Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse porcine et de leurs vésicules extracellulaires dérivées

Résumé

Cet article élabore une méthode pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse porcine (pBM-MSCs) et les vésicules extracellulaires (VE) dérivées de celles-ci, fournissant une base méthodologique pour l’évaluation préclinique de l’efficacité de la transplantation de BM-MSCs et de leurs VE dérivées.

Résumé

Avec le développement de la thérapie par cellules souches dans la recherche translationnelle et la médecine régénérative, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BM-MSC), en tant que sorte de cellules souches pluripotentes, sont favorisées pour leur disponibilité instantanée et leur innocuité prouvée. Il a été rapporté que la transplantation de BM-MSCs est d’un grand avantage pour la réparation des tissus blessés dans diverses maladies, qui pourraient être liées à la modulation des réponses immunitaires et inflammatoires via des mécanismes paracrines. Les vésicules extracellulaires (VE), dotées d’une structure membranaire lipidique à double couche, sont considérées comme les principaux médiateurs des effets paracrines des cellules souches. Reconnues pour leur rôle crucial dans la communication cellulaire et la régulation épigénétique, les VE ont déjà été appliquées in vivo pour l’immunothérapie. Cependant, à l’instar de ses cellules maternelles, la plupart des études sur l’efficacité de la transplantation de VE restent encore au niveau des petits animaux, ce qui n’est pas suffisant pour fournir des preuves essentielles pour l’application clinique. Ici, nous utilisons la centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules de moelle osseuse (BMC) de la moelle osseuse porcine dans un premier temps, et obtenons des BM-MSCs porcines (pBM-MSCs) par culture cellulaire par la suite, identifiées par les résultats de l’observation au microscope, du test de différenciation induite et de la cytométrie en flux. De plus, nous isolons avec succès les VE dérivées des pBM-MSCs dans le surnageant cellulaire par ultracentrifugation, prouvée par les techniques de microscopie électronique à transmission (MET), d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et de western blot. Dans l’ensemble, les pBM-MSC et leurs VE dérivées peuvent être isolées et identifiées efficacement par les protocoles suivants, qui pourraient être largement utilisés dans les études précliniques sur l’efficacité de la transplantation des BM-MSC et de leurs VE dérivées.

Introduction

Au cours des 10 dernières années, la thérapie par cellules souches a promis de grands avantages pour les patients souffrant de diverses maladies et blessures, telles que les traumatismes, les maladies respiratoires et cardiovasculaires. Avec les progrès dans le domaine, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BM-MSC) sont progressivement privilégiées par les gens pour leur accessibilité et peu de disputes éthiques¹, qui ont été considérées comme l’étalon-or de la recherche clinique malgré d’autres types de cellules². Les thérapies basées sur les BM-MSC sont également attrayantes pour de plus en plus de chercheurs en raison de leur capacité unique à moduler les réponses immunitaires et inflammatoires et à réparer les tissus lésés via des mécanismes de différenciation ou paracrines³.

Les vésicules extracellulaires (VE), comme l’approuve la Société internationale des vésicules^{extracellulaires (}ISEV) 4, font référence à l’ensemble des particules avec une structure bicouche lipidique qui sont naturellement libérées des cellules. Avec les découvertes récentes de divers contenus tels que les protéines, les lipides et le matériel génétique (par exemple, les miARN, les ARNm, les molécules d’ADN, ainsi que les longs ARN non codants) dans les VE de différents types cellulaires⁵, leurs rôles cruciaux dans la communication cellulaire et la régulation épigénétique ont été reconnus⁶. En tant que nouveau substitut des cellules maternelles, les VE ont été appliqués en immunothérapie et en médecine régénérative avec des études in vivo, qui servent de base à la recherche préclinique en cours et aux essais cliniques de suivi⁷.

Cependant, à l’heure actuelle, la plupart des études sur l’efficacité de la transplantation de BM-MSC et de leurs VE dérivées restent encore au niveau des petits animaux, ce qui ne suffit pas à fournir les preuves nécessaires à l’application clinique. Par conséquent, il est extrêmement urgent de mener des recherches précliniques sur la transplantation de BM-MSCs et de leurs VE dérivées au niveau des grands animaux tels que les porcs.

Il a été rapporté que les CSM sont présentes en nombre extrêmement faible dans la moelle osseuse, ne représentant que 0,01 % à 0,001 % du total des cellules⁸. Cependant, l’administration préclinique de BM-MSC nécessite un grand nombre de cellules (≥10⁷ par animal)⁹ ; la quantité de VE nécessaire est encore plus importante, dont la dose médiane est de 0,25 mg de protéines par kilogramme de poids corporel chez le porc¹⁰. Pour atteindre ces grands nombres, il est urgent de disposer d’une méthode sûre et efficace pour isoler et cultiver les CSM à partir de moelle osseuse porcine afin de réaliser leur expansion massive in vitro et d’acquérir leurs VE à forte concentration en protéines par la suite.

