus de diffusion de Fickian, la fonction d’autodiffusion résulte (voir Eq (3)) après une double transformée de Fourier dans une fonction de diffusion consistant en un Lorentzien de largeur de droite donnée par γ = Dq2.

figure-introduction-4 (3)

Des modèles plus sophistiqués ont été développés et jugés utiles, tels que le modèle de diffusion de saut de Singwi et Sjölander pour la dynamique des protéines internes ps-ns14 ou le modèle de rotation de Sears pour l’eau d’hydratation15,16,17.

Sur l’instrument de rétrodiffusion de neutrons (NBS) IN16B8,9 à l’ILL, Grenoble, France (Figure supplémentaire S1), une configuration couramment utilisée avec des protéines est constituée de cristaux de Si 111 pour les analyseurs avec un entraînement Doppler pour régler la longueur d’onde entrante (Figure supplémentaire S2A), donnant ainsi accès à la plage de transfert de quantité de mouvement ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 et à la plage de transfert d’énergie de -30 μeV < figure-introduction-5 < 30 μeV-correspondant à des échelles de temps allant de quelques ps à quelques ns et des distances de quelques Å. En outre, IN16B offre la possibilité d’effectuer des balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)10, qui incluent l’acquisition de données lors d’un transfert d’énergie fixe. Comme le flux est limité lorsque l’on travaille avec des neutrons, E/IFWS permet de maximiser le flux pour un transfert d’énergie, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit satisfaisant. Une option plus récente est le spectromètre de rétrodiffusion et de temps de vol (BATS) mode11, qui permet de mesurer une large gamme de transferts d’énergie (par exemple, -150 μeV < figure-introduction-6 < 150 μeV), avec un flux plus élevé qu’avec le lecteur Doppler, mais au prix d’une résolution énergétique inférieure (figure supplémentaire S2B).

Une propriété importante de la diffusion des neutrons est que la section efficace incohérente σinc a une valeur 40 fois plus élevée pour l’hydrogène que pour le deutérium et est négligeable pour d’autres éléments couramment trouvés dans les échantillons biologiques. Par conséquent, la dynamique des protéines dans un environnement liquide peut être étudiée en utilisant un tampon deutérisé, et l’état de la poudre permet l’étude soit de la dynamique interne des protéines avec de la poudre de protéine hydrogénée hydratée avec D2O, soit de l’étude de l’eau d’hydratation pour la poudre de protéine perdeutérée hydratée avecH2O. À l’état liquide, la rétrodiffusion neutronique permet généralement d’accéder simultanément à l’autodiffusion du centre de masse des protéines (diffusion de type fickien) et à leur dynamique interne. Ces derniers sont des mouvements de colonne vertébrale et de chaîne latérale généralement décrits par le modèle dit de diffusion de saut ou d’autres 3,18. Dans les poudres de protéines hydrogénées, la diffusion des protéines est absente et seule la dynamique interne doit être modélisée. Pour l’eau d’hydratation, les contributions des mouvements translationnels et rotationnels des molécules d’eau présentent une dépendance différente du transfert de quantité de mouvement q, ce qui permet leur distinction dans le processus d’analyse des données17.

Cet article illustre la méthode de rétrodiffusion des neutrons avec l’étude des protéines qui se sont avérées capables de se déplier, de s’agréger sous une forme canonique composée d’empilements de brins β - le motif dit de βcroisée 19,20 - et de former des fibres allongées. C’est ce qu’on appelle l’agrégation amyloïde, qui est largement étudiée en raison de son rôle central dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson21,22. L’étude des protéines amyloïdes est également motivée par le rôle fonctionnel qu’elles peuvent jouer 23,24 ou leur fort potentiel pour le développement de nouveaux biomatériaux25. Les déterminants physico-chimiques de l’agrégation amyloïde restent flous, et aucune théorie générale de l’agrégation amyloïde n’est disponible, malgré d’énormes progrès au cours des dernières années21,26.

