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Article de méthode

Lysat plasmatique riche en plaquettes pour le traitement des maladies de la surface oculaire

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DOI :

10.3791/63772

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2 août 2022

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1Transfusion Medicine Unit, AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, 2Interdepartmental Centre for Regenerative Medicine “Stefano Ferrari”, University of Modena and Reggio Emilia, 3Clinical and Experimental Medicine PhD Program, University of Modena and Reggio Emilia

Dans cet article

Résumé

Les lysats plaquettaires représentent un outil émergent pour le traitement des maladies de la surface oculaire. Ici, nous proposons une méthode pour la préparation, la distribution, le stockage et la caractérisation du lysat plaquettaire prélevé sur des donneurs de plaquettes.

Résumé

Diverses maladies de la surface oculaire sont traitées avec des gouttes oculaires dérivées du sang. Leur utilisation a été introduite dans la pratique clinique en raison de leur teneur en métabolites et en facteurs de croissance, ce qui favorise la régénération de la surface oculaire. Les gouttes ophtalmiques à base de sang peuvent être préparées à partir de différentes sources (c.-à-d. don de sang total ou d’aphérèse plaquettaire), ainsi qu’avec différents protocoles (p. ex. différentes dilutions et cycles de congélation et de décongélation). Cette variabilité entrave la standardisation des protocoles cliniques et, par conséquent, l’évaluation de leur efficacité clinique. Le détail et le partage des procédures méthodologiques peuvent contribuer à la définition de lignes directrices communes. Au cours des dernières années, les produits allogéniques se sont diffusés comme alternative aux traitements autologues car ils garantissent des normes d’efficacité plus élevées; parmi eux, les gouttes ophtalmiques au lysat plasma riche en plaquettes (PRP-L) sont préparées selon des procédures de fabrication simples. Dans l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, le PRP-L est obtenu par don d’aphérèse plaquettaire. Ce produit est initialement dilué à 0,3 x 10 9 plaquettes/mL (à partir d’une concentration moyenne de 1 x 10 9 plaquettes/mL) dans0,9% de NaCl. Les plaquettes diluées sont congelées/décongelées et, par la suite, centrifugées pour éliminer les débris. Le volume final est divisé en aliquotes de 1,45 mL et stocké à −80 °C. Avant d’être délivrés aux patients, les gouttes oculaires sont testées pour la stérilité. Les patients peuvent conserver les lysats plaquettaires à -15 °C jusqu’à 1 mois. La composition du facteur de croissance est également évaluée à partir d’aliquotes choisies au hasard, et les valeurs moyennes sont rapportées ici.

Introduction

Les produits dérivés du sang sont largement utilisés dans le soin des plaies1, la chirurgie maxillo-faciale et orthopédique et pour le traitement de différentes maladies de la surface oculaire2 telles que la sécheresse oculaire (DED)3. Dans la DED, l’homéostasie du film lacrymal est altérée en raison du fonctionnement anormal de différents facteurs impliqués dans la production de larmes et l’intégrité de la surface oculaire 4,5.

La DED est caractérisée par une hétérogénéité dans les causes et la gravité 6,7,8 et peut être une conséquence de différents facteurs comme le vieillissement, le sexe9, les lentilles de contact, les médicaments topiques ou systémiques 10, ou des conditions préexistantes comme le syndrome de Gougerot-Sjögren 10. Malgré des symptômes bénins, la DED affecte des millions de personnes dans le monde, ce qui a un impact sur leur qualité de vie et sur le système de santé6.

De nombreux traitements ont été rapportés pour cette pathologie, mais il n’y a toujours pas de consensus sur la solution la plus efficace12. À ce jour, les larmes artificielles sont la première ligne de traitement visant à restaurer la composition aqueuse du film lacrymal, bien que ces substituts ne contiennent pas les principaux solutés biologiquement actifs des larmes naturelles 6,11. Les produits à base de plaquettes sont considérés comme une alternative valable12,13 aux larmes artificielles, bien que leur efficacité clinique, leurs recommandations d’utilisation et leurs méthodes de préparation fassent encore l’objet de débats3.

