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Article de méthode

Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

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DOI :

10.3791/63744

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12 mai 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Dans cet article

Résumé

Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.

Résumé

Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde et l’incidence de nombreux types de cancer continue d’augmenter. Beaucoup de progrès ont été réalisés en termes de dépistage, de prévention et de traitement; Cependant, les modèles précliniques qui prédisent le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer font encore défaut. Pour combler cette lacune, un modèle de xénogreffe in vivo dérivé de patients a été développé et validé. Le modèle était basé sur des embryons de poisson zèbre (Danio rerio) 2 jours après la fécondation, qui ont été utilisés comme receveurs de fragments de xénogreffe de tissu tumoral prélevés sur l’échantillon chirurgical d’un patient.

Il convient également de noter que les échantillons bioptiques n’ont pas été digérés ou désagrégés, afin de maintenir le microenvironnement tumoral, ce qui est crucial en termes d’analyse du comportement tumoral et de la réponse au traitement. Le protocole détaille une méthode pour établir des xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre à partir de la résection chirurgicale primaire de tumeur solide. Après criblage par un anatomopathologiste, le spécimen est disséqué à l’aide d’une lame de scalpel. Les tissus nécrotiques, les vaisseaux ou les tissus adipeux sont enlevés, puis coupés en morceaux de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

Les morceaux sont ensuite marqués par fluorescence et xénotransplantés dans l’espace périvitellin des embryons de poisson zèbre. Un grand nombre d’embryons peuvent être traités à faible coût, ce qui permet des analyses in vivo à haut débit de la chimiosensibilité des zPDX à plusieurs médicaments anticancéreux. Des images confocales sont systématiquement acquises pour détecter et quantifier les niveaux apoptotiques induits par le traitement de chimiothérapie par rapport au groupe témoin. La procédure de xénogreffe présente un avantage de temps significatif, car elle peut être achevée en une seule journée, offrant une fenêtre de temps raisonnable pour effectuer un dépistage thérapeutique pour les essais cocliniques.

Introduction

L’un des problèmes de la recherche clinique sur le cancer est que le cancer n’est pas une maladie unique, mais une variété de maladies différentes qui peuvent évoluer au fil du temps, nécessitant des traitements spécifiques en fonction des caractéristiques de la tumeur elle-même et du patient1. Par conséquent, le défi consiste à s’orienter vers une recherche sur le cancer axée sur le patient, afin d’identifier de nouvelles stratégies personnalisées pour la prédiction précoce des résultats du traitement du cancer2. Ceci est particulièrement pertinent pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), car il est considéré comme un cancer difficile à traiter, avec un taux de survie à 5 ans de 11%3.

Le diagnostic tardif, la progression rapide et le manque de thérapies efficaces demeurent les problèmes cliniques les plus urgents de l’ACPE. Le principal défi est donc de modéliser le patient et d’identifier les biomarqueurs qui peuvent être appliqués en clinique pour sélectionner la thérapie la plus efficace en ligne avec la médecine personnalisée 4,5,6. Au fil du temps, de nouvelles approches ont été proposées pour modéliser les maladies cancéreuses : les organoïdes dérivés de patients (AOP) et les xénogreffes dérivées de souris (mPDX) provenaient d’une source de tissu tumoral humain. Ils ont été utilisés pour reproduire la maladie afin d’étudier la réponse et la résistance au traitement, ainsi que la récurrence de la maladie 7,8,9.

De même, l’intérêt pour les modèles de xénogreffe dérivée de patients (zPDX) à base de poisson zèbre a augmenté, grâce à leurs caractéristiques uniques et prometteuses10, représentant un outil rapide et peu coûteux pour la recherche sur le cancer11,12. Les modèles zPDX ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon tumoral, ce qui rend possible le dépistage à haut débit de la chimiothérapie13. La technique la plus couramment utilisée pour les modèles zPDX est basée sur la digestion complète de l’échantillon et l’implantation des populations cellulaires primaires, ce qui reproduit partiellement la tumeur, mais présente les inconvénients d’un manque de microenvironnement tumoral et de diaphonie entre cellules malignes et saines14.