L’agrégation amyloïde implique des changements dans la structure et la stabilité des protéines avec le temps, dont l’étude implique naturellement une dynamique, liée à la stabilité de la conformation des protéines, à la fonction protéique et au paysage énergétique des protéines27. La dynamique est directement liée à la stabilité d’un état spécifique par la contribution entropique pour les mouvements les plus rapides28, et la fonction protéique peut être maintenue par des mouvements sur différentes échelles de temps de sub-ps pour les protéines sensibles à la lumière29 à ms pour les mouvements de domaine, ce qui peut être facilité par la dynamique picoseconde-nanoseconde30.

Deux exemples d’utilisation de la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique pour étudier les protéines amyloïdes seront présentés, l’un à l’état liquide pour étudier la dynamique des protéines et l’autre à l’état de poudre hydratée pour étudier la dynamique de l’hydratation de l’eau. Le premier exemple concerne l’agrégation du lysozyme en sphères de taille μm (appelées particules) suivies en temps réel5, et le second une comparaison de la dynamique de l’eau aux états natifs et agrégés de la protéine humaine tau31.

Le lysozyme est une enzyme impliquée dans la défense immunitaire et est composé de 129 résidus d’acides aminés. Le lysozyme peut former des particules dans un tampon deutéré à une température de 10,5 et à une température de 90 °C. Avec la diffusion neutronique, nous avons montré que l’évolution temporelle du coefficient de diffusion du centre de masse du lysozyme suit la cinétique exponentielle unique de la fluorescence T de la thioflavine (une sonde fluorescente utilisée pour surveiller la formation de motifs de β croisée amyloïde32), indiquant que les superstructures particulaires de formation et les modèles de β croisée se produisent en une seule étape avec le même taux. De plus, la dynamique interne est restée constante tout au long du processus d’agrégation, ce qui peut s’expliquer soit par un changement conformationnel rapide qui ne peut être observé sur les instruments NBS, soit par l’absence de changement significatif de l’énergie interne des protéines lors de l’agrégation.

La protéine tau humaine est une protéine intrinsèquement désordonnée (PDI) constituée de 441 acides aminés pour l’isoforme dite 2N4R, qui est notamment impliquée dans la maladie d’Alzheimer33. En utilisant la rétrodiffusion neutronique sur des poudres de protéine tau perdeutérée, nous avons montré que la dynamique de l’eau d’hydratation est augmentée à l’état fibreux, avec une population plus élevée de molécules d’eau subissant des mouvements de translation. Le résultat suggère qu’une augmentation de l’entropie de l’eau d’hydratation pourrait conduire la fibrillation amyloïde de tau.

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Protocole

1. Préparer le tampon deutéré pour les protéines à l’état liquide

  1. Dissoudre tous les composants du tampon dans duD2Opur.
  2. Si l’électrode de pH a été étalonnée enH2O, ajuster le selon la formule = pH + 0,4 en utilisant NaOD ou DCl34.
    REMARQUE : L’utilisation deD 2 O au lieu de H2O pourrait avoir une incidence sur la solubilité des protéines et il pourrait être nécessaire d’adapter les conditions tampons (p. ex., par un léger changement de la concentration en sel).

