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Article de méthode

Identification de fragments d’ARN résultant d’une dégradation enzymatique à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF

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DOI :

10.3791/63720

⸱

11 avril 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Dans cet article

Résumé

MALDI-TOF a été utilisé pour caractériser des fragments obtenus à partir de la réactivité entre l’ARN oxydé et l’exoribonucléase Xrn-1. Le présent protocole décrit une méthodologie qui peut être appliquée à d’autres processus impliquant l’ARN et/ou l’ADN.

Résumé

L’ARN est un biopolymère présent dans tous les domaines de la vie, et ses interactions avec d’autres molécules et/ou espèces réactives, par exemple l’ADN, les protéines, les ions, les médicaments et les radicaux libres, sont omniprésentes. En conséquence, l’ARN subit diverses réactions qui incluent son clivage, sa dégradation ou sa modification, conduisant à des espèces biologiquement pertinentes avec des fonctions et des implications distinctes. Un exemple est l’oxydation de la guanine en 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), qui peut se produire en présence d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans l’ensemble, les procédures qui caractérisent ces produits et transformations sont largement précieuses pour la communauté scientifique. À cette fin, la spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation laser de désorption assistée par matrice (MALDI-TOF) est une méthode largement utilisée. Le présent protocole décrit comment caractériser les fragments d’ARN formés après un traitement enzymatique. Le modèle choisi utilise une réaction entre l’ARN et l’exoribonucléase Xrn-1, où la digestion enzymatique est arrêtée aux sites oxydés. Deux séquences d’ARN long de 20 nucléotides [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ont été obtenues par synthèse en phase solide, quantifiées par spectroscopie UV-vis, et caractérisées par MALDI-TOF. Les brins obtenus ont ensuite été (1) 5'-phosphorylés et caractérisés par MALDI-TOF ; 2° traité avec Xrn-1; 3° filtré et dessalé; (4) analysé via MALDI-TOF. Cette configuration expérimentale a conduit à l’identification sans équivoque des fragments associés au décrochage de Xrn-1 : [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Les expériences décrites ont été réalisées avec 200 picomols d’ARN (20 pmol utilisés pour les analyses MALDI); cependant, des quantités plus faibles peuvent entraîner des pics détectables avec des spectromètres utilisant des sources laser plus puissantes que celle utilisée dans ce travail. Il est important de noter que la méthodologie décrite peut être généralisée et potentiellement étendue à l’identification de produits pour d’autres processus impliquant de l’ARN et de l’ADN, et peut aider à la caractérisation / élucidation d’autres voies biochimiques.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 est une technique largement utilisée pour la caractérisation et/ou la détection de molécules de tailles et de caractéristiques variables. Certaines de ses utilisations comprennent diverses applications telles que la détection de tanins à partir de ressources naturelles4, l’imagerie des métabolites dans les aliments5, la découverte ou la surveillance de cibles ou de marqueurs de médicaments cellulaires6, et les diagnostics cliniques7, pour n’en nommer que quelques-uns. L’utilisation de MALDI-TOF avec de l’ADN ou de l’ARN, dont l’utilisation sur des oligonucléotides remonte à plus de trois décennies8, où plusieurs limitations ont été notées, est pertinente pour les présents travaux. Cette technique a maintenant évolué vers un moyen fiable et couramment utilisé pour caractériser les biopolymères9 et identifier/comprendre les réactions chimiques et biochimiques, par exemple, la caractérisation des sites platinés dans l’ARN10, l’identification des fragments d’ARN après le clivage des brins11,12, ou la formation de liaisons croisées protéine-ADN13 . Ainsi, il est utile d’illustrer et de mettre en évidence les aspects importants de l’utilisation de cette technique. Les bases de MALDI-TOF ont également été décrites au format vidéo14 et ne seront pas développées plus en détail ici. En outre, son application dans un contexte d’ADN ou de protéine a déjà été décrite et illustrée dans ledit format 15,16,17.

