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Article de méthode

Établir les organoïdes de la dent humaine comme un outil puissant pour la recherche mécaniste et la thérapie régénérative

4K vues

DOI :

10.3791/63671

13 avril 2022

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de dents humaines. Les organoïdes sont solidement extensibles et récapitulent les cellules souches épithéliales de la dent, y compris leur capacité de différenciation des améloblastes. Le modèle organoïde unique fournit un outil prometteur pour étudier la biologie dentaire humaine (cellules souches) avec des perspectives pour les approches régénératrices des dents.

Résumé

Les dents sont d’une importance clé dans la vie non seulement pour la mastication des aliments et la parole, mais aussi pour le bien-être psychologique. Les connaissances sur le développement des dents humaines et la biologie sont rares. En particulier, on ne sait pas grand-chose sur les cellules souches épithéliales de la dent et leur fonction. Nous avons réussi à développer un nouveau modèle organoïde à partir de tissu dentaire humain (c.-à-d. follicule dentaire, isolé à partir de dents de sagesse extraites). Les organoïdes sont extensibles de manière robuste et à long terme et récapitulent le compartiment proposé des cellules souches épithéliales de la dent humaine en termes d’expression des marqueurs ainsi que d’activité fonctionnelle. En particulier, les organoïdes sont capables de déployer un processus de différenciation des améloblastes comme cela se produit in vivo au cours de l’amélogenèse. Ce modèle organoïde unique fournira un outil puissant pour étudier non seulement le développement des dents humaines, mais aussi la pathologie dentaire, et pourrait ouvrir la voie à une thérapie régénérative des dents. Remplacer les dents perdues par une dent biologique basée sur ce nouveau modèle organoïde pourrait être une alternative attrayante à l’implantation standard actuelle de matériaux synthétiques.

Introduction

Les dents ont des rôles essentiels dans la mastication des aliments, la parole et le bien-être psychologique (image de soi). La dent humaine est constituée de tissus hautement minéralisés de densité et de dureté variables1. L’émail dentaire, le composant principal de la couronne dentaire, est le tissu le plus minéralisé du corps humain. Au cours de la formation de l’émail (amélogenèse), lorsque les dents se développent, les cellules souches épithéliales dentaires (DESC) se différencient en cellules formant l’émail (améloblastes). Une fois formé, l’émail est rarement réparé ou renouvelé en raison de la perte apoptotique des améloblastes au début....

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de recherche UZ/KU Leuven (13/0104U). Les troisièmes molaires extraites (dents de sagesse) ont été obtenues après le consentement éclairé des patients.

1. Préparatifs

  1. Préchauffer une plaque de culture de 48 puits pendant 15-20 h dans un incubateur àCO 2 à 1,9% à 37 °C.
  2. Liquéfier une aliquote de Matrigel (facteur de croissance réduit; sans phénol rouge; en outre appelée matrice de membrane basale; BMM) sur glace (4 °C) pendant au moins 2 h avant l’étape 2.1.
    REMARQUE: Évitez les cycles de gel / dégel du BMM. Liquéfie....

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Résultats

Développement organoïde dentaire
Nous fournissons un protocole détaillé pour établir des cultures organoïdes à partir de tissu DF humain acquis à la suite d’une extraction de dents de sagesse (Figure 1A). Le DF isolé est dissocié enzymatiquement et mécaniquement. Les cellules obtenues sont cultivées dans le BMM dans des milieux qui ont été définis empiriquement pour un développement et une croissance organoïdes optimaux (milieu organoïde de la dent; TOM).......

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Discussion

Ce protocole décrit la génération efficace et reproductible d’organoïdes à partir de la dent humaine. À notre connaissance, il s’agit de la première méthodologie permettant d’établir des organoïdes à concept actuel (épithéliaux) à partir de tissu dentaire humain. Les organoïdes sont extensibles à long terme et présentent un phénotype de tige épithéliale dentaire, dupliquant les DESC précédemment signalés dans le compartiment ERM du DF7. De plus, les organoïdes reproduisent les caractéristiques fon.......