2. Préparer les poudresH2O-hydratées de protéines perdeutérées

  1. Préparez le porte-échantillon.
    1. Nettoyez soigneusement un porte-échantillon plat en aluminium avec son joint en fil d’indium et ses vis avec de l’eau et de l’éthanol et laissez-le sécher.
      REMARQUE: Un porte-échantillon plat est utilisé de manière à ce que la poudre puisse être répartie de manière homogène sur la surface. La quantité de poudre doit être suffisante pour pouvoir être maintenue entre les parois et ne pas tomber lorsque le porte-échantillon est placé verticalement.
    2. Pesez les différentes parties du porte-échantillon - fond, couvercle et fil d’indium - séparément sur une balance de précision.
    3. Placer le joint métallique d’indium de 1 mm dans la rainure de la partie inférieure du porte-échantillon, en laissant un petit chevauchement à l’endroit où les deux extrémités se rejoignent (figure 2A).
    4. Placez une quantité appropriée de protéine lyophilisée (généralement ~ 100 mg de protéines) de telle sorte qu’elle remplisse la surface interne de la partie inférieure du porte-échantillon.
  2. Hydrater la poudre de protéine.
    1. Placer le porte-échantillon dans un dessiccateur avec une boîte de Petri contenant de la poudreP2O5pendant 24 h pour sécher complètement la poudre protéique35 (figure 2B). Peser la partie inférieure sèche du porte-échantillon contenant le joint d’indium et la poudre sèche pour obtenir msec.
      ATTENTION : La poudreP2O5est très corrosive.
    2. Retirez le P 2 O5 du dessiccateur et mettez une boîte de Petri avec D2O à l’intérieur. Contrôler régulièrement la masse de la poudre pour vérifier le niveau d’hydratation h = m hyd/m sec où mhyd et msec sont respectivement la masse de la poudre hydratée et de la poudre sèche.
      REMARQUE: Pour les protéines hautement hydrophobes telles que l’insuline, il peut être nécessaire d’augmenter la température à l’intérieur du dessiccateur pour obtenir une pression de vapeur plus élevée et atteindre le niveau d’hydratation souhaité h.
    3. Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 au moins trois fois pour convertir correctement tous les hydrogènes échangeables en deutérons.
      NOTE: Alternativement, des cycles de lyophilisation et de dissolution en D2O pur peuvent être utilisés pour un meilleur échange H / D à condition que la protéine ne soit pas affectée par celui-ci.
    4. Hydratez la poudre légèrement au-dessus du niveau souhaité, laissez la partie inférieure du porte-échantillon avec le fil d’indium et la poudre hydratée rester sur la balance de précision et attendez que la masse diminue lentement jusqu’à la valeur souhaitée pour obtenir le h cible (généralement 0,2-0,4 si une protéine globulaire de taille moyenne doit être recouverte d’une couche d’hydratation complète).
    5. Placez rapidement le couvercle sur la partie inférieure et fermez d’abord le porte-échantillon avec quatre vis pour arrêter l’échange de vapeur (Figure supplémentaire S3A).
    6. Placez et serrez toutes les vis restantes jusqu’à ce qu’aucun espace ne soit visible entre la partie inférieure et le couvercle (figure supplémentaire S3B).
    7. Pesez le porte-échantillon scellé pour vérifier toute perte d’hydratation potentielle due à des fuites après l’expérience sur les neutrons.