Le protocole de détection des fragments d’ARN formés après hydrolyse enzymatique est rapporté ici. Le modèle expérimental a été choisi sur la base d’une découverte récente publiée par notre groupe18, où MALDI-TOF a été utilisé pour déterminer la réactivité unique entre l’exoribonucléase Xrn-1 et les oligonucléotides de l’ARN contenant la lésion oxydative 8-oxoG. Les 20-nucléotides longs brins ont été obtenus par synthèse en phase solide19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], tandis que Xrn-1 a été exprimé et purifié suite au rapport20 décrit précédemment. En bref, Xrn-121 est une exoribonucléase de 5'-3' avec divers rôles biologiques clés qui dégradent plusieurs types d’ARN, y compris l’ARNoxydé 22. Il a été constaté que la processivité de l’enzyme se bloque lors de la rencontre du 8-oxoG, ce qui conduit à des fragments d’ARN contenant des extrémités 5'-phosphorylées [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Enfin, il est important de noter que la spectrométrie de masse est une méthode puissante qui, grâce à diverses méthodologies, peut être adaptée à d’autres fins23,24; ainsi, le choix de la bonne méthode d’ionisation ainsi que d’autres installations expérimentales est de la plus haute importance.

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Protocole

De l’eau ultra pure sans RNase (tableau 1) a été utilisée pour la présente étude.

1. Détermination de la concentration de la solution d’ARN

  1. Préparez l’échantillon d’ARN en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Utiliser un tube de microcentrifugation (0,6 mL) pour préparer une solution d’ARN en diluant 1 μL de solution mère (obtenue par synthèse en phase solide)19 en 159 μL deH2O sans RNase. Mélanger la solution en pipetant le mélange de haut en bas à plusieurs reprises (10x).
      REMARQUE: Étant donné qu’une large gamme de cuvettes est disponible dans le commerce, les volumes nécessaires peuvent différer. Des cuvettes d’une longueur de 1 cm et d’un volume réduit (150 μL) ont été utilisées dans ce travail.
    2. Rincer la cuvette UV-vis avec du méthanol (2x), puis de l’eau (ultrapur H2O, 3x, voir Tableau des matériaux). Utilisez un flux d’azote gazeux pour bien sécher la cuvette.
    3. Utilisez une pipette pour transférer la solution (étape 1.1.1) dans la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Boucher la cuvette et la placer sur le côté jusqu’à ce que nécessaire.
  2. Déterminer la concentration de la solution d’ARN préparée à l’aide du spectrophotomètre UV-vis.
    1. Allumez le spectrophotomètre UV-Vis en actionnant l’interrupteur situé à l’arrière de l’instrument. Laissez l’instrument terminer la procédure de démarrage et cliquez sur l’icône UV WinLab pour ouvrir la fenêtre de fonctionnement/contrôle de l’instrument.
    2. Allumez le spectrophotomètre Peltier Temperature Controller à l’aide de l’interrupteur situé à droite de l’instrument.
    3. Sous Méthodes de base, cliquez sur Scan - Lambda 365. Un autre écran s’ouvrira et invitera l’utilisateur à s’assurer que les supports de cellule sont vides. Cliquez sur OK et laissez l’instrument effectuer ses vérifications du système. Le système affichera alors une liste de contrôles, s’assurera que tous les « Pass » et cliquera sur OK.
      REMARQUE: Il est recommandé de suivre les étapes 1.2.1-1.2.3 dans l’ordre fourni; la modification de cette séquence d’événements peut entraîner un dysfonctionnement du logiciel.
    4. Ajustez les paramètres d’analyse en sélectionnant Collecte de données. Dans la nouvelle fenêtre, sous Paramètres d’analyse , modifiez le début à 350 nm et la fin à 215 nm.
    5. Activez le Peltier en sélectionnant le + à gauche de l’Accessoire. Cliquez sur Multiple Cell Peltier, changez la température °C à 25, puis cliquez sur Peltier On.
    6. Accédez à l’onglet Informations sur l’exemple et entrez le nombre d’échantillons, les noms et la position des cellules comme vous le souhaitez.
    7. Cliquez sur Autozero et insérez la cuvette contenant la solution d’arrière-plan. Assurez-vous de positionner cette cuvette dans la même fente où les mesures seront effectuées.
    8. Cliquez sur Démarrer et insérez la cuvette (étape 1.1.3) dans la cellule souhaitée. Assurez-vous que la fenêtre de la cuvette est orientée parallèlement à la face avant de l’instrument. Cliquez sur OK pour commencer la première numérisation à 25 °C.
    9. Pour les mesures à des températures plus élevées, répétez les étapes 1.2.5 à 1.2.8 et modifiez la température à la température souhaitée de l’échantillon (90 °C dans le cas présent).
    10. Cliquez sur Fichier > Exporter et choisissez l’emplacement de fichier souhaité. Sélectionnez Données XY pour obtenir un fichier .txt.
      REMARQUE : Une aide illustrative de l’étape 1.2 se trouve dans le dossier supplémentaire 1 (S1-S7).
  3. Effectuer l’acquisition de données pour déterminer la concentration d’ARN.
    1. Recherchez le fichier pour chaque spectre sous l’onglet Résultats . Pour obtenir l’absorbance, survolez la ligne, naviguez jusqu’à 260 nm et enregistrez les absorbances affichées. Alternativement, via la cascade File > Export, exportez les données en tant que fichier .txt pour une analyse graphique plus approfondie à l’aide d’un autre logiciel de traçage.
      NOTE: Si 0,1 < A ≥ 1, il sera nécessaire de diluer ou d’augmenter la concentration de l’échantillon d’ARN préparé à l’étape 1.1.1.
    2. Utilisez la loi de Beer-Lambert pour calculer la concentration de la solution.
      NOTE: Loi de la bière: A = εcl, où:
      R : Absorbance (à 260 nm dans ce cas, à partir de l’étape 1.3.1)
      ε : Coefficient d’extinction. Pour la séquence utilisée ici, 208 000 L mol-1 cm-1est la valeur obtenue à partir d’un outil OligoAnalyzer.
      l: Longueur du chemin, 1 cm
      c: concentration de l’échantillon
    3. Utilisez ces calculs pour préparer la solution d’ARN souhaitée à utiliser pour des expériences ultérieures. Des solutions avec [ARN] = 200 μM ont été utilisées dans la présente étude.

