La microscopie à fluorescence intravitale peut être utilisée pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales et la perfusion capillaire en temps réel. Ce protocole décrit des méthodes pour imager et quantifier ces paramètres dans la microcirculation pulmonaire à l’aide d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide.
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Article de méthode
Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’imagerie intravitale des interactions leucocytaires-endothéliales offre des informations précieuses sur les maladies à médiation immunitaire chez les animaux vivants. L’étude des lésions pulmonaires aiguës (AIP)/syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et d’autres pathologies respiratoires in vivo est difficile en raison de l’accessibilité limitée et des artefacts de mouvement inhérents aux poumons. Néanmoins, diverses approches ont été développées pour surmonter ces défis. Ce protocole décrit une méthode de microscopie à fluorescence intravitale pour étudier en temps réel les interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire dans un modèle expérimental d’ALI. Un système d’imagerie pulmonaire in vivo et une plate-forme de microscopie intravitale imprimée en 3D sont utilisés pour sécuriser la souris anesthésiée et stabiliser le poumon tout en minimisant les lésions pulmonaires confondantes. Après la préparation, la microscopie à fluorescence à grand champ est utilisée pour étudier l’adhésion des leucocytes, le roulement des leucocytes et la fonction capillaire. Bien que le protocole présenté ici se concentre sur l’imagerie dans un modèle aigu de maladie pulmonaire inflammatoire, il peut également être adapté pour étudier d’autres processus pathologiques et physiologiques dans le poumon.
Introduction
La microscopie intravitale (MIV) est un outil d’imagerie utile pour visualiser et étudier divers processus biophysiques in vivo. Le poumon est très difficile à imager in vivo en raison de son emplacement fermé, de la nature fragile de ses tissus et des artefacts de mouvement induits par la respiration et le rythme cardiaque 1,2. Diverses configurations de microscopie intravitale (MIV) ont été développées pour l’imagerie en temps réel des interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire afin de surmonter ces défis. De telles approches sont basées sur l’exposition ch....
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Protocole
Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées avec l’approbation préalable du Comité des animaux de laboratoire de l’Université Dalhousie (UCLA).
1. Préparation
- Système d’imagerie pulmonaire: Pour préparer la fenêtre, administrer une fine couche de graisse sous vide au sommet de l’anneau extérieur tout en évitant la contamination du canal de vide. Placez un couvercle en verre propre de 8 mm sur la fenêtre et appuyez doucement vers le bas pour créer un joint.
- Microscope à fluorescence à grand champ : Effectuez des images avec un microscope à fluorescence à grand champ conventionnel équipé d’un obj....
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Résultats
Pour illustrer les résultats réalisables grâce à ce protocole, une lésion pulmonaire aiguë (AIP) a été induite 6 heures avant l’imagerie à l’aide d’un modèle d’instillation intranasale de lipopolysaccharides bactériens (LPS). Brièvement, les souris (n = 3) ont été anesthésiées avec de l’isoflurane, et de petites gouttelettes de LPS de Pseudomonas aeruginosa dans une solution saline stérile (10 mg / mL) ont été pipetées dans le naris gauche à une dose de 5 mg / kg. Cela a été comparé à des souris naïves (n = 3; p.......
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Discussion
Le protocole présenté ici nécessite de la pratique et de l’attention à quelques étapes critiques. Tout d’abord, il est important de préparer la fenêtre d’imagerie avant d’initier l’intubation et la chirurgie. Utilisez une quantité minimale de graisse sous vide pour recouvrir l’anneau extérieur de la fenêtre d’imagerie, appliquez le verre de couverture et testez l’aspiration avec une goutte d’eau distillée. Préparer cela à l’avance empêchera le poumon exposé de se dessécher pendant la configuration sinon. Bien qu’il soit .......
