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Article de méthode

Un modèle hépatocytaire compétent examinant l’entrée du virus de l’hépatite B par le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium comme cible thérapeutique

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DOI :

10.3791/63761

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10 mai 2022

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour dépister les composés anti-virus de l’hépatite B (VHB) ciblant les étapes du cycle de vie d’entrée pré et post-virale, en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme pour mesurer l’affinité de liaison (KD) avec le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium de l’hôte. L’efficacité antivirale a été déterminée par la suppression des marqueurs du cycle de vie viral (formation d’ADNcc, transcription et assemblage viral).

Résumé

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) a été considérée comme un facteur de risque crucial pour le carcinome hépatocellulaire. Le traitement actuel ne peut que réduire la charge virale, mais n’entraîne pas de rémission complète. Un modèle hépatocytes efficace pour l’infection par le VHB offrirait un cycle de vie viral réaliste qui serait crucial pour le dépistage des agents thérapeutiques. La plupart des agents anti-VHB disponibles ciblent les étapes du cycle de vie après l’entrée virale, mais pas avant l’entrée virale. Ce protocole détaille la génération d’un modèle d’hépatocytes compétent capable de dépister des agents thérapeutiques ciblant les étapes du cycle de vie de l’entrée prévirale et post-entrée virale. Cela comprend le ciblage de la liaison au polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium (NTCP), la formation d’ADNCC, la transcription et l’assemblage viral basés sur l’imHC ou l’HepaRG en tant que cellules hôtes. Ici, le test d’inhibition de l’entrée du VHB a utilisé la curcumine pour inhiber les fonctions de liaison et de transport du VHB via NTCP. L’affinité de liaison (KD) avec le PNCB avec le PNCB a été évaluée à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), un outil universel pour le dépistage des médicaments contre le VHB basé sur des paramètres thermodynamiques.

Introduction

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est considérée comme une maladie potentiellement mortelle dans le monde entier. L’infection chronique par le VHB est chargée d’un risque de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire1. Le traitement anti-VHB actuel se concentre principalement sur l’entrée post-virale à l’aide d’analogues nucléos(t)ide (NA) et d’interféron alpha (IFN-α)2,3. La découverte d’un inhibiteur de l’entrée du VHB, Myrcludex B, a permis d’identifier une nouvelle cible pour les agents anti-VHB4. La combinaison d’inhibiteurs d’entrée et d’AN dans le VHB chronique a considérablement réduit la charge virale par rapport à ceux ciblant uniquement la réplication virale 5,6. Cependant, le modèle classique d’hépatocytes pour le dépistage des inhibiteurs de l’entrée du VHB est limité par de faibles niveaux de récepteurs viraux (polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium, NTCP). La surexpression du PCNh dans les cellules d’hépatome (c.-à-d. HepG2 et Huh7) améliore l’infectiositédu VHB 7,8. Néanmoins, ces lignées cellulaires expriment de faibles niveaux d’enzymes métabolisant les médicaments de phase I et II et présentent une instabilité génétique9. Les modèles hépatocytes qui peuvent aider à cibler des mécanismes distincts des composés anti-VHB candidats tels que l’entrée prévirale, la liaison au PNCP et l’entrée virale accéléreraient l’identification et le développement de schémas thérapeutiques combinés efficaces. L’étude sur l’activité anti-VHB de la curcumine a élucidé l’inhibition de l’entrée virale en tant que nouveau mécanisme en plus de l’interruption post-entrée virale. Ce protocole détaille un modèle hôte pour le criblage des molécules d’entrée anti-VHB10.

L’objectif de cette méthode est d’explorer des composés anti-VHB candidats pour l’inhibition de l’entrée virale, en particulier le blocage de la liaison et du transport du NTCP. Comme l’expression du PNCP est un facteur critique pour l’entrée et l’infection du VHB, nous avons optimisé le protocole de maturation des hépatocytes pour maximiser les niveaux de NTCP11. En outre, ce protocole peut différencier l’effet inhibiteur sur l’entrée du VHB comme inhibition de l’attachement du VHB par rapport à l’inhibition de l’internalisation. Le test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA) a également été modifié à l’aide d’une méthode basée sur ELISA au lieu d’un radio-isotope pour représenter le transport du PNCC12,13. L’interaction récepteur et ligand a été confirmée par leurs structures 3D14,15. L’inhibition de la fonction du PNCC peut être évaluée en mesurant l’activité d’absorption du TCA16. Cependant, cette technique n’a pas fourni de preuve directe de la liaison du PNCC aux inhibiteurs candidats. Par conséquent, la liaison peut être étudiée à l’aide de diverses techniques, telles que la résonance plasmoniquede surface 17, ELISA, le test de décalage thermique basé sur la fluorescence (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen et diverses autres méthodes20. Parmi ces techniques, l’ITC est un standard d’objectif dans l’analyse de liaison car il permet d’observer l’absorption ou l’émission de chaleur dans presque toutes les réactions21. L’affinité de liaison (KD) du PNCC et des composés candidats a été directement évaluée à l’aide de l’ITC; Ces valeurs d’affinité étaient plus précises que celles obtenues à l’aide du modèle de prédiction in silico 22.