Les produits sanguins partagent avec les larmes une composition similaire en termes de métabolites14, protéines, lipides, vitamines, ions, facteurs de croissance (GF), composés antioxydants 11 et osmolarité (300 mOsm/L)11. Grâce à l’activité synergique de leurs composants, ils favorisent la régénération de l’épithélium cornéen, inhibent la libération de cytokines inflammatoires et augmentent le nombre de cellules caliciformes et l’expression des mucines dans la conjonctive 2,3.

Jusqu’à présent, l’hétérogénéité des produits ophtalmiques à base de sang a été documentée dans la littérature; Ces produits peuvent être classés selon l’origine du donneur de sang, c’est-à-dire autologue ou allogénique, ainsi que la source de sang, c’est-à-dire le sang périphérique, le sang de cordon, le sérum ou les plaquettes.

Bien que les produits autologues aient été les plus répandus3, les produits allogéniques deviennent maintenant le choix préféré, car ils garantissent des normes d’efficacité et de sécurité plus élevées 15, ainsi qu’une réduction significative des coûts16,17. Des études antérieures ont en effet prouvé que les produits sanguins obtenus à partir de patients atteints de maladies auto-immunes et/ou systémiques peuvent présenter une altération de la qualité et de la fonctionnalité 6,16,17. Malgré le fait que les gouttes ophtalmiques à base de sérum soient les plus répandues, les produits à base de plaquettes se sont récemment affirmés comme une alternative valable, car ils peuvent être facilement préparés tout en maintenant des niveaux d’efficacitésignificatifs 3,11. Les produits à base de plaquettes actuellement disponibles peuvent être divisés en plasma riche en plaquettes (PRP), en lysat de plasma riche en plaquettes (PRP-L) et en plasma riche en facteurs de croissance (PRGF)3.

Parmi eux, le PRP-L a l’avantage d’être un produit surgelé longue conservation. Le PRP-L peut être préparé à partir d’aphérèse, de couches leucocytaires ou même de plaquettes expirant (PLT)18,19, ce qui réduit précieusement leur gaspillage. Les aliquotes peuvent être conservées pendant des mois dans les centres de transfusion sanguine à -80 °C ou même au domicile des patients à -15 °C pendant des périodes plus courtes.

Les PRP-L sont hautement enrichis en GF, dont il a été prouvé qu’ils stimulent la régénération de la surface oculaire 12,20,21. Néanmoins, il n’y a que peu d’études cliniques rapportées dans ce domaine, et toutes ont utilisé des sources autologues 3,22. Le PRP-L doit encore faire l’objet d’une validation et d’une caractérisation plus poussées avant de pouvoir être utilisé systématiquement pour le traitement des maladies de la surface oculaire, car il n’existe pas de lignes directrices normalisées pour sa préparation, sa distribution et son entreposage3.

Ici, un protocole détaillé est partagé pour la production de PRP-L utilisé à l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, et la dispensation aux patients atteints de DED. Notre objectif est d’aider la communauté scientifique à développer des méthodes de préparation standard, qui peuvent augmenter l’homogénéité et la cohérence des études et des approches cliniques mondiales.

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Protocole

Le PRP-L utilisé pour l’évaluation quantitative des facteurs de croissance a été recueilli dans le cadre d’une étude plus large sur la caractérisation des produits PRP à des fins régénératives, réalisée à l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia et approuvée par le comité d’éthique Area Vasta Emilia Nord le 10 janvier 2019 (protocole numéro 2019/0003319). Les donateurs ont donné leur consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Aucune approbation éthique n’était nécessaire pour recueillir les données agrégées et anonymes du questionnaire sur l’indice des maladies de la surface oculaire (IDSO), qui est couramment utilisé par les cliniciens pour surveiller les symptômes du syndrome de l’œil sec. La figure 1A montre un aperçu du protocole suivi, tandis que les images de la figure 1B illustrent les principales étapes de la procédure.