Ce travail montre comment les zPDX peuvent être utilisés comme modèle préclinique pour identifier le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer du pancréas. La stratégie précieuse facilite le processus de xénogreffe, car il n’y a pas besoin d’expansion cellulaire, ce qui permet d’accélérer le dépistage de la chimiothérapie. La force du modèle est que tous les composants du microenvironnement sont maintenus tels quels dans le tissu cancéreux du patient, car, comme on le sait, le comportement de la tumeur dépend de leur interaction15,16. Ceci est très favorable aux méthodes alternatives dans la littérature, car il est possible de préserver l’hétérogénéité tumorale et de contribuer à améliorer la prévisibilité du résultat du traitement et de la rechute d’une manière spécifique au patient, permettant ainsi au modèle zPDX d’être utilisé dans les essais cocliniques. Ce manuscrit décrit les étapes impliquées dans la fabrication du modèle zPDX, en commençant par un morceau de résection tumorale du patient et en le traitant pour analyser la réponse à la chimiothérapie.

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Protocole

Le ministère italien de la Santé publique a approuvé toutes les expérimentations animales décrites, conformément à la directive 2010/63/UE sur l’utilisation et les soins des animaux. Le comité d’éthique local a approuvé l’étude, sous le numéro d’enregistrement 70213. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets concernés. Avant de commencer, toutes les solutions et l’équipement doivent être préparés (section 1) et les poissons doivent être croisés (section 2).

1. Préparation des solutions et des équipements

REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les solutions et les supports à préparer.

  1. Support de gel d’agarose
    1. Peser la poudre d’agarose dans une fiole micro-ondable et la dissoudre dans un volume donné de milieu de poisson zèbre E3 pour obtenir un gel à 1%. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
      REMARQUE: Ne pas trop faire bouillir la solution.
    2. Versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri et attendez que le gel se soit complètement solidifié.
    3. Fabriquer de petites bouteilles d’agarose (~5 mm de haut) à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique dont l’embout est coupé. Une fois préparé, conserver dans une boîte de Petri à 4 °C enveloppée dans du papier d’aluminium.
  2. Micro-aiguilles en verre
    1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté avec un extracteur pour obtenir de fines aiguilles (réglages: HEAT 990, PULL 550).
      NOTE: A partir d’un capillaire, il est possible d’obtenir deux fines aiguilles d’un diamètre de pointe de 10 μm.

2. Croisement des poissons et collecte des œufs

  1. Transférer les poissons adultes dans des bassins de reproduction 3 jours avant l’implantation tissulaire, comme décrit par Avdesh et al.17.
  2. REMARQUE : Un ratio de 1:1 ou 2:3 hommes/femmes est recommandé. La densité de poisson devrait être de cinq poissons maximum par litre d’eau. Gardez les mâles et les femelles séparés par une barrière pendant la nuit.
  3. Le lendemain, enlevez la barrière et laissez les poissons s’accoupler.
  4. Retirez les poissons des bassins d’élevage et ramenez-les dans leurs bassins d’hébergement.
  5. Versez l’eau du bassin d’élevage à travers un filet à mailles fines. Transférer les œufs fécondés dans une boîte de Petri avec milieu de poisson zèbre E3.
  6. Vérifiez la boîte de Petri avec un stéréomicroscope et jetez les œufs troubles. Conserver les œufs fécondés dans un milieu de poisson zèbre E3 frais à 28 °C.

3. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Pinces autoclaves et poignée de scalpel.

  1. Traitement immédiat
    1. Prélever l’échantillon chirurgical de tumeur dans 10 mL de milieu tumoral à 4 °C (échantillon tumoral allant de 5 mm à 10 mm de diamètre). Transférer l’échantillon à 4 °C de l’emplacement souhaité pour un traitement immédiat.
  2. Stockage pendant la nuit (facultatif)
    1. Prélever l’échantillon de tumeur chirurgicale dans 10 mL de milieu tumoral et conserver l’échantillon pendant la nuit à 4 °C.
  3. Stockage à -80 °C (facultatif, le moins recommandé)
    1. Conserver l’échantillon à -80 °C dans un flacon cryogénique en milieu tumoral supplémenté en diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 %.