Ce protocole couvre les techniques de maturation des hépatocytes, d’infection par le VHB et de dépistage des inhibiteurs d’entrée du VHB. En bref, un modèle d’hépatocytes a été développé à partir de lignées cellulaires imHC et HepaRG. Les cellules en culture ont été différenciées en hépatocytes matures en 2 semaines. La régulation positive des niveaux de NTCP a été détectée à l’aide de la PCR en temps réel, du transfert Western et de la cytométrieen flux 11. Le virion de l’hépatite B (VHB) a été produit et recueilli à partir de l’hépatite HepG2.2.15. L’icHC différencié ou HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) a été traité de manière prophylactique avec les candidats anti-VHB 2 h avant l’inoculation avec le virion du VHB. Le résultat attendu de l’expérience était l’identification des agents qui diminuent le VHB cellulaire et l’infectiosité. L’activité anti-PNCC a été évaluée à l’aide du test d’absorption du TCA. L’activité du PNCP pouvait être supprimée par les agents qui liaient spécifiquement le PNCP. La technique ITC a été utilisée pour étudier la faisabilité d’une liaison interactive qui pourrait prédire les inhibiteurs et leurs protéines cibles, en déterminant l’affinité de liaison (KD) du ligand pour le récepteur via des interactions non covalentes du complexe biomoléculaire23,24. Par exemple, K D ≥ 1 × 103 mM représente une liaison faible, K D ≥ 1 × 106 μM représente une liaison modérée et K D ≤ 1 × 109 nM représente une liaison forte. Le ΔG est directement corrélé avec les interactions de liaison. En particulier, une réaction avec ΔG négatif est une réaction exergonique, indiquant que la liaison est un processus spontané. Une réaction avec un ΔH négatif indique que les processus de liaison dépendent de la liaison hydrogène et des forces de Van der Waals. L’absorption du TCA et les données de l’ITC pourraient être utilisées pour dépister les agents anti-VHB. Les résultats de ces protocoles peuvent fournir une base non seulement pour le dépistage anti-VHB, mais aussi pour l’interaction avec le PNCP telle qu’évaluée par affinité de liaison et fonction de transport. Cet article décrit la préparation et la caractérisation des cellules hôtes, la conception expérimentale et l’évaluation de l’entrée anti-VHB ainsi que l’affinité de liaison NTCP.

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Protocole

NOTA: Les procédures suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement à risque biologique de classe II ou une hotte à écoulement laminaire. La manipulation du VHB a été approuvée sur le plan éthique par la CISR (MURA2020/1545). Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les solutions, réactifs, équipements et lignées cellulaires utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des cellules hôtes (hépatocytes matures)

  1. Cultiver les hépatocytes (3,75 × 105 cellules HepaRG ou imHC) et conserver dans une fiole de culture de 75 cm2 avec 10 mL de milieu DMEM/F12 complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Attendez que les cellules atteignent 80%-90% de confluence (dans 1 semaine).
  2. Jeter l’ancien milieu de la fiole et laver les cellules avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  3. Aspirer le PBS et ajouter 4 mL de trypsine-EDTA à 0,05%.
  4. Incuber la fiole dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-3 min, et vérifier les cellules adhérentes à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille d’objectif 10x. Assurez-vous que la monocouche s’est détachée de la surface de culture.
  5. Inhiber la trypsine en ajoutant 4 mL du milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS dans le ballon et remettre soigneusement en suspension les cellules récoltées. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 3 min à 300 × g, 25 °C.
  6. Aspirer le surnageant de la pastille cellulaire et remettre en suspension avec 1-2 mL du milieu de culture préchauffé complété avec 10% FBS et antibiotiques.
  7. Mélanger 10 μL de la suspension cellulaire et du bleu de trypan et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% avant de passer à l’étape suivante.
  8. Ensemencer 1 × 106 cellules par 2 mL dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et maintenir dans un milieu complet DME/F12 jusqu’à ce que les cellules atteignent 100 % de confluence.
  9. Pour la maturation hépatique, préparer un milieu de maturation hépatique (milieu E de Williams complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone, 2 mM de L-glutamine et 2 % de DMSO).
  10. Remplacez le milieu de culture 2x par semaine.
  11. Maintenir les hépatocytes dans le milieu de maturation pendant 2 semaines pour obtenir des hépatocytes matures prêts pour l’infection par le VHB.

