Le protocole présente une méthode permettant de dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus pulmonaires primaires, d’élargir les organoïdes pulmonaires et d’induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénopient fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines.
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Article de méthode
Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’absence d’un modèle in vitro robuste de l’épithélium respiratoire humain entrave la compréhension de la biologie et de la pathologie du système respiratoire. Nous décrivons un protocole défini pour dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de cellules souches adultes dans le tissu pulmonaire et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires. Les organoïdes pulmonaires sont ensuite étendus consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont utilisés pour simuler morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde robuste de l’épithélium des voies respiratoires humaines. L’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires et des organoïdes différenciés des voies respiratoires génère une source stable et renouvelable, permettant aux scientifiques de reconstruire et d’étendre les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines dans les boîtes de culture. Le système organoïde pulmonaire humain fournit un modèle in vitro unique et physiologiquement actif pour diverses applications, y compris l’étude de l’interaction virus-hôte, le dépistage de médicaments et la modélisation de la maladie.
Introduction
Les organoïdes sont devenus un outil robuste et universel pour la modélisation in vitro du développement d’organes et l’étude de la biologie et de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture défini par un facteur de croissance, les cellules souches adultes (ASC) d’une variété d’organes peuvent être étendues en 3 dimensions (3D) et auto-assemblées en grappes cellulaires semblables à des organes composées de plusieurs types de cellules, appelées organoïdes. Le laboratoire de Clevers a rapporté la dérivation du premier organoïde dérivé de l’ASC, l’organoïde intestinal humain, en 2009 1,2<....
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Protocole
Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits dans le présent document ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 et UW21-695). Le consentement éclairé des patients a été obtenu avant le prélèvement de tissus.
1. Dérivation d’organoïdes pulmonaires humains
- Préparation de matériel expérimental
- Préparer le milieu basal en complétant le milieu DMEM/F12 avancé avec 2 mM de glutamine, 10 mM d’HEPES, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
- Préparer le milieu d’expansion org....
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Résultats
Ce protocole permet la dérivation d’organoïdes pulmonaires humains avec un taux de réussite élevé. Le tissu pulmonaire humain frais est haché en petits morceaux, puis décomposé avec de la collagénase. Les cellules uniques résultantes sont incorporées dans la matrice du sous-sol et incubées dans le milieu d’expansion organoïde pulmonaire complété par un cocktail de facteurs de niche pour l’excroissance des cellules souches épithéliales (étape 1.1.2). La figure 1 montre la microphotographie de.......
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Discussion
Les voies respiratoires humaines sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également connu sous le nom d’épithélium cilié pseudostratifié. Les principaux types de cellules de l’épithélium des voies respiratoires supérieures sont les cellules ciliées qui permettent le mouvement coordonné de leurs cils apicals pour expulser le mucus et les particules inhalées des voies respiratoires, les cellules gobelet qui produisent et sécrètent du mucus et les cellules basales qui tapissent la membrane basale et sont impl.......
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Déclarations de divulgation
J. Z., C.L. et M.C.C. sont répertoriés comme inventeurs sur le brevet des organoïdes des voies respiratoires (numéro de publication: US-2021-0207081-A1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions le Centre des sciences panoromiques et de l’unité de microscope électronique, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong, pour son aide en imagerie confocale et en cytométrie en flux. Ce travail a été en partie soutenu par le financement du Fonds de recherche médicale et de santé (HMRF, 17161272 et 19180392) du Bureau de l’alimentation et de la santé; Fonds général de recherche (GRF, 17105420) du Conseil des subventions de recherche; et Health@InnoHK, Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la Région administrative spéciale de Hong Kong.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs pour la culture d’organoïdes pulmonaires | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | ||
| 12634010-A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Bottom Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80 % |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin &beta ;-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-acétylcystéine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1,25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (moyen conditionnel) | fait | maison-10x | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µ ; g/mL |
| Rsrépondin1 (moyen conditionnel) | fait | maison-10x | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µ ; M |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 & micro ; M |
| Différenciation proximale moyenne | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µ ; M |
| Heparine Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 & micro ; g/mL |
| de solution mère d’hydrocortisone | StemCell Technology | 7925 | 1 & micro ; M |
| PneumaCult-ALI 10X Supplément | d’interface air-liquide | ||
| PneumaCult-ALI Milieu basal | StemCell Technology | 05001 | interface air-liquide milieu basal |
| PneumaCult-ALI Supplément | d’entretien d’interface air-liquide Supplément d’entretien | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µ ; M |
| Equipment | |||
| Enceinte de sécurité biologique | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 ou 800 | Microscope confocal | Zeiss | |
| Incubateur CO2 | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stéréomicroscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Pipette sérologique | Eppendorf | ||
| Logiciel ZEN noir ou ZEN bleu Logiciel | d’analyse | Zeiss | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| Plaque de culture cellulaire 12 puits | Cellstar | 665970 | |
| Tubes coniques de 15 et 50 ml | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| Plaque de culture cellulaire 24 puits | Cellstar | 662160 | |
| 6,5 mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Unité de filtre pour seringue médicale, 0,22 & micro ; m | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Tubes à microfuges | Eppendorf | ||
| Embouts de micropipette | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pipette Pasteur en verre | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Pipettes sérologiques (5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Anticorps > | |||
| Chèvre Anti-souris Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Chèvre Anti-Souris, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Chèvre Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Souris Anti-Cytokératine 5 | Abcam | ab128190 | |
| Souris Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Souris Anti-Mucine 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Souris Anti-&beta ;-tubuline 4 | Sigma | T7941 | |
| Lapin Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Anti-utéroglobine chez le rat/CC-10 | R& D Systems | MAB4218-SP | |
| strong>Autre réactif | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | enzyme de dissociation |
Références
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. S....
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Réimpressions et autorisations