2. Hydrolyse des oligonucléotides de l’ARN par Xrn-1

  1. Effectuez une phosphorylation de 5' de l’ARN en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Utiliser un tube de microcentrifugation de 0,6 mL pour préparer la solution suivante (volume total de 50 μL).
      1. Ajouter H2O sans RNase (33,5 μL); les volumes peuvent varier en fonction de [ARN].
      2. Ensuite, ajoutez la solution A (5 L, tableau 1).
      3. Ajouter une solution aqueuse d’adénosine triphosphate (ATP, voir tableau des matériaux) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
      4. Ajouter la solution aqueuse d’ARN (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. Ajouter la solution de polynucléotide kinase (enzyme PNK, voir Tableau des matériaux) (4,5 L, 45 unités). Mélanger doucement en pipetant le mélange de haut en bas (10x).
    2. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 45 min en le plaçant au bain-marie.
    3. Inactiver l’enzyme en plaçant le tube de réaction dans un bloc thermique préchauffé (65 °C) et en incubant la solution pendant 10 min.
    4. Laisser la solution refroidir à température ambiante (la phosphorylation de l’ARN a été caractérisée par analyse MALDI-TOF, voir Résultats représentatifs) pour obtenir une solution finale d’ARN phosphorylé 5'(4 μM, 50 μL).
  2. Effectuez l’hydrolyse de l’ARN par Xrn-1 en suivant les étapes ci-dessous.
    1. En utilisant la solution (50 μL) de l’étape 2.1.4, effectuez les étapes suivantes.
      1. Ajouter la solution B (5 L, tableau 1).
      2. Ajouter une solution de Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Mélanger la solution en pipetant doucement de haut en bas (10x).
      3. Incuber le tube de réaction à température ambiante pendant 2 h.
    2. Transférer le mélange réactionnel (étape 2.2.1.3) dans un dispositif centrifuge de la taille d’un pore de 10 kDa (voir tableau des matériaux) et filtrer les enzymes par centrifugation (700 x g pendant 10 min à température ambiante).
    3. Transférer le filtrat dans un tube de centrifugeuse de 0,6 mL.
    4. Laver l’ARN résiduel sur le tube centrifuge (étape 2.2.2.) en ajoutant H2O (20L) sans RNase, suivi d’une centrifugation (700 x g pendant 10 min à température ambiante).
    5. Combiner le filtrat avec celui obtenu à l’étape 2.2.3.
    6. Conserver le tube contenant la solution obtenue dans un congélateur (0 °C) ou expédier pour analyse.