2. Quantification du PNÇ cellulaire

  1. Mesure de l’expression du PNCC à l’aide de la PCR en temps réel
    1. Recueillir la pastille d’hépatocytes matures par trypsinisation (voir les étapes 1.2-1.5).
    2. Extraire l’ARN total de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN avec traitement à la DNase I.
    3. Synthétiser l’ADNc à partir de 200 ng d’ARN total à l’aide d’une amorce oligo-dT et d’un système de transcription inverse en suivant les instructions du fabricant.
    4. Diluer l’ADNc à 50 ng / μL et l’utiliser comme modèle pour la réaction PCR. Mélanger 2 μL de l’ADNc dilué avec les réactifs du mélange maître de PCR contenant la solution du kit qRT-PCR vert SYBR avec 5 μM d’amorces spécifiques au PNCT (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' et 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Pour la normalisation, utiliser GAPDH comme gène d’entretien ménager avec des amorces spécifiques (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' et 5'-AAATGAGCCAGCCTTCTC-3').
    6. Amplifier les échantillons d’ADNc à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions de température suivantes : 1 cycle de 3 min à 95 °C (dénaturation initiale) ; 40 cycles de 30 s à 95 °C (dénaturation), 30 s à 60 °C à 65 °C (recuit), 30 s à 72 °C (extension); 1 cycle de 5 min à 72 °C (extension finale).
    7. Calculer le changement de pli NTCP dans les hépatocytes matures sur les cellules indifférenciées en utilisant GAPDH comme gène calibrateur basé sur la méthode 2-ΔΔCT .
  2. Quantifier le PNCC à l’aide de l’analyse par transfert Western
    1. Récolter les hépatocytes à l’aide d’un grattoir cellulaire et les centrifuger à 300 x g, 25 °C pendant 5 min pour recueillir la pastille cellulaire.
    2. Suivez les instructions du fabricant du tampon RIPA pour extraire la protéine cellulaire avec 100 μL de tampon RIPA contenant 1x inhibiteur de protéase.
    3. Mesurer la concentration totale de protéines à l’aide de la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA).
    4. Mélanger 12,5 μL de protéines avec 2x colorant de charge dans un rapport de 1:1 par volume.
    5. Faire bouillir le mélange de protéines et l’échelle étalon à 95 °C pendant 5 min.
    6. Ajouter 1x tampon courant à la chambre d’électrophorèse.
    7. Charge 5 μL de l’échelle étalon des protéines ou 20 μL du mélange de protéines bouillies dans un gel de polyacrylamide à 10 % (p/v).
    8. Effectuer une électrophorèse sur gel : 50 V pendant 30 min puis 90 V pendant 1 h à température ambiante.
    9. Préparez une membrane PVDF en la trempant dans du méthanol pendant 30 s, lavez-la à l’eau bidistillée pendant 1-2 min, et faites-la tremper avec deux morceaux de papier filtre dans un tampon de transfert pendant 10 min ou jusqu’à utilisation.
    10. Placer le papier filtre sur la plaque anodique d’une cellule de transfert semi-sèche; Ensuite, placez la membrane PVDF, le gel et le papier filtre sur le dessus, dans cet ordre.
    11. Transférer les protéines du gel à la membrane PVDF à 10 V pendant 25 min à température ambiante.
    12. Bloquer la membrane avec une solution de blocage WB pendant 1 h à température ambiante.
    13. Incuber la membrane avec un polypeptide cotransportant du taurocholate antisodique (anti-NTCP) (dilution 1:100) à 4 °C pendant une nuit.
    14. Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST.
    15. Incuber la membrane avec un anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution de 1:10 000) pendant 1 h à température ambiante.
    16. Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST puis 1 x 5 min avec TBS.
    17. Détecter le PNCC à l’aide d’un substrat HRP (voir le tableau des matériaux).
    18. Ajouter au moins 0,1 mL de solution de substrat HRP/cm2 de la membrane et incuber la membrane pendant 3 à 5 minutes dans l’obscurité.
    19. Visualisez le PNCC à l’aide d’un système de documentation sur gel en mode chimiluminescence, sélectionnez l’option de marqueur pour la membrane, ajustez le temps d’exposition avec le mode cumulatif toutes les 1 minutes et prenez la photo avec différents temps d’exposition pendant 5 minutes.
