Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

L’un des problèmes de la recherche clinique sur le cancer est que le cancer n’est pas une maladie unique, mais une variété de maladies différentes qui peuvent évoluer au fil du temps, nécessitant des traitements spécifiques en fonction des caractéristiques de la tumeur elle-même et du patient¹. Par conséquent, le défi consiste à s’orienter vers une recherche sur le cancer axée sur le patient, afin d’identifier de nouvelles stratégies personnalisées pour la prédiction précoce des résultats du traitement du cancer². Ceci est particulièrement pertinent pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), car il est considéré comme un cancer difficile à traiter, avec un taux de survie à 5 ans de 11^%3.

Le diagnostic tardif, la progression rapide et le manque de thérapies efficaces demeurent les problèmes cliniques les plus urgents de l’ACPE. Le principal défi est donc de modéliser le patient et d’identifier les biomarqueurs qui peuvent être appliqués en clinique pour sélectionner la thérapie la plus efficace en ligne avec la médecine personnalisée ^4,5,6. Au fil du temps, de nouvelles approches ont été proposées pour modéliser les maladies cancéreuses : les organoïdes dérivés de patients (AOP) et les xénogreffes dérivées de souris (mPDX) provenaient d’une source de tissu tumoral humain. Ils ont été utilisés pour reproduire la maladie afin d’étudier la réponse et la résistance au traitement, ainsi que la récurrence de la maladie ^7,8,9.

De même, l’intérêt pour les modèles de xénogreffe dérivée de patients (zPDX) à base de poisson zèbre a augmenté, grâce à leurs caractéristiques uniques et prometteuses¹⁰, représentant un outil rapide et peu coûteux pour la recherche sur le cancer^11,12. Les modèles zPDX ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon tumoral, ce qui rend possible le dépistage à haut débit de la chimiothérapie¹³. La technique la plus couramment utilisée pour les modèles zPDX est basée sur la digestion complète de l’échantillon et l’implantation des populations cellulaires primaires, ce qui reproduit partiellement la tumeur, mais présente les inconvénients d’un manque de microenvironnement tumoral et de diaphonie entre cellules malignes et saines¹⁴.

Ce travail montre comment les zPDX peuvent être utilisés comme modèle préclinique pour identifier le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer du pancréas. La stratégie précieuse facilite le processus de xénogreffe, car il n’y a pas besoin d’expansion cellulaire, ce qui permet d’accélérer le dépistage de la chimiothérapie. La force du modèle est que tous les composants du microenvironnement sont maintenus tels quels dans le tissu cancéreux du patient, car, comme on le sait, le comportement de la tumeur dépend de leur interaction^15,16. Ceci est très favorable aux méthodes alternatives dans la littérature, car il est possible de préserver l’hétérogénéité tumorale et de contribuer à améliorer la prévisibilité du résultat du traitement et de la rechute d’une manière spécifique au patient, permettant ainsi au modèle zPDX d’être utilisé dans les essais cocliniques. Ce manuscrit décrit les étapes impliquées dans la fabrication du modèle zPDX, en commençant par un morceau de résection tumorale du patient et en le traitant pour analyser la réponse à la chimiothérapie.

Le ministère italien de la Santé publique a approuvé toutes les expérimentations animales décrites, conformément à la directive 2010/63/UE sur l’utilisation et les soins des animaux. Le comité d’éthique local a approuvé l’étude, sous le numéro d’enregistrement 70213. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets concernés. Avant de commencer, toutes les solutions et l’équipement doivent être préparés (section 1) et les poissons doivent être croisés (section 2).

1. Préparation des solutions et des équipements

REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les solutions et les supports à préparer.

1. Support de gel d’agarose
   1. Peser la poudre d’agarose dans une fiole micro-ondable et la dissoudre dans un volume donné de milieu de poisson zèbre E3 pour obtenir un gel à 1%. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
      REMARQUE: Ne pas trop faire bouillir la solution.
   2. Versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri et attendez que le gel se soit complètement solidifié.
   3. Fabriquer de petites bouteilles d’agarose (~5 mm de haut) à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique dont l’embout est coupé. Une fois préparé, conserver dans une boîte de Petri à 4 °C enveloppée dans du papier d’aluminium.
2. Micro-aiguilles en verre
   1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté avec un extracteur pour obtenir de fines aiguilles (réglages: HEAT 990, PULL 550).
      NOTE: A partir d’un capillaire, il est possible d’obtenir deux fines aiguilles d’un diamètre de pointe de 10 μm.