Jusqu’à présent, il existe différentes méthodes pour isoler les BM-MSC et leurs VE dérivés. Les méthodes actuelles d’isolement des BM-MSCs comprennent la plantation directe de cellules de moelle osseuse (BMC)¹¹, la centrifugation par gradient de densité, le tri moléculaire des marqueurs moléculaires à la surface cellulaire et le dépistage par cytométrie en flux. Il a été rapporté que le tri des marqueurs moléculaires à la surface cellulaire et le dépistage par cytométrie en flux entraînent une diminution du taux d’adhésion cellulaire, une augmentation de la mortalité sur 24 heures et une inhibition de la prolifération¹², tandis que la culture directe de BMC peut entraîner un nombre élevé de cellules hématopoïétiques mixtes. Par conséquent, la centrifugation à gradient de densité est maintenant couramment utilisée pour obtenir des BM-MSCs. Les méthodes actuelles pour isoler les VE des surnageants cellulaires comprennent l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration, la précipitation des polymères et l’exclusion stérique¹³. Par rapport à d’autres méthodes, l’ultracentrifugation présente l’avantage d’être peu coûteuse, facile d’utilisation et compatible avec une préparation de grand volume sans prétraitement compliqué, qui a été la « référence » pour la séparation EV¹⁴. Cependant, il existe une grande hétérogénéité dans les réactifs et les techniques entre les différents laboratoires au cours du processus ^3,15, ce qui peut induire les lecteurs en erreur. Cet article explique en détail une série d’étapes séquentielles permettant d’isoler en détail les pBM-MSCs et les VE qui en sont dérivées, et les résultats d’identification ultérieurs prouvent que la méthode est réalisable pour obtenir des pBM-MSCs et leurs VE pour une analyse plus approfondie dans la recherche préclinique. Nous espérons que ce travail systématique pourra fournir une base méthodologique aux chercheurs engagés dans l’évaluation préclinique de la transplantation de pBM-MSC et de leurs VE dérivées, afin que des essais cliniques puissent être réalisés le plus tôt possible.

Protocole

Selon le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis, toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital Fuwai de l’Académie chinoise des sciences médicales.

1. Préparation préopératoire pour les animaux

1. Procurez-vous des miniporcs chinois mâles adultes (30 ± 5 kg) à l’âge d’environ 12 mois de l’Institut de zoologie de l’Académie chinoise des sciences et hébergez-les dans les installations du Centre d’expérimentation animale de l’hôpital Fuwai, au moins 2 semaines à l’avance. Effectuer des inspections préopératoires telles que des analyses sanguines de routine pour s’assurer que les animaux sont en bonne santé.
2. Nettoyez et rasez la peau de la cuisse du minipig la veille de l’opération. Pour éviter l’aspiration, faites jeûner le minipig pendant 12 h avant l’extraction de la moelle osseuse.

2. Préparation à l’isolement et à la culture des cellules

1. Utilisez Percoll (1,130 g/mL) pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Mélangez la solution mère avec 10 fois de PBS concentré dans un rapport de 9:1 pour obtenir un milieu isotonique. Mélangez ensuite le milieu isotonique avec du PBS dans un rapport de 3:2 pour obtenir une solution Percoll à 60 % (1,077 g/mL), qui peut être utilisée comme solution de séparation finale pour isoler les pBM-MSC.
2. Préparez le milieu modifié de Dulbecco (IMDM) d’Iscove avec 10 % de sérum fœtal bovin et 1,0 % de pénicilline-streptomycine pour obtenir un milieu complet. Préchauffez le milieu complet et le PBS dans un bain-marie à 37 °C pour la culture cellulaire ultérieure.

3. Anesthésie des animaux

1. Administrer une anesthésie générale avec de la kétamine (10 mg/kg) et de la xylazine (2 mg/kg) par voie intramusculaire. Effectuez rapidement l’intubation endotrachéale lorsque le mini-porc a une respiration lente et moins d’activité des membres, et préservez la respiration spontanée pour éviter l’échec de l’intubation.
2. Effectuer le maintien de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane à 2 %, avec de l’oxygène (1,5 L/min) comme gaz vecteur. Pendant l’anesthésie, surveillez la fréquence cardiaque, la respiration et la saturation en oxygène du minipig en temps réel.

4. Extraction de la moelle osseuse du mini-porc

1. Placez le minipig en position latérale. Pour assurer une quantité suffisante de moelle osseuse pour la culture cellulaire ultérieure, localisez le point de ponction de la moelle osseuse au niveau du fémur proximal du miniporc (figure 1). Désinfectez et drapez la peau de la zone de ponction avant l’application de l’opération.
2. Serrez la peau autour du point de ponction avec la main non dominante et percez l’aiguille de biopsie de la moelle osseuse verticalement au point avec la main dominante. Lorsque vous sentez l’aiguille en contact avec l’os cortical, tournez doucement la poignée vers la gauche et la droite pour percer l’aiguille. Lorsque l’aiguille pénètre dans la cavité de la moelle osseuse, il y a souvent une sensation de perte de résistance.
3. Une fois la ponction en place, retirez l’aiguille centrale. Fixez ensuite une seringue stérile jetable de 50 ml à l’extrémité de l’aiguille extérieure et rincez à l’avance la paroi intérieure de la seringue avec de l’héparine.
4. Extrayez lentement 20 ml de moelle osseuse et transférez-les soigneusement dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.
5. Une fois la procédure terminée, retirez l’aiguille et retirez le drapé. Désinfectez le site de ponction et appuyez dessus pendant 20 min pour l’hémostase.
6. Extubez le mini-porc après avoir rétabli la respiration spontanée. Lorsqu’il est complètement éveillé avec un mouvement libre des membres, remettez le mini-cochon dans la cage pour continuer à se nourrir.