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Déclarations de divulgation

L’auteur correspondant s’assure que tous les auteurs ont divulgué tous les conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à tous les membres du personnel de la chirurgie buccale et maxillo-faciale (MKA) de l’UZ Leuven, ainsi qu’aux patients, pour leur aide inestimable dans la collecte des troisièmes molaires fraîchement extraites. Nous tenons également à remercier la Dre Reinhilde Jacobs et la Dre Elisabeth Tijskens pour leur aide dans la collecte d’échantillons. Ce travail a été soutenu par des subventions de la KU Leuven (BOF) et de FWO-Flanders (G061819N). L.H. est titulaire d’un doctorat FWO (1S84718N).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,5 mL Tube à centrifugerEppendorf30120.086
15 mL Tube à centrifugerCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
Plaques à fond plat 48 puitsCorning3548
50 mL Tube à centrifugerCorning430290
A83-01Sigma-Aldrich
AgaroseLonza50004
Albumine bovine (qualité culture cellulaire)Serva47330.03
Anticorps AMELXSanta Cruzsc-365284
Amphotéricine BGibco15200018
B27 (sans vitamine A)Gibco12587-010
CassetteVWR
Catalase du foie bovinSigma-AldrichC100
CD44anticorps Abcamab34485
Passoire cellulaire, 40 & micro ; mFalcon352340
Toxine cholériqueSigma-AldrichC8052
Acide citriqueSigma-AldrichC0759
CK14anticorps Thermo Fisher ScientificMA5-11599
Colgénase IVGibco17104-019
Verre de couvertureVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 sans FeInvitrogen074-90715A
DMEM en poudre haute teneur en glucoseGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Sérum d’âneSigma-AldrichD9663 - 10ML
Station d’encastrement, 220 à 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Éthanol absolu, &ge ; 99,8 % (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= FGF de base)R& D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTComprend 1 % de &beta ;-mercaptoéthanol dissous dans un tampon de lyse
Pipette Pasteur en verreNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (inhibiteur de ROCK, RI)Sigma-Aldrich688001
Insuline du pancréas bovinSigma-AldrichI6634
Anticorps ITGA6Sigma-AldrichHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (à facteur de croissance réduit ; sans rouge de phénol)Lamede microscope 15505739
Corning Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Unité de filtre à seringue, 0,22 &mu ; mMilliporeSLGV033R
Minimum essentiel moyen aigle (&alpha ; MEM)Sigma-AldrichM4526
souris IgG (Alexa 555) anticorps secondaireThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acétyl L-cystéineSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
Anticorps P63Abcamab124762
Stylo PapSigma-AldrichZ377821-1EAStylo de marquage
Paraformaldéhyde (PFA), 16 %Merck8.18715
Pénicilline G sel de sodiumSigma-AldrichP3032
Pénicilline-streptomycine (Pen/Streptomycine)Gibco15140-122
Boîtede PétriCorning353002
Pipette saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010-015
(P20, P200, P1000)Eppendorf ou autres2231300006
Pipette de transfert en plastique (3.5  ; mL)Sarstedt86.1171.001
Anticorps secondaire IgG de lapin (Alexa 488)Thermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Scalpel (lame chirurgicale)Swann-Morton207
SHHR& D Systems464-SH-200
Moules en silicone (Bloc chauffant)VWR720-1918
Chlorure de sodium (NaCl)BDH102415K
Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)Merck106329
Pyruvate de sodium (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
Anticorps SOX2Abcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificSystème de PCR en temps réel
Stericup-GP, 0.22 µ ; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Unité de filtration supérieure pour tube de centrifugation stérile, 0,22 &mu ; mMilliporeSCGP00525
Stérile 1000 &mu ; L pointes de pipette avec filtreGreiner740288
Stérile 20 &mu ; L pointes de pipette avec filtreGreiner774288
Stérile 200 &mu ; Pointes de pipette en L avec et sans filtreGreiner739288
Stérile H2OFreseniusB230531
Sel de sulfate de streptomycineSigma-AldrichS6501
Superscript III supermix de synthèse premier brinInvitrogen11752-050Kit de transcription inverse
Processeur de tissusThermo Scientific
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield support de montage+DAPILabconsult NVH-1200Milieu de montage anti-décoloration avec DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xylènes, 99 %, pour la biochimie et l’histologieVWR2,89,75,325
SML0788720219112505356

Références

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Organo des dentairesfollicule dentairecellules souches pith lialesdiff renciation des loblastesformation de l mailculture d organo desmatrice de membrane basaler g n ration dentairebiologie des cellules souchesexpression des marqueurs