4. Traitement des échantillons

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

  1. Laver tout le tissu tumoral avec 5 ml de milieu tumoral frais, en pipetant de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Aspirer et jeter le produit de lavage. Répétez cette étape 3x.
    REMARQUE: Évitez l’aspiration du tissu tumoral car il pourrait rester attaché à la pipette Pasteur en plastique.
  2. Transférer l’échantillon dans une boîte de Petri et l’immerger dans 1-2 mL de milieu tumoral frais. Couper l’échantillon tumoral en petits morceaux (1-2 mm3) à l’aide d’une lame de scalpel et les placer dans un tube en plastique stérile de 5 ml avec milieu tumoral.
  3. Réglez le hacheur à papier tissu McIlwain sur une épaisseur de 100 μm. Placez les fragments d’échantillon sur la table circulaire en plastique du hachoir et hachez-les. Faites pivoter la table de 90° et répétez le hachage.
  4. Centrifuger les fragments à 300 × g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et jetez-le.
  5. Incuber les fragments avec un traqueur cellulaire fluorescent, CM-DiI (concentration finale de 10 μg/mL dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentration finale de 1 μL/mL dans DPBS) ou CellTrace (concentration finale de 5 μM dans DPBS) pendant 30 min, en plaçant le tube dans un bain-marie à 37 °C.
  6. Remettez les fragments en suspension en les pipiquant doucement de haut en bas toutes les 10 minutes.
    REMARQUE: Dans le cas de CellTrace, ajouter un milieu contenant au moins 1% de protéines à la fin de l’incubation, selon les instructions du fabricant.
  7. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape 3x avec 1 mL de DPBS pour éliminer le colorant non incorporé.
  8. Suspendre les fragments dans 5 mL de DPBS dans une boîte de Petri de 60 mm.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas.

5. Mise en place de zPDX

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

  1. Anesthésier les embryons 2 jours après la fécondation (dpf) avec 0,16 mg/mL de tricaïne dans un milieu de poisson zèbre E3.
  2. Mettez trois cylindres d’agarose (étape 1.1.3) dans une boîte de Petri et déposez un embryon de poisson zèbre sur un cylindre, en exposant un côté. Retirez l’excès de solution pour garder l’embryon dans un film mince.
  3. Transférer le morceau de tissu coloré avec une pince stérile de la boîte de Petri au support d’agarose à 1% où se trouve l’embryon. Ramassez le tissu, placez-le sur le jaune d’embryon, puis poussez-le dans l’espace périvitellin à l’aide de la micro-aiguille en verre tiré thermiquement (étape 1.2.1).
  4. Ajouter doucement quelques gouttes de pénicilline-streptomycine E3 1% (Pen-Strep) à l’embryon pour le ramener dans le liquide.
  5. Répétez les étapes 5.2-5.4 pour tous les embryons, et enfin, retirez les supports d’agarose de la boîte de Petri et incuber les embryons à 35 °C.
  6. Vérifiez les embryons pour les xénogreffes correctes (coloration positive) 2 h après l’implantation à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Jetez les embryons avec des fragments tumoraux qui ne sont pas complètement à l’intérieur de l’espace périvitellin, ainsi que les embryons morts. Répartir au hasard les embryons dans six plaques multipuits (maximum n = 20 embryons/puits), également divisées en groupes selon le plan expérimental (p. ex., témoin et FOLFOXIRI).

6. Traitement

  1. Diluer le médicament (p. ex. 5-fluorouracile, oxaliplatine, irinotécan) dans E3 1% Pen-Strep, en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Comme proposé par Usai et coll.12, utiliser une dilution quintuple du médicament dans l’eau du poisson, par rapport à la concentration plasmatique équivalente (CPE).
  2. Mélanger les médicaments pour préparer le cocktail (par ex. FOLFOXIRI).
  3. Retirer le média de chaque puits et ajouter le cocktail de médicaments 2 h après l’implantation.
  4. Traiter les embryons pendant 3 jours. Renouvelez le cocktail de médicaments tous les jours.