3. Dessalage de la solution d’ARN, spotting de plaque MALDI-TOF

  1. Dessalez et concentrez l’échantillon à l’aide d’embouts de pipette C18 à échange de cations disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux).
    1. Positionner une pointe de pipette C18 de 10 L (pointe de pipette chargée d’un lit de milieu de chromatographie C18 fixé à son extrémité) sur une pipette de 10 μL, puis continuer avec ce qui suit :
      1. Laver la pointe C18 avec une solution aqueuse d’acétonitrile (10 μL) à 50 % deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.
      2. Équilibrer la pointe C18 avec une solution aqueuse d’acide trifluoroacétique (0,1% TFA, 10 μL) deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.
      3. Retirez manuellement la pointe C18 de la pipette et fixez-la sur une pipette de 200 μL contenant une pointe de pipette P200 (la pointe C18 sera maintenant fixée à la pointe de pipette P200).
      4. Immergez la pointe C18 dans la solution (étape 2.2.6) et aspirez la solution à travers la pointe C18 dix fois.
        REMARQUE: L’échantillon d’ARN se lie à la résine échangeuse de cations à l’intérieur de la pointe.
      5. Détachez la pointe C18 de la pipette P200 et positionnez-la sur une pipette de 10 μL.
      6. Lavez la pointe C18 à l’aide d’une solution aqueuse de 0,1 % de TFA (10 μL) deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.
      7. Lavez la pointe C18 avec de l’eau sans RNase (10 μL) deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.
  2. Repérez sur la plaque MALDI en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Éluer l’oligonucléotide d’ARN de la pointe C18 (étape 3.1.1.7) en immergeant l’échantillon dans la matrice souhaitée (10 μL, solution 1:1 de C et D, tableau 1), puis en redistribuant la solution dans le tube. Répétez ce processus dix fois.
    2. Pipeter la solution du 3.2.1 sur deux endroits distincts sur la plaque (1 μL chacun, 20 pmol). Laissez sécher les taches à l’air libre (Figure 1A et Vidéo 1).
      REMARQUE: Ce processus peut être répété au même endroit pour augmenter la concentration de l’échantillon à chaque endroit.
    3. Pipette souhaitée calibrant (1 L) sur deux endroits séparés physiquement proches de l’emplacement de l’échantillon et laisser sécher à l’air.
      REMARQUE : L’étalon d’essai utilisé dans la présente étude a été obtenu de sources commerciales (voir tableau des matériaux).
    4. Sur-poser le calibrant [entièrement séché] avec la matrice désirée (1 L). Laisser sécher à l’air.
      REMARQUE: Il est important de suivre la position où les échantillons et les calibrants sont repérés avant l’insertion dans l’instrument. Notez-le à l’aide du système de coordonnées de la plaque, par exemple, l’échantillon 1 est situé à la position (C,3)

4. Acquisition et traitement des données

REMARQUE: En général, THAP nécessite une puissance laser plus élevée pour obtenir l’ionisation. De plus, les oligos peuvent être difficiles à ioniser sans se fragmenter. Ainsi, il est généralement nécessaire d’utiliser une puissance laser aussi faible que possible et d’augmenter les gains du détecteur et / ou une fréquence laser plus basse pour maximiser la détection et minimiser la fragmentation.