1. Collecte de plasma riche en plaquettes (PRP)

  1. Aphérèse PRP
    1. Pour ce protocole, sélectionnez les donneurs de plaquettes conformément aux lois italiennes: les donneurs de plaquettes doivent être âgés de 18 à 65 ans, avec des paramètres normaux de pression et de numération globulaire et une numération plaquettaire d’au moins 180 x 109 plaquettes / L23. Les donneurs admissibles ne peuvent pas prendre d’antiplaquettaires ou d’anticoagulants dans la semaine précédant le don.
    2. Effectuer plasma-plaquettes-aphérèse à l’aide d’un système automatisé de prélèvement sanguin, conformément aux instructions des fabricants et aux lois nationales23, pour obtenir 1 unité de plasma riche en plaquettes (PRP) à donneur unique. Recueillir le PRP dans la solution anticoagulante de citrate d’adénine Dextrose Solution A (ACD-A).
      NOTE: L’aphérèse plaquettaire est réalisée avec une procédure continue; Le temps de collecte est compris entre 40 min et 90 min. La quantité de DCA administrée aux donneurs et la durée des interventions dépendent des caractéristiques du donneur, p. ex. hématocrite et jauge d’aiguille.
  2. Caractéristiques des unités PRP
    REMARQUE: L’étape suivante est généralement effectuée automatiquement par le système automatisé de prélèvement sanguin pendant la procédure plasma-plaquet-aphérèse. Veuillez consulter le manuel d’instructions du fabricant.
    1. Resuspendre les unités PRP recueillies par aphérèse dans une quantité adéquate de solution de conservation avec la quantité minimale de plasma résiduel, nécessaire pour maintenir un pH > 6,4 pendant toute la durée de stockage, jusqu’à un volume final moyen de 180 mL net de la solution anticoagulante (environ 40 mL).
      NOTE: Selon la loi italienne, les contrôles de qualité doivent évaluer que la numération plaquettaire (PLT) est d’au moins 2,0 x 1011 PLT / unité, tandis que les leucocytes résiduels doivent être inférieurs à 1 x 106 cellules / unité.
    2. Conserver le PRP leucodéplé et irradié pendant 5 jours au maximum à 22 °C ± 2 °C sur un agitateur plaquettaire avant toute nouvelle manipulation23.
  3. Dilution du PRP
    1. Immédiatement avant de commencer la dilution du PRP, effectuer une numération PLT avec un hémocytomètre en utilisant l’échantillon prélevé dans le sac principal à travers une pointe perforante.
      NOTE: Effectuer les étapes suivantes de la stérilité sous une cagoule de classe II pour les risques biologiques. Portez un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, gants et lunettes de protection) pendant la procédure.
    2. Diluer le PRP avec une quantité adéquate de NaCl stérile à 0,9 % jusqu’à une concentration finale de 0,32 x 10 9± 0,03 x 109 PLT/mL, ce qui simule la concentration moyenne de PLT dans le sang périphérique.
    3. Profitant d’un pic perçant pour les poches de sang, divisez le PRP dilué en sacs de collecte vides de 300 ml pour atteindre un volume net de 190 mL/sac.
    4. Utiliser une partie aliquote de PRP dilué résiduel (habituellement 1 mL) pour effectuer des contrôles de qualité évaluant les contaminations microbiennes possibles. Effectuer un essai de stérilité en suivant les instructions du fabricant dans un laboratoire de microbiologie (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Utilisez des flacons de culture spécifiques aux hémocultures aérobies, qui sont capables d’effectuer la culture qualitative et la récupération de micro-organismes aérobies (principalement des bactéries et des levures) à partir d’échantillons de sang de petit volume.
    5. Conservez les sacs de PRP dilués à −80 °C pendant un maximum de 2 mois avant la décongélation.