2. Croisement des poissons et collecte des œufs

1. Transférer les poissons adultes dans des bassins de reproduction 3 jours avant l’implantation tissulaire, comme décrit par Avdesh et ^al.17.
2. REMARQUE : Un ratio de 1:1 ou 2:3 hommes/femmes est recommandé. La densité de poisson devrait être de cinq poissons maximum par litre d’eau. Gardez les mâles et les femelles séparés par une barrière pendant la nuit.
3. Le lendemain, enlevez la barrière et laissez les poissons s’accoupler.
4. Retirez les poissons des bassins d’élevage et ramenez-les dans leurs bassins d’hébergement.
5. Versez l’eau du bassin d’élevage à travers un filet à mailles fines. Transférer les œufs fécondés dans une boîte de Petri avec milieu de poisson zèbre E3.
6. Vérifiez la boîte de Petri avec un stéréomicroscope et jetez les œufs troubles. Conserver les œufs fécondés dans un milieu de poisson zèbre E3 frais à 28 °C.

3. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Pinces autoclaves et poignée de scalpel.

1. Traitement immédiat
   1. Prélever l’échantillon chirurgical de tumeur dans 10 mL de milieu tumoral à 4 °C (échantillon tumoral allant de 5 mm à 10 mm de diamètre). Transférer l’échantillon à 4 °C de l’emplacement souhaité pour un traitement immédiat.
2. Stockage pendant la nuit (facultatif)
   1. Prélever l’échantillon de tumeur chirurgicale dans 10 mL de milieu tumoral et conserver l’échantillon pendant la nuit à 4 °C.
3. Stockage à -80 °C (facultatif, le moins recommandé)
   1. Conserver l’échantillon à -80 °C dans un flacon cryogénique en milieu tumoral supplémenté en diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 %.

4. Traitement des échantillons

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

1. Laver tout le tissu tumoral avec 5 ml de milieu tumoral frais, en pipetant de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Aspirer et jeter le produit de lavage. Répétez cette étape 3x.
   REMARQUE: Évitez l’aspiration du tissu tumoral car il pourrait rester attaché à la pipette Pasteur en plastique.
2. Transférer l’échantillon dans une boîte de Petri et l’immerger dans 1-2 mL de milieu tumoral frais. Couper l’échantillon tumoral en petits morceaux (1-2 mm³) à l’aide d’une lame de scalpel et les placer dans un tube en plastique stérile de 5 ml avec milieu tumoral.
3. Réglez le hacheur à papier tissu McIlwain sur une épaisseur de 100 μm. Placez les fragments d’échantillon sur la table circulaire en plastique du hachoir et hachez-les. Faites pivoter la table de 90° et répétez le hachage.
4. Centrifuger les fragments à 300 × g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et jetez-le.
5. Incuber les fragments avec un traqueur cellulaire fluorescent, CM-DiI (concentration finale de 10 μg/mL dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentration finale de 1 μL/mL dans DPBS) ou CellTrace (concentration finale de 5 μM dans DPBS) pendant 30 min, en plaçant le tube dans un bain-marie à 37 °C.
6. Remettez les fragments en suspension en les pipiquant doucement de haut en bas toutes les 10 minutes.
   REMARQUE: Dans le cas de CellTrace, ajouter un milieu contenant au moins 1% de protéines à la fin de l’incubation, selon les instructions du fabricant.
7. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape 3x avec 1 mL de DPBS pour éliminer le colorant non incorporé.
8. Suspendre les fragments dans 5 mL de DPBS dans une boîte de Petri de 60 mm.
   REMARQUE: Assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas.