  1. Effectuez l’acquisition de données en suivant les étapes ci-dessous.
    NOTE: Les mesures de poids moléculaire ont été effectuées à l’aide d’un spectromètre de masse (voir Tableau des matériaux) en ion positif, en mode linéaire avec une tension de source ionique de 20 kV, un gain de détecteur d’environ 2,8 kV et une fréquence laser de 20 Hz. Les plages de balayage ont été définies en fonction du ou des poids moléculaires attendus. Ceux-ci ont été calculés et exprimés en masse sur charge (m / z), où la charge était de 1. L’étalonnage externe a été effectué à l’aide d’un mélange d’étalonnage de protéines (Bacterial Test Standard, voir Tableau des matériaux) à un endroit adjacent à l’échantillon. Les données brutes ont ensuite été traitées dans le logiciel flexAnalysis (voir Tableau des matières).
    1. Ouvrez « Logiciel Flexcontrol » pour le fonctionnement. Appuyez sur le bouton vert d’entrée/sortie de l’instrument, attendez que l’étage cible se déplace et passez l’aspirateur pour évacuer. Ouvrez le couvercle, placez la plaque cible entièrement séchée dans l’instrument. Assurez-vous de l’aligner dans la bonne orientation (Figure 1B).
    2. Abaissez doucement le couvercle, puis appuyez sur le bouton vert d’entrée/sortie . Attendez que la plaque soit rétractée et que l’instrument redescende. Une fois que la barre d’état (coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel) indique « Prêt », procédez à l’étalonnage.
    3. Pour calibrer les instruments à l’aide du logiciel, procédez comme suit.
      1. Sélectionnez la méthode souhaitée en cliquant sur le fichier > Sélectionner la méthode ou en appuyant sur le bouton Sélectionner à côté de la méthode chargée. Cliquez sur les coordonnées du point d’étalonnage. Accédez à l’onglet Calibration et vérifiez que le calibrant correct est sélectionné. Assurez-vous que Random Walk est désactivé (dans l’onglet Exemple de support ).
      2. Appuyez sur Démarrer et dirigez manuellement le laser le long d’un cristal (en cliquant sur la flèche de la souris à l’emplacement souhaité dans la vue de la caméra). Réglez la puissance du laser, si nécessaire. Une fois satisfait des paramètres, appuyez sur Démarrer pour collecter les spectres et les ajouter au tampon de somme.
      3. Ajoutez des spectres à la somme jusqu’à ce qu’une intensité suffisante soit atteinte. Basculez pour afficher uniquement la mémoire tampon de somme, soustrayez la ligne de base et lissez. Cliquez ensuite sur Affectation automatique. Vérifiez chaque pic attribué et notez l’erreur ppm. Si vous êtes satisfait des devoirs et des erreurs, cliquez sur Appliquer.
      4. Effacez le tampon de somme et accédez à la position du premier échantillon.
      5. Confirmez la plage d’analyse souhaitée (onglet 'Détection'). Ajustez les barres dans la « Plage de masse » afin que la région verte soit représentative de la ou des masses attendues.
      6. Cliquez directement sur la fenêtre Grossissement pour que le réticule soit orienté vers le fragment cristallisé souhaité (les cristaux plus gros donnent souvent les meilleurs résultats, Figure 2).
      7. Collectez quelques spectres le long des gros cristaux, en ajustant la puissance du laser si nécessaire. Le réglage approprié est de 5% à 10% au-dessus de la puissance à laquelle les pics apparaissent.
    4. Pour obtenir des spectres, effectuez les opérations suivantes.
      1. Cliquez sur Démarrer pour observer le flash laser en tandem avec une intensité spectrale croissante (illustrée dans la fenêtre en haut à droite). Déplacez le laser sur toute la longueur du cristal en cliquant sur la flèche de la souris vers le haut et vers le bas du cristal (Vidéo 2).
      2. Cliquez sur Ajouter directement sous Démarrer.
      3. Répétez cette opération plusieurs fois jusqu’à ce que l’intensité/le nombre de tirs souhaités soient atteints (réfléchis sur l’axe y de la fenêtre spectrale)