3. Effectuer l’expérience de diffusion de neutrons incohérents

  1. Discutez et revérifiez la configuration de l’instrument nécessaire à l’expérience avec le contact local quelques semaines avant le temps de faisceau assigné.
  2. Préparer l’échantillon à l’état liquide.
    1. Dissoudre la protéine dans le tampon deutéré.
    2. Déterminer le volume approprié de liquide à mettre dans le porte-échantillon à l’aide d’eau (s’assurer qu’il n’y a pas de débordement lorsque le porte-échantillon est fermé; Figure 2C).
      NOTE: Les étapes suivantes (3.3 et 3.4) décrivent une expérience menée sur le spectromètre NBS IN16B à l’ILL8,9, en utilisant un cryofour comme environnement d’échantillonnage. Le système de contrôle des instruments changera d’un instrument à l’autre, mais les principes de fonctionnement restent les mêmes.
  3. Insérez l’exemple.
    1. Sécher soigneusement le bâtonnet d’échantillon (figure 2D) et prélever l’échantillon précédent, le cas échéant, après avoir vérifié que la dose de rayonnement ionisant est inférieure à 100 μSv/h avant de manipuler toute matière (au PEB).
    2. Placer l’échantillon, vérifier le centrage approprié par rapport au centre du faisceau (figure supplémentaire S4) et insérer le bâtonnet d’échantillon dans le four cryogénique (figure 2D). Allumez la pompe à vide pour atteindre moins de 10-3 bars et évacuez l’air à l’intérieur du cryofour en répétant les trois fois suivantes: remplissez le cryofour avec de l’hélium gazeux jusqu’à ce que la pression atmosphérique soit atteinte et retirez à nouveau le gaz à l’aide de la pompe à vide.
      NOTA: Dans le cas d’un porte-échantillon plat, le porte-échantillon doit être orienté à un angle de 45° par rapport au faisceau entrant. La plage de transfert de quantité de mouvement utile pourrait être réduite en raison de l’absorption et de la diffusion par la cellule. Un absorbeur de neutrons puissant tel que le cadmium peut être utilisé pour masquer certaines parties du porte-échantillon (par exemple, des vis, des pièces épaisses).
    3. Introduire de l’hélium gazeux dans le four cryogénique de telle sorte que la pression soit de ~0,05 bar.
  4. Acquérir des données (par exemple, en utilisant NOMAD sur IN16B à l’ILL, on suppose que l’utilisateur préfère une température de 200 K avant d’acquérir un spectre de spectre de neutrons quasi-élastiques (QENS), puis E/IFWS lors d’une rampe de température à 310 K à 0,5 K par minute et enfin un QENS à 310 K).
    1. À l’aide de NOMAD, dans l’onglet exécution , glissez-déposez un contrôleur FurnaceCryostat dans la rampe de lancement. Réglez la température à 200 K. Utilisez le mode rapide et un délai d’attente de 30 minutes pour que la température ait le temps de se stabiliser. Cliquez sur l’icône des flèches rotatives pour l’exécuter en arrière-plan afin que les données puissent être acquises pendant la baisse de température.
    2. Faites glisser et déposez le contrôleur IN16DopplerSettings , définissez le profil de vitesse sur Vitesse précise définie par Max ΔE, une valeur de 0,00 μeV et 128 canaux pour obtenir une configuration EFWS.
    3. Faites glisser et déposez un contrôleur de comptage , remplissez le champ Sous-titres avec un nom qui permet une identification facile des données et définissez 60 répétitions de 30 s de balayage (figure supplémentaire S5A).
    4. Faites glisser et déposez un contrôleur IN16DopplerSettings , définissez le profil de vitesse sur Sine défini par Speed avec une valeur de 4,5 m/s et 2 048 canaux pour obtenir une configuration QENS.
    5. Faites glisser et déposez un contrôleur de comptage avec 4 répétitions de 30 minutes de balayage (figure supplémentaire S5B).
    6. Pour la rampe de température, glissez-déposez un contrôleur FurnaceCryostat , réglez la température sur 310 K, réglez Ramp sur SetPoint avec Δ = 0,05 K et 6 s. Utilisez un temps sur 220 min (figure supplémentaire S6A).
    7. Utilisez une boucle for avec 65 répétitions. À l’intérieur, insérez un contrôleur IN16DopplerSettings comme à l’étape 3.4.2, suivi d’un seul compte de 30 s. Ensuite, insérez IN16DopplerSettings, comme décrit précédemment, mais en utilisant un décalage d’énergie de 1,5 μeV et 1 024 canaux suivis d’un seul comptage de 3 min (figure supplémentaire S6B).
    8. Pour acquérir le dernier QENS à 310 Ko, faites glisser et déposez les contrôleurs IN16DopplerSettings et Count configurés comme décrit aux étapes 3.4.4 et 3.4.5, respectivement.
    9. Appuyez sur le bouton de démarrage (triangle rectangle en bas de la fenêtre) pour exécuter le script.
      NOTE: Chaque expérience nécessitera l’acquisition de données d’étalonnage; c’est-à-dire la cellule vide pour les corrections de soustraction ou d’absorption, le tampon seul aux différentes températures utilisées pour modéliser le bruit de fond, et une mesure du vanadium (ou de manière équivalente, l’échantillon à une température de 10 K ou moins) pour obtenir la fonction de résolution de l’instrument.

