Ce protocole décrit un test comparatif, utilisant des activités complexes mitochondriales CI+CIII et CII+CIII en présence ou en l’absence de Na+, pour étudier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
La sensibilité de la membrane mitochondriale interne au Na+ révèle des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les pools d’ubiquinone (CoQ) dans la membrane mitochondriale interne (IMM) sont partiellement segmentés en enzymes complexes I ou dépendantes de la FAD. Une telle subdivision peut être facilement évaluée par un essai comparatif utilisant le NADH ou le succinate comme donneurs d’électrons dans les mitochondries congelées-décongelées, dans lequel la réduction du cytochrome c (cyt c) est mesurée. Le test repose sur l’effet de Na+ sur l’IMM, diminuant sa fluidité. Nous présentons ici un protocole pour mesurer l’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase et les activités de la succinate-cyt c oxydoréductase en présence de NaCl ou de KCl. Les réactions, qui reposent sur le mélange de réactifs dans une cuvette de manière progressive, sont mesurées spectrophotométriquement pendant 4 min en présence de Na+ ou K+. Le même mélange est réalisé en parallèle en présence des inhibiteurs enzymatiques spécifiques afin de soustraire le changement non spécifique d’absorbance. L’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase ne diminue en présence d’aucun de ces cations. Cependant, l’activité de la succinate-cyt c oxydoréductase diminue en présence de NaCl. Cette expérience simple met en évidence : 1) l’effet de Na+ sur la diminution de la fluidité de l’IMM et du transfert de CoQ ; 2) que le supercomplexe I+III2 protège le transfert d’ubiquinone (CoQ) d’être affecté par l’abaissement de la fluidité de l’IMM; 3) que le transfert de CoQ entre CI et CIII est fonctionnellement différent du transfert de CoQ entre CII et CIII. Ces faits soutiennent l’existence de pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM et montrent qu’ils peuvent être régulés par l’environnement Na+ changeant des mitochondries.
Introduction
Le système de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est la principale voie conduisant à la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP), à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et à la consommation d’équivalents réducteurs, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) ou le succinate, par les mitochondries. Le système OXPHOS est composé de cinq complexes protéiques : le complexe I (IC) oxyde le NADH et réduit la CoQ en ubiquinol (CoQH2). Le complexe II (CII) oxyde le succinate en fumarate et réduit la CoQ enCoQH2. Le complexe III (CIII) oxyde la CoQH2 en CoQ, réduisant ainsi le cytochrome c (cyt c). Enfin, le complexe IV (CIV) oxyde le cyt c et réduit l’oxygène en eau. Cette chaîne d’oxydoréduction, appelée chaîne de transport d’électrons (mETC), est couplée au pompage de H+ à travers l’IMM, ce qui crée un gradient électrochimique utilisé par le complexe V (CV) pour phosphoryler l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP.
Les complexes mETC peuvent être seuls dans l’IMM ou s’assembler en structures quaternaires appelées supercomplexes. Le CIV peut s’assembler avec le CIII, formant le III2+IV ou le Q-respirasome (car il est capable de respirer en présence de CoQH2)1,2,3 ou formant des homodimères ou des homooligomères4. CIII peut interagir avec CI, formant le supercomplexe I +III25. Enfin, l’IC est également capable d’interagir avec le Q-respirasome, en construisant le I + III2 + IV ou le N-respirasome (car il peut respirer en consommant du NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ et cyt c sont des transporteurs d’électrons mobiles chargés de transférer des électrons de CI/CII à CIII, et de CIII à CIV, respectivement. La question de savoir si les supercomplexes imposent ou non une restriction locale fonctionnelle à ces transporteurs a fait l’objet d’un débat intense au cours des deux dernières décennies 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Cependant, plusieurs groupes indépendants ont démontré que coq et cyt c peuvent être segmentés fonctionnellement en pools dans l’IMM. En ce qui concerne la CoQ, elle peut être segmentée fonctionnellement en un pool de CoQ spécifique pour l’IC (CoQNAD) et un autre pool dédié aux enzymes dépendantes de la DCP (CoQFAD)1,7,12,18,19. Cependant, afin de différencier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, la surexpression de l’oxydase alternative (AOX) et la génération de mutants spécifiques de l’ADNmt, qui peuvent assembler l’IC en l’absence de CIII, ont été nécessaires 1,19,20.