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Déclarations de divulgation
Le Dr Kamala D. Patel est la présidente et cofondatrice de Luxidea, l’entreprise auprès de laquelle la fenêtre d’imagerie utilisée dans cette expérience a été achetée.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier la Dre Pina Colarusso, qui a fourni une expertise considérable dans l’édition et la révision de ce manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 mL de seringue BD Luer Slip Tip stérile, à usage unique | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Seringue de 1 mL |
| Pince à pansement ADSON, largeur de l’embout 0,6 mm, longueur des dents 11,5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Pince émoussée |
| Albumine-Fluorescéine Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumine |
| Écouvillon d’alcool Alcool isopropylique 70 % v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Lingette imbibée d’alcool |
| AVDC110 Convertisseur vidéo numérique avancé | Canopus | 00631069602029 | Convertisseur vidéo numérique |
| N/B - CCD - | Caméra Horn Imaging | BC-71 | Caméra |
| Bovie Deluxe Kit de Cautérisation Haute Température | Outils Scientifiques Fins | 18010-00 | Cautériseur |
| C57BL/6 Souris | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Souris |
| Applicateurs à pointe de coton | Puritan | 806-WC | Applicateur en coton |
| CS-8R 8mm Rond en verre | Warner Instruments | 64-0701 | Lamelle en verre |
| Manomètre numérique | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM& V | Manomètre numérique |
| Dr Mom Otoscope LED en acier inoxydable mince | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95 % Vol | Alcools commerciaux | P016EA95 | 95 % d’éthanol |
| Ciseaux fins - Martensitique Acier inoxydable | Outils scientifiques fins | 14094-11 | Ciseaux |
| Fisherbrand Ruban d’étiquetage coloré | Fisher Scientific | 1590110 | Ruban d’étiquetage |
| Gast DOA-P704-AA Pompe à vide haute capacité | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Pompe à vide |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Pince hémostatique |
| Graisse à vide poussé | Dow Corning | DC976VF | Graisse sous vide |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl injectable 1 % 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaïne HCl 1 % |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Conçu pour la microscopie intravitale du poumon |
| Huile minérale | Teva Canada | 00485802 | Huile minérale |
| Kit d’intubation endotrachéale pour souris | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Support d’intubation, masque d’anesthésie, canule endotrachéale 20 G, câble à fibre optique |
| Microscope à fluorescence MST49 | Leica Microsystems | 10 450 022 | Microscope à fluorescence |
| N Plan L 20x/0.40 Objectif de microscope à longue distance de travail | Leica Microsystems | 566035 | Objectif 20x |
| Éponges non tissées 2 » x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ Imprimante 3D | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Oxygène | |
| , Linde | Canada Inc. | Aiguille | |
| Oxygen PrecisionGlide 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Aiguille 30 G |
| Pyrex 5340-2L 5340 Flacons filtrants, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Gourde isotherme |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Ruban médical en tissu doux sécurisé - 3" | Primed | PM5-630709 | Ruban en tissu |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 po. OD | Dow Corning | 602-205 | 1,0 mm Tube en polyéthylène D.I. |
| Système d’anesthésie à faible débit Somnosuite | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Ventilateur pour petits rongeurs, Système d’anesthésie à faible débit, Coussin chauffant, Sonde de température rectale, Oxymètre de pouls |
| Pince à tissus, 12,5 cm de long, Courbé, 1 x 2 dents | World Precision Instruments | 501216 | Pince |
| dentéeRuban médical Transpore, 1527-1, 1 po x 10 v (2,5 cm x 9,1 m) | 3M | 7000002795 | Tube de ruban médical |
| , transparent, 3/8 po de diamètre intérieur. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | Tube en polyéthylène 1,0 cm de diamètre intérieur |
| Whatman 6720-5002 Filtres en ligne de 50 mm, PTFE, 0,2 et micro ; m | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | En ligne 0.2µ ; Filtre M |
Références
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
- Gaertner, M., et al.
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Réimpressions et autorisations