      4. Ajustez la puissance et/ou la vitesse du laser et/ou les gains du détecteur si les scans initiaux ne sont pas satisfaisants. Répétez les étapes 4.1.4.1 à 4.1.4.3 si nécessaire.
      5. Si vous êtes satisfait du spectre, cliquez sur Enregistrer sous pour enregistrer le spectre sous un nom spécifié. Ensuite, si d’autres échantillons sont nécessaires, cliquez sur Effacer la somme et répétez les étapes de l’étape 4.1.4.
  2. Effectuer le traitement des données.
    REMARQUE : L’étape 4.2 décrit une façon d’analyser les données à l’aide du logiciel flexAnalysis.
    1. Ouvrez le logiciel souhaité. Ensuite, ouvrez le spectre (a) en sélectionnant Fichier. Dans le menu déroulant, sélectionnez Ouvrir.
    2. Une nouvelle fenêtre s’affiche. Cliquez sur Parcourir pour localiser les fichiers enregistrés à partir de l’étape 4.1.4. Cochez les cases correspondant aux fichiers souhaités, puis cliquez sur Ouvrir sur la gauche. Si un seul spectre nécessite une analyse, il suffit de faire glisser et de déposer le fichier dans la fenêtre du logiciel.
    3. Mettez en surbrillance le(s) fichier(s) chargé(s) pour l’analyse en bloc. Accédez à l’onglet Processus de la barre d’outils. Dans la liste déroulante, sélectionnez Soustraire la ligne de base du spectre massique.
      REMARQUE: L’algorithme utilisé pour la soustraction sera déterminé par la méthode sélectionnée à l’étape 4.1.3.
    4. Accédez à l’onglet Processus de la barre d’outils. Dans la liste déroulante, sélectionnez Spectre de masse lisse.
      REMARQUE: L’algorithme utilisé pour le lissage sera déterminé par la méthode sélectionnée à l’étape 4.1.3.
    5. Cliquez sur l’onglet Liste de masse ; dans la liste déroulante, sélectionnez Rechercher. Cette commande étiquette automatiquement les pics avec leurs masses; une liste des masses sera affichée sur l’écran à droite.
    6. Pour ajouter ou supprimer des pics, passez à l’onglet Liste de masse . Dans la liste déroulante, cliquez sur Modifier.
    7. Survolez l’axe des x du spectre; une ligne verticale représente l’emplacement du spectre sur lequel se trouve le curseur.
      REMARQUE: Une icône avec un graphique et un curseur apparaîtra lorsqu’une nouvelle masse peut être ajoutée en cliquant dessus. Cette icône apparaîtra lorsque vous survolerez les pics qui peuvent être supprimés en cliquant dessus (voir l’étape 4.2.7 dans le fichier supplémentaire 1).
    8. Répétez les étapes 4.1.3 à 4.1.7 pour obtenir des spectres supplémentaires. Exportez la liste de masse pour tous les spectres en cliquant et en faisant glisser pour mettre en surbrillance les fichiers sur la gauche et exécutez la cascade de menus suivante Fichier > Exporter > liste de masse vers Excel.
    9. Pour exporter des spectres comme indiqué à l’écran, prenez une capture d’écran ou exportez-la sous forme de rapport. Pour ce dernier, accédez au menu Rapport . Dans la liste déroulante, sélectionnez Enregistrer au format PDF.
      REMARQUE: On peut modifier la façon dont les spectres sont affichés en utilisant les trois onglets sous les spectres et / ou en variant les fichiers en surbrillance. Un écran apparaîtra. Nommez le document PDF comme vous le souhaitez, ajustez les paramètres / la mise en page et cliquez sur Enregistrer pour générer une image du spectre.
    10. L’image générée reflétera la vue spectrale dans le logiciel. Pour manipuler la vue, effectuez les opérations suivantes.
      1. Zoom avant : Cliquez sur le bouton Zoom avant dans la barre d’outils.
      2. Passez le curseur de la souris sur l’axe des x et cliquez jusqu’à ce que la plage souhaitée soit atteinte.
      3. Zoom arrière/annulation : Cliquez sur le bouton Zoom arrière et cliquez n’importe où dans le spectre pour revenir à la vue complète.
        REMARQUE : Une aide illustrative pour les étapes 4.1 et 4.2 se trouve dans le dossier supplémentaire 1 (pp S8-S23 et S24-S30, respectivement).