5. Mise en place de zPDX

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

1. Anesthésier les embryons 2 jours après la fécondation (dpf) avec 0,16 mg/mL de tricaïne dans un milieu de poisson zèbre E3.
2. Mettez trois cylindres d’agarose (étape 1.1.3) dans une boîte de Petri et déposez un embryon de poisson zèbre sur un cylindre, en exposant un côté. Retirez l’excès de solution pour garder l’embryon dans un film mince.
3. Transférer le morceau de tissu coloré avec une pince stérile de la boîte de Petri au support d’agarose à 1% où se trouve l’embryon. Ramassez le tissu, placez-le sur le jaune d’embryon, puis poussez-le dans l’espace périvitellin à l’aide de la micro-aiguille en verre tiré thermiquement (étape 1.2.1).
4. Ajouter doucement quelques gouttes de pénicilline-streptomycine E3 1% (Pen-Strep) à l’embryon pour le ramener dans le liquide.
5. Répétez les étapes 5.2-5.4 pour tous les embryons, et enfin, retirez les supports d’agarose de la boîte de Petri et incuber les embryons à 35 °C.
6. Vérifiez les embryons pour les xénogreffes correctes (coloration positive) 2 h après l’implantation à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Jetez les embryons avec des fragments tumoraux qui ne sont pas complètement à l’intérieur de l’espace périvitellin, ainsi que les embryons morts. Répartir au hasard les embryons dans six plaques multipuits (maximum n = 20 embryons/puits), également divisées en groupes selon le plan expérimental (p. ex., témoin et FOLFOXIRI).

6. Traitement

1. Diluer le médicament (p. ex. 5-fluorouracile, oxaliplatine, irinotécan) dans E3 1% Pen-Strep, en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Comme proposé par Usai et ^coll.12, utiliser une dilution quintuple du médicament dans l’eau du poisson, par rapport à la concentration plasmatique équivalente (CPE).
2. Mélanger les médicaments pour préparer le cocktail (par ex. FOLFOXIRI).
3. Retirer le média de chaque puits et ajouter le cocktail de médicaments 2 h après l’implantation.
4. Traiter les embryons pendant 3 jours. Renouvelez le cocktail de médicaments tous les jours.

7. Coloration immunofluorescente à montage entier

REMARQUE : Avant de commencer, placer l’acétone à -20 °C et préparer les solutions indiquées dans le tableau 1.

1. Jour 1 :
   1. Fixer les larves avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans des flacons en verre à 4 °C pendant la nuit.
2. Jour 2 :
   1. Laver les larves 3 x 5 min avec 1 mL de PBS, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 rpm).
   2. Conserver dans 1 mL de méthanol à 100 % à -20 °C pendant la nuit (ou pour un entreposage à long terme).
   3. Réhydrater 3 x 10 min avec 1 mL de PTw (0,1 % d’interpolation dans PBS), en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   4. Perméabiliser avec 1 mL de Tris-HCl 150 mM à pH 8,8 pendant 5 min à TA, puis chauffer pendant 15 min à 70 °C.
   5. Laver 2 x 10 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   6. Laver 2 x 5 min avec 1 mL de_dH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   7. Perméabiliser avec 1 mL d’acétone glacée pendant 20 min à -20 °C.
   8. Laver 2 x 5 min avec 1 mL de_dH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   9. Laver 2 x 5 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   10. Incuber les larves dans 1 mL de tampon bloquant pendant 3 h à 4 °C, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
   11. Placer les larves dans des plaques de puits divisées par groupe comme suit : 10 larves dans 50 μL de volume/puits dans une plaque de 96 puits ou 20 larves dans 100 μL de volume/puits dans une plaque de 48 puits.
   12. Jeter le tampon de blocage, incuber les larves avec une solution d’anticorps primaires (p. ex. caspase-3 clivée anti-humain de lapin, 1:250) diluée dans un tampon d’incubation pendant une nuit à 4 °C dans l’obscurité, et balancer doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés.
3. Jour 3 :
   1. Laver les larves séquentiellement 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS (10% de sérum de chèvre, 1% de Triton X-100 dans PBS) puis, avec 2 x 10 min avec 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 dans PBS) et 2 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS. À chaque lavage, agiter délicatement les plaques contenant les larves sur une plaque vibrante (400 tr/min).
   2. Incuber les larves avec des anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent (p. ex. anticorps secondaire adsorbé croisé IgG [H+L] anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 647, 1:500) et 100 μg/mL Hoechst 33258 dilué dans un tampon d’incubation dans l’obscurité pendant une nuit à 4 °C, en agitant doucement sur une plaque agitatrice (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés de solution d’anticorps secondaires.
4. Jour 4 :
   1. Laver 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS et 2 x 1 h avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min).
   2. Créez une couche circulaire avec l’émail (épaisseur de ~0,5-1 mm) sur des lames de microscope. Laissez l’émail sécher et placez les larves au centre de la couche circulaire, exposant le côté de la xénogreffe.
   3. Sécher l’excès de solution et monter la lamelle de couverture en verre avec un support de montage soluble dans l’eau et non fluorescent.