2. Préparation de lysat plasmatique riche en plaquettes (PRP-L)

  1. Décongélation
    1. Avant de commencer la procédure de décongélation, assurez-vous qu’un bain chaud est réglé à 37 °C. Mettez les sacs PRP dans le bain chaud et attendez jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
  2. Collecte PRP-L
    1. Centrifuger les sacs PRP à 3000 x g pendant 30 min à température ambiante.
      NOTE: Les étapes suivantes doivent être effectuées en stérilité sous une hotte de classe II pour risque biologique.
    2. En exploitant la pointe perforante du sac de transfert, connectez le sac centrifugé avec un sac de transfert stérile vide de 300 mL. Transférez soigneusement le surnageant PRP-L, tout en évitant les débris, dans le nouveau sac. Dans la mesure du possible, utilisez une presse à sac.
    3. Scellez le tube de connexion de l’unité PRP-L avec un scellant à sacs.
  3. PRP-L aliquote
    REMARQUE : Une unité de départ contenant 190 ml de PRP (voir l’étape 1.3.3.) est suffisante pour remplir deux trousses de gouttes ophtalmiques (pour plus de détails sur les dispositifs médicaux spécifiques utilisés pour l’application et la conservation des gouttes ophtalmiques à partir de composants sanguins, voir le tableau des matériaux). Les trousses de gouttes ophtalmiques doivent être ouvertes sous une hotte de classe II avec les flacons entiers placés au-dessus de la seringue préconnectée et la flèche centrale du robinet d’arrêt pointant vers la gauche pour exclure le filtre antibactérien.
    1. Prélever 30 à 60 ml de PRP-L avec une seringue stérile et relier la seringue au raccord Luer/lock sur la ligne de remplissage.
    2. Selon les instructions du fabricant, tournez le robinet d’arrêt d’un demi-tour pour ouvrir la ligne entre la seringue contenant du PRP-L et la seringue préconnectée. Remplissez la seringue préconnectée avec du PRP-L.
    3. Débranchez la seringue PRP-L, fermez le capuchon du tube de la connexion luer/lock et faites pivoter le robinet d’arrêt dans sa position d’origine. Utilisez la seringue du kit de gouttes ophtalmiques pour remplir les flacons de PRP-L.
    4. Répétez la procédure des étapes 2.3.1.-2.3.3. jusqu’à ce que tous les flacons applicateurs soient remplis. Assurez-vous que chaque applicateur est correctement rempli, puis scellez-les individuellement avec un scellant à sacs.
    5. Répétez la procédure avec un nouveau kit de gouttes ophtalmiques.
    6. Utiliser une petite partie aliquote de PRP-L dilué résiduel pour évaluer la contamination microbienne possible (voir étape 1.3.4.).
      REMARQUE: Si le liquide atteint accidentellement le filtre antibactérien à l’extrémité de la chaîne, la seringue d’aspiration peut s’opposer à la résistance, entravant le remplissage. Pour continuer le cycle de remplissage, soulevez la section d’extrémité de la ficelle pour environ 5/6 aliquotes du filtre hydrophobe antibactérien à l’extrémité de la ficelle. Dans cette position, utilisez une nouvelle seringue stérile (d’un volume de 30 mL) qui a déjà été remplie d’air. Connectez le luer/lock femelle du filtre antibactérien et appuyez fort et à plusieurs reprises sur le piston de la seringue pour éliminer tous les résidus de composants sanguins et libérer la membrane du filtre antibactérien du liquide. Retirez la seringue et remplissez les flacons restants.
  4. Stockage PRP-L
    1. Étiquetez correctement chaque applicateur et mettez-les dans un sac en plastique. Étiquetez également le sac en plastique, en prenant soin de mettre en évidence le groupe sanguin du donneur.
    2. Conserver à −80 °C pendant un maximum de 24 mois avant l’affectation du patient, conformément à la loi italienne23 et aux directives24.

3. Dispense de PRP-L

  1. Effectuer l’assignation du patient de préférence en faisant correspondre le groupe sanguin PRP-L. Livrer les flacons applicateurs de PRP-L à l’aide d’une glacière et s’assurer que chaque flacon d’applicateur contient 1,45 mL de PRP-L, ce qui correspond à environ 45 gouttes. Informez le patient que les flacons applicateurs peuvent être conservés au domicile du patient jusqu’à 1 mois à -15 °C.

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Résultats

La raison d’être de l’utilisation de gouttes ophtalmiques dérivées du sérum (qui est le produit sanguin le plus fréquemment utilisé pour le traitement des maladies de la surface oculaire) réside dans leur teneur en GF, qui sont presque entièrement dérivés des plaquettes circulantes. Le PRP contient un nombre significativement plus élevé de plaquettes (et, par conséquent, de GF dérivés des plaquettes) par rapport au sérum sanguin périphérique, allant de 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT/mL. Selon la législa...