5. Isoler les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse

1. Ajoutez un volume égal de PBS préchauffé à la moelle osseuse et mélangez-les soigneusement. Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile, transférez soigneusement 20 ml de moelle osseuse diluée au-dessus du niveau de solution à gradient de densité de 60 % à un rapport de volume de 1:1 dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.
2. Centrifuger le tube à 600 x g (accélération (ACC) = 5, décélération (DEC) = 5) pendant 20 min à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Quatre phases se forment dans le tube après la centrifugation, y compris la phase sérum, la phase de cellule mononucléaire, la phase moyenne à gradient de densité et la phase de précipitation de haut en bas. La phase cellulaire mononucléée est une fine couche floculante entre le sérum et le milieu à gradient de densité. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse sont localisées dans cette phase.
3. Aspirer la phase de cellule mononucléaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL et laver deux fois avec du PBS à 800 x g pendant 5 min.
4. Remettre en suspension les cellules lavées dans 2 mL de milieu complet et planter les cellules remises en suspension dans une fiole de^{culture de 2} cellules de 175 cm à une densité de 3-5 x 10⁵/mL.
   REMARQUE : Toutes les procédures ci-dessus pour isoler les cellules souches mésenchymateuses sont illustrées à la figure 2.

6. Cultiver des cellules souches mésenchymateuses in vitro

1. Incuber le ballon de culture à 37 °C dans une atmosphère saturée et humidifiée à 5 % de CO₂. Agitez doucement le ballon de culture toutes les 24 h pour empêcher la croissance adhérente des cellules souches hématopoïétiques précipitées, et observez la croissance, la morphologie et la contamination cellulaires au microscope.
2. Remplacez le milieu de culture pour la première fois après 3 jours, puis changez le milieu tous les 2-3 jours. Lorsque les colonies cellulaires atteignent une confluence de 80 à 90 %, sous-cultivez les cellules dans un rapport de 1:2.