    20. Stripper et sonder le transfert avec un anticorps anti-GAPDH de souris (dilution de 1:200 000) et un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué HRP (dilution de 1:10 000).
  3. Mesure du niveau de PNCC à l’aide de la cytométrie en flux
    1. Recueillir les granulés cellulaires des hépatocytes matures en incubant les cellules avec 8 mM d’EDTA pendant 15 min.
      REMARQUE: Évitez d’utiliser de la trypsine ou d’autres protéases qui peuvent perturber les récepteurs de surface cellulaire. Comme le NTCP est une protéine réceptrice de surface cellulaire, les dommages dus à la trypsinisation peuvent donner des résultats négatifs.
    2. Fixer les hépatocytes avec 300 μL de paraformaldéhyde à 3,7% dans 1x PBS pendant 15 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
    3. Laver les cellules 2x avec 700 μL de 1x PBS avec 1% FBS (v/v), centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, ajouter 300 μL de Triton X-100 à 0,05% dans du PBS à la pastille de cellule, et incuber les cellules à température ambiante pendant 20 min pour les perméabiliser.
    4. Centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, laver la pastille de la cellule 3 x 1 min avec 700 μL de PBS contenant 1% FBS (v/v). Incuber les cellules avec l’anticorps primaire contre le PNCP (dilution 1:100) à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
    5. Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C. Remettez en suspension la pastille de la cellule avec 200 μL de PBS avec 1% FBS (v / v).
    6. Allumez le cytomètre en flux, réchauffez le laser pendant 15 minutes et effectuez un nettoyage de routine.
    7. Sélectionnez les paramètres de mesure, y compris la diffusion directe (FSC), la diffusion latérale (SSC) et l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine (PE), et réglez le réglage de la compensation automatique par le logiciel. Inclure les échantillons de contrôle de compensation : contrôle non coloré, contrôle coloré FITC et contrôle coloré PE.
      REMARQUE : Les paramètres FSC et SSC sont utilisés pour déterminer la taille et la granularité des cellules individuelles afin de sélectionner la population cellulaire pour l’analyse de contrôle. Le détecteur de canal de fluorescence a des canaux FITC et PE . Pour ce protocole, sélectionnez le canal FITC pour détecter Alexa Fluor 488.
    8. Exécuter l’échantillon non coloré avec un débit fluidique moyen (60 μL/min), ajuster le seuil de FSC et de SSC jusqu’à ce qu’ils couvrent la population cellulaire d’intérêt, marquer la région de la porte dans cette zone et appliquer à tous les contrôles de compensation.
    9. Réglez le tube photomultiplicateur de fluorescence (PMT) à l’aide de la commande non colorée et ajustez la tension PMT de FITC ou PE dans le quadrant négatif. Exécutez l’échantillon coloré positif et ajustez FITC ou PE dans l’échelle du quadrant positif. Exécutez les contrôles non tachés, FITC ou PE, calculez la compensation et appliquez-la aux paramètres de l’échantillon. Exécutez l’échantillon d’hépatocytes pour mesurer le niveau NTCP.
    10. Analyser les hépatocytes colorés à l’aide d’un logiciel de cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux).
      1. Sous les fenêtres BD FACSuite, cliquez sur le tube de contrôle dans l’onglet Sources de données et attendez que les données brutes apparaissent.
      2. Dans l’onglet Feuille de calcul sur le côté droit, cliquez sur le bouton Porte d’ellipse , sélectionnez la population de cellules dans SSC et le diagramme à points FSC à l’aide du curseur de la souris, puis attendez que le cercle P1 apparaisse.
      3. Cliquez sur le bouton Interval Gate et marquez la région dans l’histogramme FITC, en commençant par la valeur d’intensité de fluorescence la plus élevée vers la droite. Observez la ligne P2 qui apparaît.
      4. Cliquez sur le tube d’expérience et observez que les données de l’onglet Feuille de calcul changent. Cliquez sur le bouton Statistiques , puis sur l’espace vide dans la feuille de calcul. Observez les valeurs statistiques de la population du PNCET qui apparaissent.