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Résultats

Les oligonucléotides utilisés dans ce travail ont été synthétisés, caractérisés et quantifiés avant utilisation. La concentration de tous les oligonucléotides a été déterminée par spectroscopie UV-vis enregistrée à 90 °C afin d’éviter des lectures erronées résultant de la formation potentielle des structures secondaires. La figure 3 montre les spectres du modèle d’oligonucléotides d’ARN utilisé dans ce travail, pris à température ambiante et après application de chaleur.

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Discussion

Le principal défi dans ce flux de travail s’est posé entre la finalisation des expériences et la réalisation des analyses spectrométriques de masse. Les expériences ont été menées et achevées à l’Université du Colorado à Denver et expédiées (pendant la nuit) aux installations de l’Université d’État du Colorado. L’acquisition des données a été effectuée dès réception, selon la commodité. Plusieurs circonstances inattendues ont entraîné des retards dans le processus. Dans un cas, des dysfonctionnements inattendus de l’inst...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Il est important de noter que ce travail était un effort de collaboration entre trois institutions, deux groupes de recherche et une installation centrale. La distribution et la charge de travail ont été effectuées comme suit: L’expression de la protéine (Xrn-1) a été réalisée à l’Université de Denver (Denver, CO). La synthèse, la quantification et l’expérimentation d’oligonucléotides (principalement la dégradation enzymatique) ont été menées à l’Université du Colorado à Denver (Denver, CO). L’optimisation y a également été réalisée. La détection, l’acquisition et l’analyse de MALDI-TOF ont été effectuées à l’Analytical Resources Core Facility de la Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS aimerait reconnaître un prix UROP (CU Denver) et des subventions Eureca (CU Denver) pour leur soutien. E. G.C. reconnaît le soutien de NIGMS, via R00GM115757. MJER reconnaît le soutien de NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconnaît l’ID de ressource : SCR_021758. Le travail a également été soutenu par un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, de la Fondation Henry Dreyfus.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,6 mL MCT Gradué VioletFisher Scientific05-408-127
6'-Trihydroxyacétophénone monohydraté 98 %Sigma Aldrich480-66-0
Acétonitrile 99,9 %, grade HPLCFisher Scientific75-05-8
Adénosine triphosphate, 10 mMNew Englang BioscienceP0756S
Citrate d’ammonium, dibasique 98 % Sigma Aldrich3012-65-5
Fluorure d’ammonium 98,0 %, grade ACSAlfa Aesar12125-01-8
Norme de test bactérienBruker Daltonics8255343
Source commerciale de Xrn-1New England BioLabsM0338S
Pyrocarbonate de diéthyle, 97 %ACROS OrganicsA0368487
Analyse de la flexion logicielBruker daltonicsFlexAnalysis version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 Spectrophotomètre UV-visPerkin Elmer
Plaque MALDI : MSP 96 cible en acier rectifiéBruker Daltonics280799
Spectromètre de masseBrukerMicroflex LRFTOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000Le système Milipore SigmaA Mili-Q a été utilisé pour purifier toute l’eau utilisée dans ce travail
Dispositifs centrifuges Nanosep avec membrane OmegaTM 10 K, bleu (24/pqt)Média filtrant Pall CorporationOD010C33Omega (polyéthersulfone modifié) Taille des pores 10 K
NEBuffer 3New England BiolabsB7003SIl s’agit de la solution B
Outil d’analyse d’oligo-empreintesIDT-DNAhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pointes de pipette P10Fisher Scientific02-707-441
Pointes de pipette P200Fisher Scientific02-707-419
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
T4 Polynucléotide kinaseNew England BioLabsM0201S
T4 Tampon de réaction polynucléotidique kinaseNouveau Angleterre BioLabsB0201SIl s’agit de la solution A
Acide trifluoroacétiqueAlfa Aesar76-05-1
Xrn-1 exoribonucléaseExprimée en interneVoir réf. 20
ZipTip Pointes de pipette pour la préparation d’échantillonsMilliporeZTC 18S 09610 µ ; L pointes de pipette chargées d’un C18 standard 0.6 & micro ; Lit L
,

Références

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