Le mécanisme de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pendant l’hypoxie était inconnu jusqu’à récemment. En cas d’hypoxie aiguë, l’IC subit la transition active/décactive (A/D), qui implique la diminution de son activité oxydoréductase de pompage H+ NADH-CoQ. Une telle diminution du pompage H+ acidifie la matrice mitochondriale et dissout partiellement les précipités de calcium-phosphate dans la matrice mitochondriale, libérantdu Ca 2+ soluble. Cette augmentation du Ca2+ soluble active l’échangeur Na+/Ca2+ (NCLX), qui extrude le Ca2+ en échange de Na+. L’augmentation mitochondriale de Na+ interagit avec les phospholipides de la face interne de l’IMM, diminuant sa fluidité et son transfert de CoQ entre CII et CIII, produisant finalement un anion superoxyde, un signal redox21. Fait intéressant, le transfert de CoQ n’a diminué qu’entre CII et CIII, mais pas entre CI et CIII, soulignant que 1) Na+ n’était capable de moduler qu’un seul des pools de CoQ existants dans les mitochondries; 2) il existe des pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM. Ainsi, un protocole largement utilisé pour l’étude des activités enzymatiques mitochondriales peut être utilisé pour évaluer l’existence des pools de CoQ mentionnés.
Le protocole actuel est basé sur la mesure de la réduction du cyt c oxydé, le substrat de CIII, par absorbance en présence de succinate (c.-à-d. substrat CII) ou de NADH (c.-à-d. substrat CI). Le même échantillon est divisé en deux, dont l’un sera traité avec du KCl et l’autre avec la même concentration de NaCl. De cette façon, étant donné que Na+ diminue la fluidité de l’IMM, si la CoQ existait dans un pool unique dans l’IMM, CI+CIII et CII+CIII diminueraient en présence de Na+. Cependant, si la CoQ existait dans des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, l’effet de Na+ serait principalement (ou seulement) évident sur l’activité CII+CIII, mais pas sur l’IC+CIII. Comme récemment publié21, Na+ n’affecte que le transfert de CoQ entre CII et CIII (Figure 1C,D), mais pas entre CI et CIII (Figure 1A,B).
Ce protocole, ainsi qu’une panoplie de techniques, a été utilisé pour confirmer l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés dans l’IMM, l’un dédié à l’IC (c.-à-d.le NAD de CoQ) et l’autre aux enzymes liées à la DCP (c.-à-d. laDCP de CoQ)1,3,7; une observation qui, bien qu’elle continue d’être débattue22, a été corroborée indépendamment par plusieurs groupes 7,19. Ainsi, le superassemblage de CI en supercomplexes a un impact sur la mobilité locale de la CoQ, facilitant son utilisation par le CIII au sein du supercomplexe 1,7,13,14,23,24,25.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel du Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espagne, conformément à la directive de l’Union européenne du 22 septembre 2010 (2010/63/UE) et au décret royal espagnol du 1er février 2013 (53/2013). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et leurs souffrances.
REMARQUE: Ce test comparatif pour étudier la segmentation des pools de CoQ mitochondriaux est décrit comme suit:
1. Quantification des protéines
- Congeler et décongeler les mitochondriesisolées 26 d’un foie de souris de type sauvage trois fois (c.-à-d. membranes mitochondriales) avant l’expérimentation pour rendre les organites perméables aux substrats de réaction.
- Quantifier la quantité de protéines de l’échantillon de mitochondries isolées par les méthodes de Bradford ou d’acide bicinchoninique (BCA). Dans le cas de Bradford, ajouter 2 μL d’échantillon dans 1 mL de réactif 1x Bradford.
- Diviser l’échantillon en quatre sous-échantillons de 20 μg chacun (à savoir: A, B, C, D; Figure 2A).
2. Mesure de l’activité CI+CIII
REMARQUE : Cette partie du protocole utilise les échantillons A et B pour mesurer l’activité CI+CIII (Figure 2B).
- Divisez les échantillons A et B en deux sous-échantillons de 10 μg chacun (à savoir A1, A2, B1 et B2). Mélanger chacun des sous-échantillons dans une cuvette de 1 mL avec 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 10 μL de malonate de 100 mM et ajouter un tampon C1/C2 préchauffé (tableau 1) à 37 °C jusqu’à 980 μL (979 μL pour les cuvettes A2 et B2).
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation des réactifs toxiques malonate et cyanure de potassium.
REMARQUE : Le cyt c (10 mg/mL) doit être préparé frais en mélangeant 10 mg de cyt c dans 1 mL de solution de 10 mM K2HPO4 , pH ajusté à 7,2, et il doit être maintenu dans la glace tout au long de l’expérience. - Ajouter 10 μL de 1 M KCl dans les cuvettes A1 et A2, et ajouter 10 μL de 1 M NaCl dans les cuvettes B1 et B2.