4. Analyse des données - QENS

  1. Importez le jeu de données à l’aide de la méthode 'IN16B_QENS.process()' dans le logiciel Python nPDyn v3.x36
    >>>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS

    >>> échantillon = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... format>]
    ... ). processus()

    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Effectuez des corrections de données (facultatif) à l’aide des commandes suivantes (reportez-vous à la documentation de nPDyn pour plus d’informations, Figure 3) :
    #it est supposé que les données pour les cellules vides, le vanadium et le tampon
    # ont déjà été importés dans un ensemble de données appelé 'empty_cell', 'vanadium',
    # et 'buffer', respectivement.

    # pour la soustraction de cellules vides avec un facteur d’échelle
    # (les erreurs se propagent automatiquement)
    >>> échantillon = échantillon - 0,95 * empty_cell

    # pour correction à l’aide du coefficient de Paalman-Ping
    # (mutuellement exclusif avec l’exemple ci-dessus)
    >>> sample = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # pour la normalisation
    >>> échantillon = sample.normalize(vanadium)

    # pour le regroupement le long de l’axe observable
    # observable est le temps d’agrégation ici
    >>> échantillon = échantillon.bin(3, axe = 0)
  3. Ajustez les données d’étalonnage. Les ensembles de données - échantillons, cellule vide, tampon deutéré (si nécessaire) et vanadium - peuvent être ajustés à l’aide de modèles intégrés ou d’un modèle défini par l’utilisateur (voir la documentation nPDyn) :
    >>> de l’importation nPDyn.models.builtins (
    ... modèlePVoigt,
    ... modèleEau,
    ... modèleCalibratedD2O,
    ...     )

    # Les modèles intégrés utilisent un vecteur colonne de la quantité de mouvement
    # Transférer les valeurs Q
    >>> q = vanadium.q[:, Aucun]

    # le vanadium est monté à l’aide d’un profil pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Utilisez le modèle intégré pour l’eau d’hydratation appelé « modelWater ». Ce modèle se lit comme indiqué par Eq (4)17
    figure-protocol-1 (4)
    Où a0, ar et at sont des scalaires représentant la contribution relative du signal élastique, des mouvements de rotation et des mouvements de translation, respectivement; j1(qd) est la fonction de Bessel sphérique du lème ordre, q étant le transfert de quantité de mouvement; d la distance O-H dans la molécule d’eau; δ(ω) est le delta de Dirac, qui est multiplié ici par l’EISF; N est l’ordre le plus élevé de la fonction de Bessel sphérique utilisée (typiquement ~5); figure-protocol-2 et sont respectivement les mouvements de rotation et figure-protocol-3 de translation lorentziens; b(q) est un terme de fond plat. Les fonctions de Bessel sphériques donnent la contribution relative de chaque état de moment angulaire des molécules d’eau, et le nombre N est déterminé sur la base de la gamme q de transfert de quantité de mouvement. Dans le cas d’un spectromètre NBS typique, les termes jusqu’à N = 4 expliquent presque entièrement le signal (figure supplémentaire S7).
    # ici, l’équation 2 est utilisée pour l’eau d’hydratation
    # convolution avec fonction de résolution et ajout de
    # L’arrière-plan D2O se fait automatiquement avec le
    # arguments fournis
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadium,
    ... bkgd=tampon,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTE: Les contributions des mouvements de rotation et de translation doivent être alambiquées pour être parfaitement rigoureuses. Le succès d’un modèle additif doit être attribué à la présence de populations distinctes d’eau à la surface des protéines et à la gamme énergétique limitée accessible.
  5. Utilisez ce qui suit pour tracer les données (Figure 4) :
    >>> à partir du tracé d’importation nPDyn.plot
    >>> parcelle (échantillon)

5. Analyse des données - rampe de température, balayage élastique à fenêtre fixe (EFWS)

  1. Utilisez une procédure similaire à la section 4 pour normaliser les données de la rampe de température par le signal à la température la plus basse (généralement 10 K) :
    >>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> échantillon = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). processus()

