Article de méthode

Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

DOI :

10.3791/63706

⸱

15 février 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons un protocole pour détecter la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et plus précise, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.

Résumé

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La motilité bactérienne est cruciale pour la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments. La motilité bactérienne est cruciale pour l’invasion et/ou la dissémination de nombreuses espèces pathogènes. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène, le pH et la température, peuvent affecter la croissance bactérienne et l’expression des flagelles bactériens. Cela peut entraîner une réduction de la motilité ou même une perte de motilité, ce qui entraîne une évaluation inexacte de la motilité bactérienne. Sur la base de la réaction de couleur du chlorure de 2,3,5-triphényle tétrazolium (TTC) par les déshydrogénases intracellulaires de bactéries vivantes, le TTC a été ajouté à la gélose semi-solide traditionnelle pour la détection de la motilité bactérienne. Les résultats ont montré que cette méthode de gélose semi-solide TTC pour la détection de la motilité bactérienne est simple, facile à utiliser et n’implique pas de gros instruments coûteux. Les résultats ont également montré que la motilité la plus élevée a été observée en milieu semi-solide préparé avec de la gélose à 0,3%. Par rapport au milieu semi-solide traditionnel, les résultats sont plus faciles à évaluer et plus précis.

Introduction

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La motilité bactérienne joue un rôle essentiel dans la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments1. La motilité bactérienne est étroitement associée à la pathogénicité et est nécessaire à la colonisation bactérienne lors de l’infection précoce des cellules hôtes2. La formation de biofilm est étroitement liée à la motilité bactérienne, où les bactéries adhèrent à la surface des milieux solides par motilité. La motilité bactérienne a longtemps été considérée comme positivement corrélée à la formation de biofilm. Un degré élevé de résistance bactérienne aux médicaments dû au biofilm peut entraîner des infections persistantes qui constituent une menace pour la santé humaine 3,4,5. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Le test de motilité bactérienne est principalement utilisé pour examiner la motilité de différentes formes de bactéries à l’état vivant, ce qui peut déterminer indirectement la présence ou l’absence de flagelles et, par conséquent, joue un rôle important dans l’identification des bactéries.

Il existe des méthodes directes et indirectes pour détecter la motilité bactérienne6. Comme les bactéries avec flagelles montrent la motilité, il est possible de détecter si les bactéries sont mobiles indirectement en détectant la présence ou l’absence de flagelles. Par exemple, il est possible de détecter la motilité indirectement par microscopie électronique et coloration flagellaire pour indiquer que les bactéries sont mobiles. Il est également possible de détecter par des méthodes directes, telles que la chute de suspension et les méthodes de ponction semi-solide.

La méthode de ponction semi-solide couramment utilisée dans les laboratoires de microbiologie de premier cycle pour détecter la motilité bactérienne inocule les bactéries dans la ponction dans le milieu gélose semi-solide contenant 0,4 à 0,8% d’agar, selon la direction de la croissance bactérienne. Si les bactéries se développent le long de la ligne de ponction pour se propager, des traces de croissance en forme de nuage (en forme de brosse) apparaissent, indiquant la présence de flagelles et, par conséquent, la motilité. S’il n’y a pas de traces de croissance de la ligne de ponction, la bactérie n’est ni flagellée ni mobile.

Cependant, cette méthode a ses inconvénients: les bactéries sont incolores et transparentes, l’activité flagellaire est affectée par les caractéristiques physiologiques des bactéries vivantes et d’autres facteurs, ainsi que par la concentration de gélose et le petit diamètre du tube à essai. De plus, les bactéries aérobies ne conviennent qu’à la croissance sur la surface de la gélose, ce qui affecte l’observation de la motilité bactérienne. Par conséquent, pour améliorer cette expérience, du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (incolore) a été ajouté au milieu afin d’établir une méthode plus fiable et intuitive de détermination de la motilité bactérienne que la méthode actuelle de ponction directe utilisant des déshydrogénases intracellulaires pour catalyser la formation d’un produit rouge de TTC 7,8,9,10.