3. Production des particules HBV dérivées de cultures cellulaires (HBVcc)

  1. Culture HepG2.2.15 en milieu complet (DMEM supplémenté avec 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) dans une boîte de Petri de 10 cm pendant 24 h.
  2. Remplacer le milieu complet supplémenté par 380 μg/mL de génétique (G418) lorsque l’hépatite HepG2.2.15 atteint une confluence de 60 % à 70 %. Récolter le milieu conditionné tous les 2 jours; conserver le milieu contenant le VHB à 4 °C.
  3. Enlevez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 5 000 × g, 4 °C pendant 20 min. Prélever le milieu conditionné à l’aide d’une seringue de 20 mL et le filtrer à travers un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires.
  4. Pour concentrer le VHB, diluer 1 volume de concentrateur avec 3 volumes du surnageant filtré de l’étape 3.3 dans un tube centrifuge conique et mélanger soigneusement la solution par inversion de tube. Placer le mélange à 4 °C pendant 1 h. Centrifuger la solution pendant 1 h à 1 500 × g, 4 °C et s’assurer qu’une pastille blanc cassé est visible.
    REMARQUE : Pour chaque tranche de 30 mL de surnageant filtré de l’étape 3.3, ajouter 10 mL du concentrateur pour atteindre 40 mL de volume total.
  5. Évaluer le titre du VHB (équivalent du génome) avec le réplicon WT HBV 1,3-mer comme courbe standard allant de 1 × 102 à 1 × 1010 en utilisant la PCR absolue en temps réel, comme décrit précédemment11.
  6. Reconstituer délicatement la pastille dans du FBS et conserver jusqu’à 1 an à −80 °C dans des aliquotes à usage unique.

4. Test d’entrée anti-VHB

  1. Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
  2. Aspirer le milieu, puis ajouter la curcumine (10-30 μM) ou 4 μM de cyclosporine A (CsA) diluée avec le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer le candidat inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylène glycol.
  3. Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 par puits et incuber à 37 °C pendant 18 h. Jeter le surnageant, ajouter 2 ml de PBS froid et agiter doucement pour rincer l’ancien milieu avec le VHB non lié.
  4. Ajouter 2 ml de milieu complet William’s E et cultiver pendant 7 jours. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 1x PBS et fixer les cellules avec 3,7% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Perméabiliser et bloquer les cellules infectées avec une solution bloquante de l’IF (0,2% de Triton X-100 et 3% d’albumine sérique bovine dans du PBS) et les incuber pendant 60 min à température ambiante.
  5. Ajouter l’anticorps primaire (antigène central anti-VHB) à 1:200 de dilution dans la solution bloquante et incuber pendant une nuit à 4 °C. Laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage (0,5% Tween 20 dans PBS).
  6. Ajouter l’anticorps secondaire (dilution 1:500) à la solution bloquante de l’IF, incuber pendant 1 h à température ambiante et laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage.
  7. Montez l’échantillon avec un support de montage antifade avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et couvrez avec un couvercle en verre. Détecter le signal de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI (Ex 352-402 nM et Em 417-477) et d’un filtre PE (Ex 542-582 et Em 604-644), ainsi que d’une lentille d’objectif 20x, et déterminer l’activité d’entrée anti-HBV des composés candidats.

5. Test de liaison aux cellules HBV

  1. Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
  2. Aspirer le milieu, puis ajouter de la curcumine (10-30 μM) ou de la cyclosporine A (4 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer l’inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylèneglycol.
  3. Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une MOI de 100 par puits et incuber à 4 °C pendant 2 h pour permettre la liaison du VHB aux hépatocytes. Jeter le milieu contenant le VHB non lié, ajouter 2 mL de PBS froid et agiter doucement pour éliminer les traces du milieu usé.
  4. Récoltez les cellules infectées à l’aide d’un grattoir cellulaire et perturbez les cellules avec un tampon de lyse. Transférer le lysat dans un tube de prélèvement et extraire l’ADN total pour évaluer l’ADN du VHB en utilisant la PCR en temps réel avec des amorces spécifiques pour le VHB (amorce directe: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', et amorce inverse: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') en utilisant PRNP (amorce avant: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', amorce inverse: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') comme contrôle interne.
  5. Amplifier les produits de PCR dans un thermocycleur en utilisant les conditions de température décrites à l’étape 2.1.
  6. Calculer les taux relatifs d’ADN du VHB/1 × 106 cellules dans le traitement par rapport au contrôle en utilisant PRNP comme gène calibrateur basé sur la méthode 2-ΔΔCT .