    # normalisation avec les 5 premiers points sur l’observable
    # axe, qui correspondent à la température
    >>> échantillon /= échantillon[:5].moyenne(0)

    # La plage Q de transfert de quantité de mouvement utilisée ici est plus petite
    # car le modèle utilisé n’est valable que pour le Q faible
    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,2, 0,8)
  2. Utilisez un modèle gaussien simple pour commencer, dont la largeur est donnée par ce que l’on appelle le déplacement carré moyen (MSD). Générez et ajustez le modèle à l’aide des commandes suivantes :
    >>> importer numpy en tant que np
    >>> à partir de nPDyn.models importer Paramètres, Modèle, Composant

    # a est un facteur d’échelle
    >>> params = Paramètres(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modèle = Modèle(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... « gaussien »,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Aucun])

    >>> parcelle (échantillon)
    REMARQUE: L’approximation gaussienne est toujours valable pour q2MSD << 1, mais une plage de transfert de quantité de mouvement plus large peut être utilisée pour la comparaison relative entre échantillons. Des modèles plus sophistiqués, qui vont au-delà de l’approximation gaussienne, ont été développés37,38,39.

6. Analyse des données - balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)

  1. Comme à l’étape 4, importez le jeu de données, mais à l’aide de la classe 'IN16B_FWS' :
    >>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> échantillon = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). processus()

    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Ajustez les données d’étalonnage et les données d’échantillonnage.
    1. Analyser les données E/IFWS à l’aide d’un MSD40 généralisé ou en les considérant comme des spectres QENS grossiers (n’ayant que quelques points de données sur l’axe de l’énergie). Lorsque E/IFWS est considéré comme un QENS grossier, les modèles utilisés pour QENS sont utilisés pour ajuster l’ensemble de données E/IFWS à la fois (ajustement global des transferts d’énergie et des transferts de quantité de mouvement).
      REMARQUE: Cette dernière solution - utilisant des modèles pour QENS sur les données E/IFWS - est utilisée ici où la dépendance au transfert de quantité de mouvement de la diffusion du centre de masse et de la dynamique interne des protéines est imposée.
    2. Modélisez la dynamique des protéines dans les liquides en utilisant l’Eq (5) suivant ('modelProteinJumpDiff' dans nPDyn):
      figure-protocol-4 (5)
      où R(q,ω) est la fonction de résolution; β un scalaire indépendant pour chaque transfert de quantité de mouvement q; a0 est le facteur de structure incohérente élastique (EISF); figure-protocol-5 un Lorentzien tenant compte de la diffusion du centre de masse avec une largeur donnée par Eq (6); figure-protocol-6 est un Lorentzien qui inclut la diffusion du centre de masse et une contribution suivant le modèle de saut-diffusion14 tenant compte de la dynamique interne (Eq (7); figure-protocol-7 étant le signal ajusté de D2O redimensionné par sa fraction volumique dans l’échantillon.
      γ = Dsq 2 (6)
      Ds étant le coefficient d’autodiffusion.
      figure-protocol-8 (7)
      Di étant le coefficient de diffusion apparent pour la dynamique interne et τ un temps de relaxation pour les mouvements diffusifs.
      >>> de l’importation nPDyn.models.builtins (
      ... modèlePVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modèleCalibratedD2O,
      ... )

      # Les modèles intégrés utilisent un vecteur colonne de la quantité de mouvement
      # Transférer les valeurs Q
      >>> q = vanadium.q[:, Aucun]

      # le vanadium est monté à l’aide d’un profil pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # pour le D2O pur, un modèle avec une largeur de ligne calibrée
      # pour différentes températures est inclus dans nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # ici, l’équation 3 est utilisée pour les échantillons liquides
      # convolution avec fonction de résolution et ajout de
      # L’arrière-plan de D2O se fait automatiquement avec les # arguments fournis
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadium,
      ... bkgd=tampon,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Tracez les données ajustées en utilisant:
    >>> à partir du tracé d’importation nPDyn.plot
    >>> parcelle (échantillon)