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Discussion

Ces dernières années, l’utilisation clinique de produits à base de plaquettes pour les pathologies de surface oculaire a augmenté, mais leur diffusion est entravée par le manque de robustesse scientifique. Cela est principalement dû à la grande hétérogénéité des sources de donneurs et des protocoles de préparation, qui ne sont souvent pas entièrement divulgués ou ne sont pas spécifiquement conçus aux fins pour lesquelles ils sont dispensés. En particulier, les informations sur les produits à base de plaquettes recueillie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier la « Casa del Dono di Reggio Emilia » pour avoir fourni des concentrés de plaquettes dérivés de donneurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipments
CompoSeal Mobilea IIFresenius Kabi, Allemagnescelleuse de sacs
HeraSafe hoodHeraeus Instruments, AllemagneClasse II Hotte antirisque biologique
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection SystemHaemonetics, ItalieÉquipement automatisé de collecte de plasma et de composants multicomposants pour le don de plaquettes, de globules rouges, de plasma ou de composants sanguins combinés
Agitateur de plaquettes, PF396iHelmer, États-UnisAgitateur de plaquettes
Raycell Irradiateur de sang à rayons XMDS Nordion, CanadaIrradiateur de sang à rayons X
ROTIXA 50RSHettich Zentrifugen, AllemagneIntrigout à grande vitesse
Sysmex XS-1000iSysmex Europe GMBH, Allemagnehémocytomètre pour la numération plaquettaire
Bain chaud, WB-M15Falc Instruments, ItalieBain chaud
Matériaux
ACD-A solution anticoagulante AFenwal Inc., USADIN 00788139solution anticoagulante pour l’aphérèse plaquettaire (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Flacons de cultureBD Biosciences, États-UnisBD 442020Essai de stérilité
BD BACTEC Peds Plus/F Flacons de cultureBD Biosciences, États-Unis442020Au moins 2 flacons pour l’essai de stérilité
BD Luer Lok SeringueBD Plastipack, États-Unis300865Au moins 4 seringues stériles (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1 BioRadLaboratories, États-Unis171AC500MPanel standard pour l’évaluation des
isoformes PDGFBio-Plex Human Cancer Panel 2BioRad Laboratories, USA171AC600MPanel standard pour l’évaluation EGF
Bio-Plex MAGPIX Multiplex ReaderBioRad Laboratories, USAMagpixCet instrument permet plusieurs immunoessais à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées.
Bio-Plex Pro TGF-bAssay BioRad Laboratories, USA10024984Ensemble et normes pour l’évaluation des isoformes du TGFb
BioRetARIES s.r.l., ItalieA2DH0020Au moins 4 pointes de perçage pour poches de sang
Tube de prélèvement sanguinBD Vacutainer, États-Unis3678351 tube, nécessaire pour effectuer la numération
plaquettaireKit de gouttes ophtalmiques. COL Medical Device pour l’application et la conservation de gouttes ophtalmiques à partir d’hémocomposantsBiomed Device s.r.l., ItalieCOLC50Kit de gouttes ophtalmiques. Au moins 2 kits pour chaque unité PRP collectée
Cancer humain PDGF-AB/BB Set 1x96wellBioRad Laboratories, USA171BC511Set pour l’évaluation des isoformes PDGF
Cancer humain2 EGF Set 1x96wellBioRad Laboratories, USA171BC603MSet pour l’évaluation EGF
NaCl 0,9 % solution stérileBaxter S.p.A., ItalyB05BB011000 ml
Questionnaire OSDIAllergan Inc., USAOSDIQuestionnaire sur l’indice des maladies de la surface oculaire
Pointe de piercingBioRet ARIES s.r.l., ItalieBS051004Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+TERUMO BCT Inc., Italie40842solution de conservation pour concentrés de plaquettes (1000 ml)
Logiciel ExcelMicrosoft, USAExcel Logiciel d’analysede données
Teruflex Sac de transfert 1000 mlTERUMO BCT Inc., ItalieBB*T100BM1 pour dilution PRP
Teruflex Sac de transfert 300 mlTERUMO BCT Inc., ItalieBB*030CMAu moins 6 pour chaque unité PRP prélevée

Références

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