6. Test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA)

  1. Maintenir 100% de cellules confluentes imHC et HepaRG dans le milieu de maturation pendant 14 jours.
  2. Aspirer le milieu et laver les hépatocytes avec 1x PBS. Ajouter la curcumine ou la cyclosporine A (10-50 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Remplacer le milieu par la solution d’acide taurocholique sodique (0,5 M d’hydrate de taurocholate de sodium dans 1x HEPES) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  3. Aspirer la solution d’acide taurocholique sodique et laver 3x avec froid 1x HEPES. Ajouter 300-500 μL de froid 1x HEPES et récolter les cellules avec des grattoirs cellulaires sur de la glace.
  4. Homogénéiser les cellules par ultrasons à une fréquence de 20 kHz pendant 20 s et incuber sur glace pendant 5 min. Centrifuger les lysats à 10 000 × g pendant 20 min pour précipiter les débris cellulaires. Prélever le surnageant et évaluer la concentration intracellulaire d’acide taurocholique à l’aide d’une trousse de dosage TCA ELISA (voir le tableau des matériaux).

7. Détermination des interactions protéine-ligand par titrage calorimétrique isotherme

REMARQUE : Ce système d’analyse a été développé à partir du logiciel MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

  1. Préparer le tampon (tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0).
  2. Préparer 15 μM de NTCP dans le tampon.
  3. Préparer des solutions candidates d’inhibiteur d’entrée du VHB de 150 μM dans le tampon.
  4. Lavez la cellule d’échantillon, la cellule de référence et la seringue dans l’instrument ITC à l’aide du tampon (étape 7.1.).
    1. Lancez le logiciel ITC en double-cliquant sur l’icône du logiciel dans les systèmes Windows. Sous l’onglet Run experiment highlight (Exécuter la mise en surbrillance de l’expérience), sélectionnez microCal Method for 19 Injection.itcm (Méthode microCal pour 19 Injection.itcm) et cliquez sur Open (Ouvrir). Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, cliquez sur l’onglet Nettoyer, et dans la fenêtre Méthode de nettoyage, sélectionnez le bouton Lavage pour Méthode de nettoyage des cellules et le bouton Rincer pour Méthode de nettoyage à la seringue. Cliquez sur Suivant et suivez les instructions à l’écran.
      REMARQUE: L’étape de lavage peut prendre 1,4 heure.
  5. Charger l’échantillon dans l’ITC; sous l’onglet Exécuter l’expérience , cliquez sur le bouton Charger et lisez les instructions à l’écran. Cliquez sur suivant et suivez les instructions vidéo jusqu’à ce que cette étape de chargement soit terminée.
    1. Remplir la cellule de référence avec un tampon de solution à l’aide d’une seringue. Remplir la cellule d’échantillon avec 15 μM de PNCE dans un tampon à l’aide d’une seringue et retirer l’excès de solution de PNCNT sur la cellule d’échantillon. Remplissez la seringue avec une solution de curcumine (ligand) de 150 μM, en évitant les bulles d’air dans la seringue.
  6. Exécutez l’exemple et, sous l’onglet Run Experiment (Exécuter l’expérience ), cliquez sur le bouton Run (Exécuter ). Observez les fenêtres sur le côté gauche montrant les informations expérimentales et le cadre expérimental. Entrez les concentrations de ligand et de protéines comme 150 μM dans [ Syr], 15 μM dans [Cell] et 25 °C en température.
  7. Dans le logiciel, cliquez sur Démarrer pour effectuer le processus d’injection et attendez 1,4 h pour que l’interaction protéine-ligand soit terminée.
    REMARQUE: Le bouton d’analyse fané apparaît sous les fenêtres du logiciel.
  8. Observez que le bouton d’analyse s’éclaircit une fois l’injection terminée. Cliquez sur le bouton d’analyse dans le logiciel de contrôle pour analyser les données brutes à l’aide du logiciel d’analyse . Cliquez sur Vue d’ensemble pour afficher les données brutes et choisissez le modèle d’ajustement comme un ensemble de site de liaison.
  9. Assurez-vous que l’état de liaison affiche les données expérimentales (données de liaison, d’absence de liaison, de contrôle ou de vérification) et que les valeurs d’expérience (KD, ΔG, ΔH, TΔS et N) sont présentées sur le panneau du logiciel.
  10. Exportez les paramètres thermodynamiques qui prédisent la liaison d’interaction, y compris la liaison hydrogène, la liaison van der Waals et l’interaction hydrophobe au format tif ou jpeg.
  11. Une fois l’expérience terminée, laver la cellule d’échantillon en suivant l’étape 7.4.