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Résultats

L’agrégation du lysozyme en particules a été réalisée à 90 °C avec une concentration protéique de 50 mg/mL dans un tampon deutéré (0,1 M NaCl à 10,5). La formation de particules est déclenchée par l’augmentation de la température jusqu’à 90 °C et se produit dans les 6 heures (figure supplémentaire S8). L’acquisition des données a été effectuée sur IN16B, comme décrit dans le protocole ci-dessus (les données sont conservées en permanence par le PEB et accessibles au http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04...

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Discussion

La spectroscopie neutronique est la seule méthode qui permet de sonder la dynamique ps-ns moyenne d’ensemble des échantillons de protéines, quelle que soit la taille de la protéine ou la complexité de la solution lorsque la deutération est utilisée6. Plus précisément, en sondant l’autodiffusion d’assemblages protéiques en solution, la taille hydrodynamique de ces assemblages peut être déterminée sans ambiguïté. Néanmoins, la méthode est généralement limitée par le faible flux de neutrons, ce qui i...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Michaela Zamponi du Jülich Centre for Neutron Science du Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Allemagne, pour une partie des expériences de diffusion neutronique menées sur l’instrument SPHERES. Ces travaux ont bénéficié des activités du consortium Deuteration Laboratory (DLAB) financé par l’Union européenne dans le cadre des contrats HPRI-2001-50065 et RII3-CT-2003-505925, et de l’activité financée par le UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) au sein de l’Institut Laue Langevin EMBL DLAB sous les subventions GR/R99393/01 et EP/C015452/1. Le soutien apporté par la Commission européenne au titre du 7e programme-cadre par l’intermédiaire de l’action clé « Renforcer l’Espace européen de la recherche, infrastructures de recherche » est reconnu [Contrat 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot et Christian Beck remercient le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche (BMBF, numéro de subvention 05K19VTB) pour le financement de leurs bourses postdoctorales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Porte-échantillonen aluminium Non disponible dans le commerce. Soit le contact local sur l’instrument peut les fournir, soit ils peuvent être fabriqués sur la base d’un dessin technique qui peut être fourni par le contact local.
Chlorure de deutérium, 35 % en poids dans D2O, &ge ; 99 atomes % DSigma-Aldrich
543047
Oxyde de deutérium (D, 99,9 %)EurisotopDLM-4DR-PK
Graisse silicone sous vide poussé Dow CorningSigma-AldrichZ273554-1EA
Éthanol 96 %, EMSURE Reag. Ph EurSigma-Aldrich1.5901
Dessiccateur en verreVWR  ; 75871-660
Plaque de dessiccateur en verre, 140 mmVWR89038-068
Fil d’indium, 1,0 mm (0,04 in) dia, Puratronic, 99,999 %Alfa Aesar00470.G1
Lysozyme de blanc d’œuf de poule dialysé, lyophilisé, poudre, ~100 000 U/mgSigma-Aldrich62970
nPDynv3.xvoir github.com/kpounot/nPDyn, fonctions du modèle pour raccord également inclus dans le logiciel
OHAUS AX324 Balance Adventurer, étalonnage interneDutscher92641
Pentoxyde de phosphore, ReagentPlus, 99 %Sigma-Aldrich214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 &mu ; LStarlabS7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1 000 &mu ; LStarlabS7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 &mu ; LStarlabS7100-2200
Pointe de pipette TipOne 1,000 &mu ; LStarlabS1111-6001
Pointe de pipette TipOne 10 &mu ; LStarlabS1111-3200
Pointe de pipette TipOne 200 &mu ; LStarlabS1111-0206
Solution de deutéroxyde de sodium, 40 % en poids dans D2O, 99,5 % d’atomesD Sigma-Aldrich372072

Références

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La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation
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