- Ajouter 1 μL de roténone de 1 mM dans la cuvette contenant les sous-échantillons A2 et B2.
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation du réactif toxique roténone. - Juste avant la mesure, ajoutez 10 μL de NADH (10 mM) dans toutes les cuvettes.
NOTE: Les 10 μL sont de préférence ajoutés sur l’étape de la cuvette, de sorte que la réaction commence au mélange. - Mélangez la cuvette en la retournant soigneusement trois fois. Placez-le dans le lecteur de cuvette d’absorbance (spectrophotomètre UV/VISJASCO).
- Cliquez sur Mesurer > Paramètres > Général et réglez les paramètres de mesure sur Longueur d’onde: 550 nm et Temps: 4 min de lecture; appuyez sur les boutons Accepter et Démarrer pour commencer l’expérience.
- À la fin de la mesure, enregistrez la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous. La pente peut également être collectée manuellement.
3. Mesure de l’activité CII+CIII
REMARQUE : Cette partie du protocole utilise les échantillons C et D pour mesurer l’activité CII+CIII (Figure 2C).
- Divisez les échantillons C et D en deux sous-échantillons de 10 μg chacun (à savoir C1, C2, D1 et D2). Mélanger chacun des sous-échantillons dans une cuvette de 1 mL avec 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 1 μL de roténone de 1 mM et ajouter un tampon C1/C2 préchauffé à 37 °C jusqu’à 980 μL (970 μL pour les cuvettes C2 et D2).
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation des réactifs toxiques cyanure de potassium et roténone.
REMARQUE : Le cyt c (10 mg/mL) doit être préparé frais en mélangeant 10 mg de cyt c dans 1 mL de solution de 10 mM K2HPO4 , pH ajusté à 7,2, et il doit être maintenu dans la glace tout au long de l’expérience. - Ajouter 10 μL de 1 M KCl dans les cuvettes C1 et C2, et ajouter 10 μL de 1 M NaCl dans les cuvettes D1 et D2.
- Ajouter 1 μL de 1 mM d’antimycine A dans la cuvette contenant les sous-échantillons C2 et D2.
ATTENTION : Cette étape implique l’utilisation du réactif toxique antimycine A. - Juste avant la mesure, ajouter 10 μL de succinate (1 M) dans toutes les cuvettes.
NOTE: Les 10 μL sont de préférence ajoutés sur l’étape de la cuvette, de sorte que la réaction commence au mélange. - Mélangez soigneusement la cuvette en la retournant trois fois. Placez-le dans le lecteur de cuvette d’absorbance (spectrophotomètre UV/VIS).
- Cliquez sur Mesurer > Paramètres > Général et réglez les paramètres de mesure à Longueur d’onde: 550 nm et Temps: 4 min de lecture; appuyez sur les boutons Accepter et Démarrer pour commencer l’expérience.
- À la fin de la mesure, enregistrez la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous. La pente peut également être collectée manuellement.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les résultats typiques de ce protocole sont représentés ci-dessous (Figure 3). Comme l’absorbance cyt c réduite se situe à 550 nm, tous les sous-échantillons non inhibés doivent montrer une augmentation de l’absorbance à 550 nm. Les sous-échantillons inhibés montrent idéalement une ligne plate ou une pente légèrement croissante (Figure 3). Les pentes des sous-échantillons inhibés doivent être soustraites des sous-échantillons non inhibés.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Bien que ce protocole représente une procédure très simple pour identifier l’existence des pools de CoQ partiellement segmentés, il y a quelques étapes critiques à prendre en compte. Les substrats (c.-à-d. le NADH ou le succinate) sont de préférence ajoutés en dernier puisque l’autooxydation de ces composés peut se produire. Le retournement de la cuvette doit être prudent afin d’éviter la formation de bulles qui peuvent interférer avec la lecture.
En outre, la technique actuelle présente quelq...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions M. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez et E. R. Martínez-Jimenez pour leur assistance technique. Cette étude a été soutenue par MICIN: RTI2018-099357-B-I00 et HFSP (RGP0016/2018). Le CNIC est soutenu par l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) et la Fondation Pro CNIC et est un centre d’excellence Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figure 2 créée avec BioRender.com.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Antimycine A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c du cœur équin | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Acide malonique | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Cyanure de potassium | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Logiciel Spectra Manager | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotomètre | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
Références
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290(2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