8. Analyse statistique

  1. Effectuer toutes les expériences dans trois répétitions indépendantes (n = 3).
  2. Présenter les données expérimentales comme moyen ± SD et effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel d’analyse statistique souhaité.
  3. Utilisez un test t de Students bilatéral non apparié pour comparer deux valeurs moyennes ou appliquez une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec Dunnett pour des comparaisons multiples entre plusieurs valeurs et une valeur de contrôle. Définissez le seuil de signification à p ≤ 0,05.

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Résultats

Des caractéristiques de maturation hépatique ont été observées, y compris des cellules binucléées et une morphologie de forme polygonale (Figure 1), en particulier au stade différencié de l’HCi (Figure 1A). Une forte augmentation de l’expression du PNNT a été mesurée dans le d-HepaRG et le d-imHC à 7 fois et 40 fois, respectivement (Figure 1B). La forme hautement glycosylée du PNCP, supposée conférer une susceptibilité à l’entrée du...

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Discussion

L’infection par le VHB est initiée par une liaison de faible affinité aux protéoglycanes sulfate d’héparane (HSPG) sur les hépatocytes25, suivie de la liaison au PNCP avec internalisation ultérieure par endocytose26. Comme le PNCP est un récepteur crucial pour l’entrée du VHB, cibler l’entrée du VHB peut être cliniquement traduit pour diminuer l’infection de novo , la transmission mère-enfant (TME) et la récidive après une transplantation hépatique. L’interruption ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Ce projet de recherche est soutenu par l’Université Mahidol et le Thailand Science Research and Innovation (TSRI) attribué séparément à A. Wongkajornsilp et K. Sa-ngiamsuntorn. Ces travaux ont été soutenus financièrement par le Conseil de la politique de l’Office of National Higher Education, Science, Recherche et Innovation par l’intermédiaire de l’Unité de gestion du programme pour la compétitivité (numéro de subvention C10F630093). A. Wongkajornsilp est récipiendaire d’une bourse Chalermprakiat de la Faculté de médecine de l’hôpital Siriraj de l’Université Mahidol. Les auteurs tiennent à remercier Mlle Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculté des sciences, Université Mahidol) pour son aide avec la technique ITC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fortes
HepaRG, cryopréservéesThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Lignée cellulaire d’hépatoblastome humainMerckSCC249
Reagents
4 % Paraformadehyde Phosphate Buffer SolutionFUJIFLIM Wako chimique163-20145
BD Tampon de perfusion/lavageBD Biosciences554723Tampon de perfusion/lavage
Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 sel de disulfateMerck108321-42-2
Halt Inhibiteur de protéase Cocktail Sans EDTA (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM Kits d’isolement d’ARN Mini SpinHealthcare25-0500-71
Illustra Kit d’isolement d’ARN RNAspin MiniHealthcare25-0500-71
Système de transcription inverse ImProm-IIPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentrateurTakara bioPT4421-2Concentrateur
Luminata crescendo Western HRP substratMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Kit d’extraction d’ADN nucléospinmacherey-nagel1806/003
Solution saline tamponnée au phosphateMerckP3813
Polyéthylène glycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
Tampon de lyse RIPA (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsine-EDTAGibco25200072Diluer à 0,125
 %Anticorps
 ;   ;   ; Anticorps anti-NTCP1Abcamab131084dilution 1:100
  ;   ; Anticorps anti-GAPDHThermo Fisher ScientificAM4300dilution 1:200 000
  ;   ; Anticorps anti-lapin de chèvre conjugué HRPAbcamab205718dilution 1:10 000
  ;   ; HRP chèvre anti-souris anticorps secondaireAbcamab97023dilution 1:10 000
  ;   ; Anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008dilution
composition réactif
1° ; Tampon de dilution d’anticorps