7. Différenciation adipogénique, ostéogénique et chondrogénique des pBM-MSC

1. Essai de différenciation adipogénique
   1. Préparez les milieux de différenciation adipogénique A (milieu A) et B (milieu B) pour les BM-MSC selon les instructions du kit. Des informations spécifiques sur le kit se trouvent dans la table des matériaux.
   2. Ajouter 1 mL de gélatine à 0,1 % dans la plaque à six puits et agiter doucement pour couvrir uniformément le fond de chaque puits. Placez ensuite la plaque à six puits dans un banc propre ou un incubateur de CO₂ pendant au moins 30 min.
   3. Après 30 min, aspirez la gélatine et ajoutez 2 mL de milieu complet général dans chaque puits. Plantez ensuite les pBM-MSC dans la plaque à six puits à une densité cellulaire de 2 x 10⁴ cellules/cm². Après cela, incubez la plaque à 37 °C dans une humidité saturée de 5 % CO₂.
   4. Lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence, retirez soigneusement le milieu complet et ajoutez 2 mL de milieu A dans chaque puits de la plaque. Après 3 jours, retirer le milieu A de la plaque et ajouter 2 ml de milieu B dans chaque puits.
   5. Après avoir maintenu pendant 1 jour, retirez le milieu B et remplacez-le par le milieu A pour l’induction. Selon la méthode « Medium A pendant 3 jours, Medium B pendant 1 jour », utilisez Medium A et B séquentiellement pour l’induction.
   6. Observez l’état cellulaire tous les jours pendant les règles. Si les cellules rétrécissent ou meurent pendant le processus d’induction du milieu A, remplacez-le par le milieu B à temps jusqu’à ce que l’état de la cellule se rétablisse.
   7. Répétez le processus d’induction et d’entretien, et préparez-vous à la coloration lorsque suffisamment de gouttelettes de lipides de taille appropriée sont observées au microscope.
   8. Retirez le milieu de différenciation adipogénique dans la plaque à six puits et lavez doucement avec 1x PBS. Ajouter 2 ml de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et fixer pendant 30 min à RT.
   9. Retirez le fixateur de paraformaldéhyde et lavez-le avec 1x PBS deux ou trois fois pour vous assurer que le fixateur est bien éliminé. Ajouter 2 ml de colorant Oil Red O dans chaque puits et teindre pendant 30 min à RT.
   10. Retirez le colorant Oil Red O et lavez-le avec 1x PBS deux ou trois fois. Ajouter 2 mL de 1x PBS dans chaque puits, puis observer l’effet de la différenciation adipogénique au microscope.
2. Essai de différenciation ostéogénique
   1. Préparez le milieu complet pour la différenciation ostéogénique selon les instructions du kit.
   2. Suivez les étapes 7.1.2-7.1.3 pour planter et cultiver des pBM-MSC.
   3. Lorsque les cellules atteignent 70 % de confluence, retirer soigneusement le milieu complet général et ajouter 2 ml de milieu pour la différenciation ostéogénique à chaque puits de la plaque.
   4. Passer à un milieu de différenciation ostéogénique frais tous les 3 jours. Poursuivez l’induction pendant 2 à 4 semaines et préparez-vous à colorer avec le colorant rouge d’alizarine lorsque des nodules calciques évidents apparaissent pendant l’ostéogenèse.
   5. Retirez le milieu de différenciation ostéogénique dans la plaque à six puits et lavez doucement avec 1x PBS. Ajouter 2 ml de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et fixer pendant 30 min à RT.
   6. Retirez le fixateur de paraformaldéhyde et lavez-le avec 1x PBS deux ou trois fois pour vous assurer que le fixateur est bien nettoyé. Ajouter 2 mL de colorant rouge d’alizarine dans chaque puits et colorer pendant 10 minutes à RT.
   7. Retirez le colorant rouge d’alizarine et lavez avec 1x PBS deux ou trois fois. Ajoutez 2 ml de 1x PBS dans chaque puits, puis observez l’effet de la différenciation ostéogénique au microscope.
3. Essai de différenciation chondrogénique
   1. Préparez le prémélange pour la différenciation chondrogénique selon les instructions du kit.
   2. Transvaser 3-4 x 10⁵ pBM-MSC dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Centrifugeuse à 250 x g pendant 4 min à 20 °C.
   3. Retirer le surnageant et ajouter 0,5 mL de prémélange pour remettre en suspension la pastille obtenue par centrifugation à l’étape précédente, puis centrifuger à 150 x g pendant 5 min à 20 °C. Répétez cette étape pour laver à nouveau les cellules.
   4. Préparez le milieu complet pour la différenciation chondrogénique.
   5. Remettre en suspension la cellule obtenue à l’étape précédente avec 0,5 mL de milieu complet et centrifuger à 150 x g pendant 5 min à 20 °C.
   6. Dévissez le capuchon du tube de centrifugation pour faciliter l’échange gazeux. Placez-le debout dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ et une humidité saturée.
   7. Lorsque les cellules semblent s’agréger (généralement après 24 à 48 heures, selon la situation réelle), effleurez le bas du tube de centrifugation pour que les boules de cartilage se détachent du fond et restent en suspension dans le milieu.
   8. Passer à un milieu complet frais pour la différenciation chondrogénique tous les 2-3 jours. Continuez l’induction jusqu’à ce que des boules de cartilage d’un diamètre de 1,5 à 2 mm se forment dans le tube, puis préparez des sections pour la coloration.
   9. Préparez des coupes de paraffine de boules de cartilage selon les étapes de routine des expériences pathologiques. Ajoutez le colorant bleu Alicia sur les sections déparaffinés et faites teindre à 37 °C pendant 1 h.
   10. Rincez la lame à l’eau courante pendant 5 min, puis observez l’effet de coloration du bleu Alicia au microscope après séchage.

8. Identification du phénotype cellulaire par cytométrie en flux

1. Lorsque les colonies cellulaires atteignent une confluence de 80 à 90 % aux passages 3 à 5, retirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec du PBS préchauffé. Ensuite, digérez les cellules avec 3 à 4 ml de trypsine à 0,25 %/EDTA et incuberez-les à 37 °C dans une atmosphère saturée et humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 2 à 3 minutes jusqu’à ce qu’elles soient détachées du fond du ballon au microscope.
2. Récoltez les cellules avec un milieu complet de 10 ml et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et laver les cellules avec du PBS à 4 °C.
3. Remettre les cellules en suspension à 10 mL avec du PBS à 4 °C. La suspension cellulaire est divisée en neuf groupes d’un volume de 1 mL dans chaque microtube de 1,5 mL, appelés respectivement groupe de contrôle négatif, contrôle d’isotype FITC, contrôle d’isotype PE, contrôle d’isotype APC, groupe CD105, CD29, CD90, CD14 et CD45. Assurez-vous que le nombre de cellules dans chaque microtube est compris entre 1 x 10⁵ et 1 x 10⁶.
4. Centrifuger la suspension à 800 x g pendant 5 min à 4 °C, et remettre les cellules en suspension dans chaque microtube avec 100 μL de PBS à 4 °C à nouveau. À l’exception du groupe témoin négatif, ajouter 5 μL du contrôle isotypique correspondant (contrôle de l’isotype FITC, PE et APC IgG1 kappa de souris) et des anticorps (anticorps monoclonaux CD105, CD29, CD90, CD14 et CD45) pour la cytométrie en flux dans chaque microtube selon l’ordre de l’étape 8.3. Mélanger doucement et incuber pendant 1,5 h à 4 °C dans l’obscurité.
5. Ajouter 1 mL de PBS à 4 °C dans chaque microtube et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et ajouter 200 μL de PBS à 4 °C pour remettre les cellules en suspension.
6. Testez au moins 10 000 cellules sur la cytométrie en flux après avoir filtré la suspension cellulaire¹⁶ et analysez les données à l’aide du logiciel de cytométrie en flux.

9. Isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse porcine

1. Lorsque la confluence pBM-MSCs atteint 80 % à 90 %, jetez le surnageant et lavez les cellules avec du PBS 2x. Ajouter ensuite 25 mL d’IMDM sans sérum dans chaque flacon de culture et poursuivre l’incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 48 h.
2. Recueillir le surnageant cellulaire (milieu conditionné, CM) dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
3. Prélever à nouveau le surnageant dans un autre tube à centrifuger de 50 ml. Effectuez l’isolement des VE dès que possible après avoir collecté le surnageant. Pour un stockage à long terme, conservez le surnageant au réfrigérateur à -80 °C pour éviter la perte de VE.
4. Centrifuger le surnageant à l’étape 9.3 à 2 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
5. Transférez le surnageant dans un tube stérile utilisé pour la centrifugeuse à grande vitesse et la centrifugeuse à 16 500 x g pendant 30 min à 4 °C.
6. Transférez à nouveau le surnageant dans un tube d’ultracentrifugation et centrifugez-le à 120 000 x g pendant au moins 70 min à 4 °C, avec un rotor à angle fixe.
7. Jetez complètement le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS à 4 °C dans chaque tube d’ultracentrifugeuse et remettre la précipitation en suspension à l’aide d’une micropipette. Mélangez la solution du même groupe dans un tube d’ultracentrifugation, puis ajoutez 4 °C PBS pour porter le volume supérieur aux 3/4 du tube.
8. Centrifuger à 120 000 x g pendant 60 min à 4 °C et éliminer le surnageant autant que possible.
9. Remettez le précipitant en suspension avec du PBS stérile et conservez les VE dans un réfrigérateur à -80 °C.
   REMARQUE : La quantité de PBS pour la remise en suspension peut être déterminée à 100 μL pour les précipitations à partir de deux flacons de culture de^{175 cm 2} . Toutes les étapes ci-dessus pour isoler les VE sont systématiquement illustrées à la figure 3 .

10. Identification des VE par microscopie électronique à transmission (MET), analyse du suivi des nanoparticules (NTA) et transfert Western

1. Placez l’échantillon de VE sur de la glace après l’avoir décongelé dans un bain d’eau à 25 °C, puis diluez-le à la moitié de la concentration précédente avec du PBS pour la détection NTA¹⁷.
2. Pipetez 10 μL de l’échantillon sur le treillis de cuivre, laissez-le reposer pendant 1 min et absorbez le liquide flottant avec du papier filtre. Ensuite, ajoutez 10 μL d’acide phosphotungstique au treillis de cuivre, laissez-le reposer pendant 1 minute et absorbez l’excès de liquide.
3. Après séchage pendant quelques minutes à RT, effectuer une imagerie par microscopie électronique dans des conditions de tension d’accélération de 100 KV¹⁸.
4. Remettre en suspension l’échantillon EVs de l’étape 9.9 dans le tampon de lyse RIPA (25 mM Tris· HCl (pH 7,6), chlorure de sodium [NaCl] 150 mM, phénoxypolyéthoxyléthanol 1 % de nonyle (NP-40), désoxycholate de sodium à 1 %, dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 %, fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), inhibiteur de protéase 1x), et détectent l’expression de marqueurs spécifiques des VE tels que Alix, TSG101, CD81 et CD63 par western blot¹⁹.

Résultats

Mise en place de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse porcine
Des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse porcine ont été isolées et cultivées in vitro, et la morphologie des CSM-pBM à différents jours peut être observée sur la figure 4. Dans la culture primaire de pBM-MSC, l’observation microscopique a montré que l’adhérence cellulaire se produisait un jour après la plantation et que les cellules adhérentes étaient généralement de forme ronde. Les pBM-MSC primaires sont généralement restées en phase de repos pendant 3 jours après la plantation, et la prolifération cellulaire a commencé le 4^ème jour. La morphologie cellulaire est passée de ronde à fusiforme, multilatérale ou en étoile après la prolifération, et les noyaux sont centraux, avec des nucléoles doubles dans certaines cellules. Les colonies cellulaires se sont formées 7 à 9 jours après le début de la prolifération cellulaire, et 80 à 90 % de la confluence cellulaire a pu être obtenue à 12 à 14 jours. L’observation microscopique a montré que les cellules adhérentes se développaient en colonies dispersées et étaient disposées selon un motif tourbillonnant.

La prolifération cellulaire a été considérablement accélérée après le passage, et une confluence de 80 à 90 % a pu être atteinte en une semaine. La morphologie cellulaire était homogène, en forme de fuseau à partir du deuxième passage, ressemblant à des fibroblastes, avec un rapport longueur/largeur d’environ 2-3:1. Si les cellules étaient différenciées, elles pouvaient apparaître polygonales ou en forme d’étoile. Après le passage, les cellules ne se sont plus développées en colonies dispersées, mais uniformément et radialement dans un arrangement parallèle.