7. Coloration immunofluorescente à montage entier

REMARQUE : Avant de commencer, placer l’acétone à -20 °C et préparer les solutions indiquées dans le tableau 1.

  1. Jour 1 :
    1. Fixer les larves avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans des flacons en verre à 4 °C pendant la nuit.
  2. Jour 2 :
    1. Laver les larves 3 x 5 min avec 1 mL de PBS, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 rpm).
    2. Conserver dans 1 mL de méthanol à 100 % à -20 °C pendant la nuit (ou pour un entreposage à long terme).
    3. Réhydrater 3 x 10 min avec 1 mL de PTw (0,1 % d’interpolation dans PBS), en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    4. Perméabiliser avec 1 mL de Tris-HCl 150 mM à pH 8,8 pendant 5 min à TA, puis chauffer pendant 15 min à 70 °C.
    5. Laver 2 x 10 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    6. Laver 2 x 5 min avec 1 mL dedH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    7. Perméabiliser avec 1 mL d’acétone glacée pendant 20 min à -20 °C.
    8. Laver 2 x 5 min avec 1 mL dedH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    9. Laver 2 x 5 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    10. Incuber les larves dans 1 mL de tampon bloquant pendant 3 h à 4 °C, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    11. Placer les larves dans des plaques de puits divisées par groupe comme suit : 10 larves dans 50 μL de volume/puits dans une plaque de 96 puits ou 20 larves dans 100 μL de volume/puits dans une plaque de 48 puits.
    12. Jeter le tampon de blocage, incuber les larves avec une solution d’anticorps primaires (p. ex. caspase-3 clivée anti-humain de lapin, 1:250) diluée dans un tampon d’incubation pendant une nuit à 4 °C dans l’obscurité, et balancer doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés.
  3. Jour 3 :
    1. Laver les larves séquentiellement 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS (10% de sérum de chèvre, 1% de Triton X-100 dans PBS) puis, avec 2 x 10 min avec 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 dans PBS) et 2 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS. À chaque lavage, agiter délicatement les plaques contenant les larves sur une plaque vibrante (400 tr/min).
    2. Incuber les larves avec des anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent (p. ex. anticorps secondaire adsorbé croisé IgG [H+L] anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 647, 1:500) et 100 μg/mL Hoechst 33258 dilué dans un tampon d’incubation dans l’obscurité pendant une nuit à 4 °C, en agitant doucement sur une plaque agitatrice (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés de solution d’anticorps secondaires.
  4. Jour 4 :
    1. Laver 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS et 2 x 1 h avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min).
    2. Créez une couche circulaire avec l’émail (épaisseur de ~0,5-1 mm) sur des lames de microscope. Laissez l’émail sécher et placez les larves au centre de la couche circulaire, exposant le côté de la xénogreffe.
    3. Sécher l’excès de solution et monter la lamelle de couverture en verre avec un support de montage soluble dans l’eau et non fluorescent.

8. Imagerie

  1. Capturez des images sous microscopie confocale avec un objectif 40x. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants : une résolution de 1024 x 512 pixels avec un espacement Z de 5 μm.

9. Analyse de l’apoptose par ImageJ

  1. Chargez le logiciel ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) et ouvrez l’image du fichier Z-stack (cliquez sur Fichier | Ouvert). Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Affichage de la pile/Hyperstack et cliquez sur OK.
  2. Superposez les différents canaux en sélectionnant Image | Couleur | Faire composite.
  3. Faites glisser la barre Z au bas de l’image pour parcourir l’image Z-stack et identifier la zone de xénogreffe (cellules qui sont fluorescentes tracker positives. Voir étape 4.5) dans l’espace périvitelline du poisson zèbre.
  4. Sélectionnez Point Tool et comptez le nombre de cellules humaines apoptotiques (positif au tracker cellulaire fluorescent et à la caspase clivée-3), comme indiqué dans la vidéo supplémentaire S1.
  5. Double-cliquez sur l’icône Point Tool , changez le compteur et comptez le nombre total de noyaux de cellules humaines (noyaux de cellules CM-DiI positives).