8. Imagerie

1. Capturez des images sous microscopie confocale avec un objectif 40x. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants : une résolution de 1024 x 512 pixels avec un espacement Z de 5 μm.

9. Analyse de l’apoptose par ImageJ

1. Chargez le logiciel ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) et ouvrez l’image du fichier Z-stack (cliquez sur Fichier | Ouvert). Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Affichage de la pile/Hyperstack et cliquez sur OK.
2. Superposez les différents canaux en sélectionnant Image | Couleur | Faire composite.
3. Faites glisser la barre Z au bas de l’image pour parcourir l’image Z-stack et identifier la zone de xénogreffe (cellules qui sont fluorescentes tracker positives. Voir étape 4.5) dans l’espace périvitelline du poisson zèbre.
4. Sélectionnez Point Tool et comptez le nombre de cellules humaines apoptotiques (positif au tracker cellulaire fluorescent et à la caspase clivée-3), comme indiqué dans la vidéo supplémentaire S1.
5. Double-cliquez sur l’icône Point Tool , changez le compteur et comptez le nombre total de noyaux de cellules humaines (noyaux de cellules CM-DiI positives).

Ce protocole décrit l’approche expérimentale pour établir des zPDX à partir d’adénocarcinome pancréatique humain primaire. Un échantillon de tumeur a été recueilli, haché et coloré à l’aide d’un colorant fluorescent, comme décrit dans la section 4 du protocole. Les zPDX ont ensuite été établis avec succès par implantation d’un morceau de tumeur dans l’espace périvitelline de 2 embryons de poisson-zèbre dpf, comme décrit dans la section 5 du protocole. Comme décrit dans la section 6 du protocole, les zPDX ont été examinés plus avant pour identifier les profils de sensibilité à la chimiothérapie des cellules cancéreuses dérivées du patient. Par exemple, l’association de chimiothérapie FOLFOXIRI (5-fluorouracile, acide folinique, oxaliplatine et irinotécan) a été testée, car elle est utilisée comme chimiothérapie de première intention pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique avancé et le cancer colorectal métastatique. Des images entières des zPDX ont été acquises sous forme de piles Z au microscope confocal, et l’induction de l’apoptose a été analysée comme décrit dans les sections 8 et 9 du protocole. Comme le montre la figure 1A, B, la thérapie combinée a entraîné une augmentation de l’apoptose cellulaire par rapport au groupe témoin. Dans l’étude de cas rapportée ici, une augmentation statistiquement significative de la fraction de cellules apoptotiques dans les xénogreffes implantées a été identifiée pour le groupe traité par FOLFOXIRI par rapport au groupe témoin (Figure 1C).

Tableau 1 : Solutions et supports utilisés dans le protocole.

Figure supplémentaire S1 : L’échantillon tumoral de PDAC a été coloré DiO (vert) et xénogreffé dans l’espace périvitellin de 2 embryons de poisson zèbre dpf.Après un temps d’incubation de 3 jours, les zPDX ont été injectés avec 2 μg/mL d’iodure de propidium (PI; rouge), puis soumis à une imagerie confocale 3D. La viabilité cellulaire a été vérifiée en mesurant les cellules PI-positives sur le nombre total de cellules humaines (DiO positif). Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; DPF = jours après la fécondation; zPDX = xénogreffe dérivée de patients de poisson zèbre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire S1 : Exemple de comptage apoptotique de cellules humaines, à l’aide de l’outil multipoint d’ImageJ. La vidéo est une pile Z d’un zPDX 3 jours après l’implantation, acquis après immunomarquage de la caspase-3 clivée et du Hoechst 33258. Abréviations : zPDX = xénogreffe dérivée de patients de poisson zèbre. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.