Identification du potentiel de différenciation cellulaire par coloration
Dans l’essai de différenciation adipogénique, la coloration au rouge d’huile O a montré que des gouttelettes lipidiques rondes rouge-orange de différentes tailles apparaissaient autour du noyau (Figure 5A) ; Dans l’essai de différenciation ostéogénique, la coloration au rouge d’alizarine a montré des nodules rouges à la surface de la cellule (Figure 5B), qui ont été causées par la réaction de couleur avec les sels de calcium déposés par les ostéoblastes différenciés des pBM-MSC. Dans l’essai de différenciation chondrogénique, la coloration au bleu d’Alicia a montré que toute la section du tissu était bleue (Figure 5C), ce qui était causé par la coloration du mucopolysaccharide endo-acide dans les boules de cartilage.

Identification du phénotype cellulaire par cytométrie en flux
Des tests des marqueurs de surface cellulaire ont été effectués pour créer un phénotype des pBM-MSC. D’après les résultats de la cytométrie en flux (figure 6), trois marqueurs positifs tels que CD105, CD29 et CD90 ont été exprimés de manière significative à la surface des pBM-MSC, représentant respectivement 96,5 %, 99,8 % et 92 % (figure 6A-C). Cependant, l’expression de CD14 et CD45 était négative (Figure 6D,E). Pendant ce temps, les résultats des contrôles d’isotypes correspondants étaient tous négatifs, ce qui a déjà été superposé dans la figure, excluant la possibilité d’une liaison non spécifique des anticorps.

Identification des VE dérivées des pBM-MSC par NTA, TEM et western blot
Le résultat de la NTA a montré que la taille médiane des particules était de 126,9 nm, ce qui se situait dans la plage des VE. en outre, la concentration initiale de l’échantillon d’EV était de 1,5 x^{10 10} particules/mL, et la valeur précise attribuée à la taille se trouve dans la figure 7A. Le diagramme de trajectoire des particules est illustré à la figure 7B, illustrant que les particules étaient en mouvement brownien irrégulier. De plus, la vésicule discoïde, en tant que structure classique des VE, pouvait être clairement vue au microscope électronique à des grossissements de 50 000x (Figure 7C). De plus, l’expression de marqueurs spécifiques pour les EV tels que Alix, TSG101, CD81 et CD63 a été détectée dans l’échantillon par western blot (Figure 7D).

Figure 1 : Point de ponction de la moelle osseuse du mini-porc. La zone rouge montre le point de ponction de l’extraction de la moelle osseuse, situé au niveau du fémur proximal du miniporc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Isolement de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse porcine. Le processus d’isolement des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse porcine est illustré dans l’organigramme, et quatre phases liquides sont clairement illustrées après centrifugation par gradient de densité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Isolement des VE dérivés des pBM-MSC. Le schéma montre des étapes spécifiques pour isoler les VE du milieu conditionné par ultracentrifugation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Caractéristiques morphologiques des pBM-MSC à différents jours. Des caractéristiques morphologiques similaires des pBM-MSC peuvent être observées le 3e^{, 5e, 7e} et 9e^{jour après} la plantation sous le champ microscopique 100x, et des colonies cellulaires se sont formées le 9e^jour. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 5. Identification du potentiel de différenciation des pBM-MSCs par coloration. (A) Essai de différenciation adipogénique, (B) ostéogène et (C) chondrogénique des CSM-pBM, respectivement. Le potentiel de différenciation des pBM-MSC peut être identifié par ces résultats de coloration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Résultats d’identification des pBM-MSC par cytométrie en flux. CD105, CD29 et CD90 sont exprimés de manière significative à la surface des pBM-MSC, représentant respectivement 96,5 %, 99,8 % et 92,0 %, tandis que l’expression de CD14 et CD45 est négative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Résultats d’identification des VE dérivées des pBM-MSCs par morphologie et biologie moléculaire. (A) résultat NTA des VE dérivées des pBM-MSC, avec graphique de distribution granulométrique et (B) diagramme de trajectoire des particules, respectivement ; (C) Image TEM prise à des grossissements de 50 000x, et la flèche blanche montre la structure classique des vésicules discoïdes. (D) Expression de marqueurs spécifiques des VE par western blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le point de ponction traditionnel de la moelle osseuse des miniporcs était positionné à la crête iliaque²⁰. Bien qu’il soit facile à localiser, la quantité d’extraction de moelle osseuse est limitée ಹ (seulement environ 5 mL en général), il est donc difficile de répondre à l’exigence d’un grand nombre d’expansions in vitro pour la transplantation in vivo. Dans cette méthode, nous avons repositionné le point de ponction de la moelle osseuse sur le fémur proximal, et au moins 20 ml de moelle osseuse peuvent être extraits de ce site, garantissant une quantité suffisante de pBM-MSCs pour la culture cellulaire ultérieure.