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Protocole

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1. Préparation du milieu semi-solide

  1. Gélose semi-solide traditionnelle
    1. Préparer la gélose semi-solide traditionnelle selon la recette du milieu d’essai de motilité bactérienne en utilisant les ingrédients de base11. Dissoudre 10 g de tryptose, 15 g de NaCl, 4 g de gélose dans suffisamment d’eau distillée, ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 et compléter le volume final à 1 000 mL.
    2. Autoclaver la gélose à 121 °C pendant 20 min et la distribuer dans des tubes à essai de 10 mL en milieu semi-solide de 3 cm de hauteur.
  2. Gélose semi-solide traditionnelle avec TTC
    1. Après avoir autoclavé le milieu semi-solide conventionnel, refroidissez-le à 50 °C, ajoutez 5 mL de solution stérile à 1 % de TTC à 100 mL de milieu, mélangez-le et distribuez-le dans des tubes à essai de 10 ml pour former un milieu semi-solide de 3 cm de haut.

2. Souches bactériennes

REMARQUE : Quatre-vingts souches ont été isolées du milieu aquatique et identifiées à l’aide d’un instrument automatisé d’identification des bactéries (voir le tableau des matières), y compris Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae et Aeromonas hydrophila (tableau 1). Staphylococcus aureus (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme témoin négatif non mobile; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella typhimurium (voir le tableau des matières) ont été utilisées comme souches témoins positives.

  1. Identifier les souches bactériennes à utiliser pour l’analyse de la motilité.
  2. Inclure les témoins négatifs non mobiles et les souches témoins positives mobiles.

3. Observation de la motilité bactérienne améliorée par le TTC

  1. Prélever des colonies individuelles de bactéries d’essai dans des boîtes de gélose et les inoculer dans les deux milieux semi-solides ci-dessus (étapes 1.1.2 et 1.2.1) par perforation à l’aide d’aiguilles d’inoculation.
  2. Culture des tubes à 37 °C dans l’incubateur pendant 24-48 h pour observer les résultats.
  3. Observez l’état de croissance : caractérisez la bactérie comme non mobile (-) si seule la ligne de ponction est rouge. Caractériser la bactérie comme mobile (+) si la couleur rouge se propage légèrement vers l’extérieur le long de la ligne de ponction12.

4. Effet de différentes concentrations de gélose sur la motilité bactérienne

  1. Préparer des milieux semi-solides contenant 0,3 %, 0,5 % et 0,8 % de gélose et les inoculer par perforation, comme décrit ci-dessus. Observez les résultats après 24-48 h d’incubation.

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Résultats

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Les souches standard et les souches isolées ont été comparées pour la détection de la motilité, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. En raison de l’absence de flagelles, Staphylococcus aureus et Klebsiella pneumoniae ne se sont développés que le long de la ligne inoculée sur des milieux semi-solides traditionnels et TTC. En revanche, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Salmonella typhimurium ont montré une croissance dans toutes les direc...

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Discussion

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La détection de la motilité bactérienne par la méthode en milieu semi-solide est affectée par de nombreux facteurs13,14. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène (aérobie sur la surface de la gélose, non aérobie au fond du tube avec le milieu semi-solide), le pH et la température, peuvent affecter la viabilité des flagelles bactériens, ce qui peut entraîner une motilité réduite ou même une perte de motilité15. De plus...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD) et le projet de recherche sur la réforme de l’enseignement de l’Université pharmaceutique de Chine (2019XJYB18).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bacto AgarDifco
Escherichia coliATCCATCC25922Contrôle positif
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC27853Contrôle positif
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028Contrôle positif
Staphylococcus aureusATCCATCC25923Témoin non mobile négatif
Tryptose  ; OXOID
TTCSigma298-96-4
VITEK 2 système automatisé d’identification microbienneBio Mé ; rieux

Références

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Mots-clés

G lose au TTCmilieu semi solided tection de la motilitbact ries pathog nesexpression des flagellesformation de biofilmtechnique d inoculationactivit d shydrog nase

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