Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Résumé

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Résumé

Le cuivre(II) est un métal essentiel dans les systèmes biologiques, conférant des propriétés chimiques uniques aux biomolécules avec lesquelles il interagit. Il a été rapporté qu’il se lie directement à une variété de peptides et joue des rôles à la fois nécessaires et pathologiques allant de la structure médiatrice aux propriétés de transfert d’électrons en passant par la transmission de la fonction catalytique. La quantification de l’affinité de liaison et de la thermodynamique de ces complexes Cu(II)-peptide in vitro donne un aperçu de la force motrice thermodynamique de la liaison, des compétitions potentielles entre différents ions métalliques pour le peptide ou entre différents peptides pour Cu(II), et de la prévalence du complexe Cu(II)-peptide in vivo. Cependant, la quantification de la thermodynamique de liaison peut être difficile en raison d’une myriade de facteurs, y compris la prise en compte de tous les équilibres concurrents dans une expérience de titrage, en particulier dans les cas où il y a un manque de poignées spectroscopiques discrètes représentant le peptide, l’ion métallique d-bloc et leurs interactions.

Ici, un ensemble robuste d’expériences est fourni pour la quantification précise de la thermodynamique des peptides Cu(II). Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique en présence et en l’absence de ligands chromophoriques pour fournir la poignée spectroscopique nécessaire sur Cu(II) et l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme sans étiquette. Dans les deux techniques expérimentales, un processus est décrit pour tenir compte de tous les équilibres concurrents. Bien que cet article se concentre sur le Cu(II), l’ensemble d’expériences décrites peut s’appliquer au-delà des interactions Cu(II)-peptide et fournir un cadre pour une quantification précise d’autres systèmes métal-peptide dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Introduction

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction¹. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (R....

Protocole

1. Spectroscopie d’absorption électronique : titrage direct avec compétition tampon

1. Préparation des échantillons
   1. Préparer une solution tamponnée de 50 mM de 2-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol (bisTris) à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminer les ions métalliques traces en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration ultérieure.
   2. Dissoudre ou diluer une quantité connue du peptide dans le tampon sans métal.
      REMARQUE: Lors de la surveillance des bandes d-d avec de petits coefficients d’extinction²¹, des conce....

Résultats

L’objectif était de quantifier et de corroborer la thermodynamique de la liaison du Cu(II) au peptide C en utilisant les techniques complémentaires de spectroscopie d’absorption électronique et d’ITC. En raison de la nature robuste de la spectroscopie d’absorption électronique, un titrage direct de Cu(II) en peptide C de 300 μM a été effectué (Figure 1). L’ajout de 150 μM de Cu(II) a provoqué une augmentation immédiate de la bande à 600 nm, attribuée à la bande d-d de Cu(II), et a continué d.......

Discussion

Cet article fournit une méthode robuste pour quantifier l’affinité et la thermodynamique de la liaison cu(II) aux peptides. Les complexes avec Cu(II) sont parfaitement adaptés pour surveiller la bande d’absorption d-d sur le site métallique en raison de sa configuration électronique d⁹ . Bien que le coefficient d’extinction soit faible, nécessitant ainsi de plus grandes concentrations du complexe pour produire un signal fiable, les titrages de Cu(II) en peptide peuvent rapidement fournir un aperçu de la stœchi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,10-phénanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris tampon	Fisher	BP301-100
Membrane de 0,45 micron	Nalgene	296-4545	Tout système de filtration qui élimine la résine sans introduire de contaminants est acceptable
Chlorure de cuivre(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Spectrophotomètre d’absorption électronique	Varian	Cary 5000	Un autre spectrophotomètre sensible approprié est acceptable
en résine de haute affinité	Sigma Aldrich	C7901-25G
Calorimètre de titrage isotherme (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Logiciel
	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76 : 137&ndash ; 148) peut également être utilisé
Logiciel ITC	TA Instruments	ITCRun
essuie-glace délicat léger	Kimwipe	34155
seringue de chargement	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
cuvettes appariées	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20 Assurez-vous	que la fenêtre de la cuvette de petit volume correspond à la hauteur du faisceau du spectrophotomètre
Tampon MOPS Logiciel	Alfa Aesar	A12914
	Cary	WinUV Scan
Tableur	Microsoft	Excel	Tout tableur approprié fonctionnera
seringue de titrage	TA Instruments	5346
eau ultrapure	Millipore Sigma	Milli-Q	Toute eau est acceptable tant que >18 MΩ résistance

d’analyse ITC à faible volume de spectrophotomètre