Les deux principales solutions de séparation utilisées pour isoler les BM-MSC par centrifugation à gradient de densité sont Percoll et Ficoll. Percoll est composé de polyvinylpyrrolidone (PVP) siliconé, qui est un nouvel agent centrifuge à gradient de densité non toxique et non irritant. La faible constante de diffusion de Percoll se traduit par un gradient de densité relativement stable ; Par conséquent, une séparation cellulaire satisfaisante peut généralement être obtenue en quelques dizaines de minutes avec de faibles forces centrifuges (200-1000 x g). La méthode d’isolement des CSM-pBM à l’aide de Ficoll a déjà été signalée²¹. Par rapport au Ficoll, Percoll a été progressivement utilisé en raison de ses avantages d’isoperméabilité facile, de faible viscosité, de non-toxicité et de ne pas provoquer d’agrégation cellulaire, ce qui peut compléter les méthodes existantes d’isolement des pBM-MSC.

Lors de l’isolement et de la culture des pBM-MSC, certaines étapes critiques ne peuvent être ignorées. Tout d’abord, la stratification réussie des différentes phases liquides après centrifugation à gradient de densité est la clé de l’isolement des pBM-MSC purifiés. Les BM-MSC, en tant que type de cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MNC), ont une densité similaire à celle des lymphocytes et des monocytes, soit environ 1,075 g/mL. La masse volumique d’origine de Percoll est de 1,130 g/mL, et pour obtenir avec succès la couche cellulaire contenant les BM-MSC après centrifugation par gradient de densité, une solution de séparation par gradient de densité isotonique à 60 % (1,077 g/mL) doit être configurée à l’avance selon la relation densité-concentration de Percoll²². De plus, des conditions de centrifugation appropriées contribuent également à une stratification réussie. Compte tenu de la faible constante de diffusion de Percoll, nous avons centrifugé la moelle osseuse extraite à 600 x g pendant 20 min à des niveaux d’accélération/décélération relativement faibles (ACC = 5, DEC = 5), ce qui a permis d’obtenir un bon effet de stratification. Deuxièmement, une densité de plantation appropriée est également essentielle pour la culture cellulaire. Afin d’acquérir un nombre suffisant de CSM (généralement plus de 10⁷ par animal⁹) pour la transplantation ultérieure, nous utilisons des flacons de culture de 175 cm² pour la culture cellulaire. Dans une étude précédente²⁰, les BM-MNCs obtenues étaient généralement plantées dans des flacons de culture pour la culture à une densité de 5 x 10⁵/cm². Il a été rapporté qu’après centrifugation à gradient de densité, on peut obtenir 2-3 x 10⁷ BM-MNCs pour 5 mL de moelle osseuse porcine²³. Ainsi, dans ce protocole, nous recommandons de planter des BM-MNC totales isolées de chaque 20 mL de moelle osseuse porcine dans un ballon de culture de^{175 cm 2} pour une densité appropriée. Troisièmement, les impuretés doivent être évitées lors de l’isolement et de la culture des CSM-pBM. Lors du tirage de la phase de cellule mononucléaire, la pipette ne doit pas être insérée dans la phase Percoll afin de ne pas se mélanger avec le liquide de séparation. De plus, après 24 h de plantation des cellules, le ballon de culture doit être doucement secoué pour réduire l’adhérence des globules rouges.

Au cours du processus d’ultracentrifugation, des niveaux élevés d’agrégats de protéines et de contamination par les lipoprotéines par cette méthode compromettent inévitablement la quantification et l’analyse fonctionnelle des VE¹⁴. Afin de réduire autant que possible la contamination au cours du processus, une profondeur de liquide de 5 mm dans le fond doit être conservée à chaque fois lors du transfert du surnageant avant l’étape d’ultracentrifugation. Pendant ce temps, après la première ultracentrifugation, la remise en suspension de la pastille dans du PBS stérile, puis l’ultracentrifugation à nouveau, peuvent réduire efficacement la contamination par les lipoprotéines.

Bien que la centrifugation à gradient de densité et l’ultracentrifugation aient été largement utilisées pour isoler les BM-MSC et leurs VE dérivées, respectivement, ces deux techniques ont également leurs propres limites. D’une part, la technique Percoll est longue et lourde, et l’obtention d’un échantillon de concentré de BM via un dispositif de concentration de cellules de chevet a été signalée comme une méthode alternative pour isoler les CSM²⁴. D’autre part, la méthode d’ultracentrifugation nécessite non seulement des techniciens hautement qualifiés, mais également un équipement coûteux ; par conséquent, l’application combinée de deux techniques ou plus peut constituer une stratégie raisonnable pour une isolation plus efficace des VE²⁵. En outre, l’identification des pBM-MSC et des VE qui en découlent doit également être améliorée. Par exemple, selon les critères internationaux de définition des CSM²⁶, l’expression de certains marqueurs positifs ou négatifs, tels que CD73, CD34 et HLA-DR, est encore absente des résultats d’identification des phénotypes de CSM BM par cytométrie en flux dans cette étude. De plus, bien que des mesures aient été prises pour éviter la contamination lors du processus d’isolement des VE, en raison des limites de notre laboratoire, nous ne sommes pas en mesure d’évaluer la pureté de l’échantillon de VE afin d’améliorer le travail de suivi.