  ;   ;   ; 1x TBST
  ;   ;   ;   ; 3 % BSASigmaA7906-100GConcentration de travail : 3
 %   ;   ;   ; Azoture de sodiumSigma199931Concentration de travail : 0,05 %
milieu de croissance des hépatocytes
  ;   ;   ;   ; DME/F12Gibco12400-024
  ;   ;   ;   ;   ; 10 % FBSSigma AldrichF7524
  ;   ;   ;   ;   ; 1 % Pen/StrepHyClonSV30010
  ;   ;   ;   ;   ; 1 % GlutaMAXGibco35050-061
moyen de maturation hépatique
  ;   ;   ;   ;   ; Williams E mediumSigma AldrichW4125-1L
  ;   ;   ;   ;   ; 10 % FBSSigma AldrichF7524
  ;   ;   ;   ;   ; 1 % Pen/StrepHyClonSV30010
  ;   ;   ;   ;   ; 1 % GlutaMAXGibco35050-061
  ;   ;   ;   ;   ; 5 et micro ; g/mL  ; InsulineSigma Aldrich91077C-100MG
  ;   ;   ;   ; 50 et micro ; M hydrocotisoneSigma AldrichH0888-1g
  ;   ;   ;   ; 2 % DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Solution bloquante
  ;   ;   ;   ; 1xPBS Gibco21300-058
  ;   ;   ;   ; 3 % BSASigmaA7906-100GConcentration de travail : 3
 %   ;   ;   ; 0,2 % Triton X-100SigmaT8787Concentration de travail : 0,2
solution tampon de lyse RIPAMerck20-188Concentration finale : 1X
  ;   ;   ; Cocktail d’inhibiteurs de protéaseThermo Scientific78425Concentration finale : 1X
  ;   ;   ;   ;   ;   ; Na3VO4Concentration finale : 1 mM
 ;   ;   ;   ;   ;   ; PMSFConcentration finale : 1 mM
  ;   ;   ;   ;   ;   ; NaFConcentration finale : 10 mM
réactif de transfert Western
  ;   ;   ;   ; 10x solution saline tamponnée au tris (TBS)Bio-Rad170-6435Concentration finale : 1X
  ;   ;   ;   ; Préadolescent 20Merck9005-64-5
  ;   ;   ;   ; 1x TBST0,1 % Tween 20
  ;   ;   ;   ; 1xPBS Gibco21300-058
  ;   ;   ;   ; Kit de dosage des protéines Pierce BCAThermo Fisher ScientificA53225
  ;   ;   ;   ; Gel de polyacrylamideBio-Rad161-0183
  ;   ;   ;   ; Persulfate d’ammonium (APS)Bio-Rad161-0700Concentration finale : 0,05 %
  ;   ; TEMEDBio-Rad161-0800Gel d’empilage : 0,1 %, Gel résolveur : 0,05 %
  ;   ; 2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Concentration finale : 1X
  ;   ;   ; Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Solution bloquante/ 2° ; Tampon de dilution d’anticorps
  ;   ;   ; 1x TBST
  ;   ;   ;   ; 5 % Lait écrémé (lait écrémé en poudre)Bio-Rad170-6404Concentration de travail : 5
 %1x Tampon coulant 1 L
  ;   ;   ;   ;   ; 10x solution saline tamponnée au tris (TBS)Bio-Rad170-6435Concentration finale : 1X
  ;   ;   ;   ; GlycineSigmaG889814,4 g
  ;   ;   ;   ; FDSMerck7910Concentration de travail : 0,1 %
tampon de transfert Blot 500 mL
  ;   ;   ;   ; 10x solution saline tamponnée au tris (TBS)Bio-Rad170-6435Concentration finale : 1X
  ;   ;   ;   ; GlycineSigmaG88987,2 g
  ;   ;   ;   ; MéthanolMerck106009100 mL
Solution de décapage douce 1 LAjuster le pH à 2,2
  ;   ;   ; GlycineSigmaG889815 g
  ;   ;   ;   ; FDSMerck79101 g
  ;   ;   ;   ; Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
Tube à centrifuger de 15 mLCorning430052
Tube à centrifuger de 50 mLCorning430291
Airstream Classe IIEsco2010621Armoire de sécurité biologique
CelCulture CO2 IncubateurEsco2170002Incubateur de culture tissulaire humidifié
CFX96 Touch Détecteur PCR en temps réelBio-Rad1855196
FACSVerse Flow CytometerBD Biosciences651154
Pipettes graduées (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Pipettes graduées (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCCalorimètres de titrage isothermeMalvern
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Chambre d’électrophorèse
Mini papier filtre absorbant Trans-blotBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
Contrôleur de pipetteEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Alimentation
Membrane PVDFMerckIPVH00010
Fiole de culture cellulaire T-75Corning431464U
Trans-Blot SD Cellule de transfert semi-sècheBio-Rad1703940Cellule de transfert semi-sèche
Processeur à ultrasons (Vibra-Cell VCX 130)Sonique & Matériaux
Centrifugeuse réfrigérée de table VersatiCentrifugeuse EscoT1000Ravec godet oscillant rotatif
GE GE  %

Références

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