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Résultats

Ce protocole décrit l’approche expérimentale pour établir des zPDX à partir d’adénocarcinome pancréatique humain primaire. Un échantillon de tumeur a été recueilli, haché et coloré à l’aide d’un colorant fluorescent, comme décrit dans la section 4 du protocole. Les zPDX ont ensuite été établis avec succès par implantation d’un morceau de tumeur dans l’espace périvitelline de 2 embryons de poisson-zèbre dpf, comme décrit dans la section 5 du protocole. Comme décrit dans la section 6 du protocole, les zPDX ont été examinés...

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Discussion

Les modèles in vivo dans la recherche sur le cancer fournissent des outils inestimables pour comprendre la biologie du cancer et prédire la réponse au traitement du cancer. Actuellement, différents modèles in vivo sont disponibles, par exemple, des animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockout) ou des xénogreffes dérivées de patients à partir de cellules primaires humaines. Malgré de nombreuses caractéristiques optimales, chacune a des limites différentes. En particulier, les modèles ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la Fondazione Pisa (projet 114/16). Les auteurs tiennent à remercier Raffaele Gaeta de l’unité d’histopathologie de l’Azienda Ospedaliera Pisana pour la sélection des échantillons de patients et le soutien en pathologie. Nous remercions également Alessia Galante pour le soutien technique dans les expériences. Cet article est basé sur les travaux de COST Action TRANSPAN, CA21116, soutenus par COST (Coopération européenne en science et technologie).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-fluorouracileTeva Pharma AGSMP 1532755
48 plaque multipuitsSarstedt83 3923
96 plaque multipuitsSarstedt82.1581.001
acétoneMerck179124
poudre d’agarose  ;MerckA9539
AmphotéricineThermo Fisher Scientific15290018
Anticorps anti-noyaux, clone 235-1MerckMAB1281  ;Dilution de 1:200
Filet d’aquarium QN6Penn-plax0-30172-23006-6
BSAMerckA9418
CellTraceThermo Fisher ScientificC34567
CellTracker CM-DiI  ;Thermo Fisher ScientificC7001
CellTracker Rouge Profond  ;Thermo Fisher ScientificC34565
Caspase-3 clivée (Asp175) (5A1E) Technologiede signalisation cellulaire9661Sdilution 1:250
Diméthylsulfoxyde (DMSO)  ;Réactifs PanReac AppliChem ITWA3672,0250
Dumont #5 pincesWorld Precision Instruments501985
Acide folinique -  ; LederfolinPfizer
Capillaires en verre, 3,5 poDrummondScientific Company3-000-203-G/XDiamètre extérieur = 1,14 mm. Diamètre intérieur = 0,53 mm.
Flacons en verre  ;VWR InternationalWHEAW224581
Chèvre anti-Lapin IgG  ; (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-21244²  ;   ;Dilution de 1:500
Sérum de chèvreThermo Fisher Scientific31872
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IrinotecanHospira
Flacons de congélation à basse températureVWR International479-1220
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
Mélangeurde microplaquesSCILOGEX822000049999
OxaliplatineTeva
ParaformaldéhydeMerckP6148-500G
PBSThermo Fisher Scientific14190094
Pénicilline-streptomycine  ;Thermo Fisher Scientific15140122
Boîte de Pétri 100 mmSarstedt83 3902500
Boîte de Pétri 60 mmSarstedt83 3901
Pipette Pasteur en plastiqueSarstedt86.1171.010
Poly-MountTebu-bio18606-5
Iodure de propidiumMerckP4170
RPMI-1640 moyenThermo Fisher Scientific11875093
Lame de scalpel No 10 Stérile en acier inoxydableVWR InternationalSWAN3001
Manche #3World Precision Instruments500236
TricaineMerckE10521
Triton X-100  ;MerckT8787
Tween 20MerckP9416
Extracteur de micropipette verticaleInstrument d’obturateurP-30  ;
mAb de lapin

Références

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