Cette étude combine des méthodes d’isolement séquentiel des pBM-MSCs et de leurs VE dérivées, prouvées par les résultats d’identification ultérieurs systématiques. En particulier, nous avons mis en évidence les opérations clés de cette série d’étapes, en expliquant certaines conditions expérimentales spécifiques qui peuvent résoudre le problème de l’hétérogénéité existant dans différents laboratoires au cours de ce processus dans une certaine mesure. Ce travail méthodique pourrait être largement utilisé dans les études précliniques sur l’efficacité de la transplantation des BM-MSC et de leurs VE dérivées, ce qui pourrait fournir une base expérimentale d’un niveau suffisant pour la recherche clinique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fiole de culture cellulaire de 175 cm2	Thermo Fisher	159910	utilisée pour la culture cellulaire
0,25 % Trypsine/EDTA	Thermo Fisher	25200056	utilisée pour digérer les cellules
Kit de différenciation adipogénique pour cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse	OriCell	; GUXMX-90031	utilisé pour le test de différenciation adipogénique
Alix Monoclonal Antibody	Thermo Fisher	MA1-83977	utilisé pour identifier les vésicules extracellulaires (Evs) par western blot
APC Souris IgG1 kappa Isotype Control	Thermo Fisher	17-4714-42	utilisé pour éliminer les effets de la coloration non spécifique en cytométrie en flux
CD105 (Endoglin) Anticorps monoclonal	Thermo Fisher	17-1057-42	Utilisé pour identifier les CSM-pBM par cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD14	Thermo Fisher	MA1-82074	Utilisé pour identifier les CSMc pBM par cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD29/IGTB1 Thermo	Fisher	MA1-19458	Utilisé pour identifier les CSMp par cytométrie en flux
CD45 Anticorps monoclonaux Thermo	Fisher	MA5-28383	Utilisé pour identifier les CSMp par cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD63	Thermo Fisher	10628D	utilisé pour identifier les VE par western blot
Anticorps monoclonal CD81 Thermo	Fisher	MA5-13548	utilisé pour identifier les VE par western blot
Anticorps monoclonal CD90	Thermo Fisher	A15794	utilisé pour identifier les pBM-MSC par cytométrie en flux
Kit de différenciation chondrogénique pour cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse	OriCell	GUXMX-90041	utilisé pour l’essai de différenciation chondrogénique Sérum
veau fœtal	Gibco	10099141C	utilisé pour préparer un milieu complet
FITC Souris IgG1 kappa Contrôle de l’isotype	Thermo Fisher	11-4714-42	utilisé pour éliminer les effets de la coloration non spécifique en cytométrie en flux
Cytométrie en flux	BD	Accuri C6	utilisé pour l’identification du phénotype cellulaire
Logiciel FlowJo	BD	V10	utilisé pour analyser les données de la cytométrie en flux
Tube de centrifugation à grande vitesse (50 mL)	Beckman	357003	utilisé pour la centrifugation à grande vitesse
Medium Dulbecco’s Medium d’Iscove	Gibco	C12440500BT	utilisé pour la culture cellulaire
Centrifugeuse au sol à basse température et à grande vitesse	Avanti	J-26XPI	utilisé pour la centrifugation à grande vitesse afin d’obtenir un milieu propre conditionné
Nonyl phénoxypolyéthoxyléthanol (NP-40)	Sigma-Aldrich	NP40S	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
Kit de différenciation ostéogénique pour la moelle osseuse Cellule souche mésenchymateuse	OriCell	GUXMX-90021	utilisé pour le test de différenciation ostéogénique
PE Souris IgG1 kappa Contrôle des isotypes	Thermo Fisher	12-4714-42	utilisé pour éliminer les effets de la coloration non spécifique en cytométrie en flux
Percoll	Cytiva	17089102	utilisé pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse porcine (pBM-MSCs)
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	Thermo Scientific	36978	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
Saline tamponnée au phosphate(10x)	Beyotime	ST476	utilisé pour préparer le Percoll isotonique solution
Phosphate Tamponné Saline(1x)	Cytiva	AF29561133	utilisé pour diluer les cellules Percoll et laver les cellules
Inhibiteur de protéase (1x)	Thermo Scientific	A32955	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D6750	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
Microscopie électronique à transmission	Hitachi	HT7700	utilisé pour l’imagerie par microscopie
électronique Tris· ; HCl	Sigma-Aldrich	93363	utilisé pour la composition du tampon de lyse RIPA
TSG101 Anticorps monoclonal	Thermo Fisher	MA1-23296	utilisé pour identifier les VE par western blot
Ultracentrifugeuse (rotor de type 50.2 Ti)	Beckman	optima L-100XP	utilisé pour l’ultracentrifugation afin d’isoler les exosomes
Tube d’ultracentrifugation (26,3 mL)Beckman		355654	utilisé pour ultracentrifugation
ZetaVIEW	Particle Metrix	S/N 17-310	utilisé pour l’analyse de suivi des nanoparticules