La microscopie à extension de rétention d’étiquettes (LR-ExM) permet l’imagerie à super-résolution et le marquage à haute efficacité

La microscopie à expansion (ExM) est utilisée par les chercheurs depuis qu’elle a été introduite pour la première fois comme une approche pratique pour obtenir une imagerie à super résolution avec des microscopes conventionnels, tels que l’épifluorescence et les microscopes confocaux 1,2,3,4,5,6,7 . En utilisant ExM, il est possible d’atteindre une résolution latérale de ~ 70 nm même avec des microscopes confocaux réguliers. Lorsque l’ExM est combiné à l’imagerie à super-résolution, la résolution est encore améliorée. Par exemple, on peut atteindre une résolution d’environ 30 nm avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et une résolution d’environ 4 nm avec la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)^1,5.

Cependant, la faible efficacité de l’étiquetage est un problème critique avec les méthodes ExM standard. La perte de fluorescence peut varier en fonction du type de groupes fluorescents et du temps de digestion. En moyenne, cependant, il a été rapporté que plus de 50% des fluorophores sont perdus après les étapes de polymérisation et de digestion des protéines de l’ExM, ce qui nuit à la qualité de l’imagerie3,4.

Ainsi, la microscopie à expansion de rétention de marquage (LR-ExM) a été développée, qui peut retenir efficacement les étiquettes et réduire la perte de signal¹. L’innovation clé de LR-ExM est l’utilisation d’un ensemble d’ancrages trifonctionnels au lieu d’utiliser simplement des colorants fluorescents - comme dans la procédure ExM standard - pour colorer les protéines d’intérêt. Ces agents de liaison trifonctionnels se composent de trois parties : (1) le connecteur (p. ex., N-hydroxysuccinimide (NHS)) pour se connecter à l’anticorps, (2) l’ancrage (p. ex. méthacrylamide (MA)) pour ancrer les protéines au polymère, et (3) le rapporteur (p. ex. biotine ou digoxigénine (DIG)) pour se conjuguer à un colorant organique. Les ancrages trifonctionnels survivent aux étapes de polymérisation et de digestion des protéines, et empêchent ainsi la perte de fluorophore.

De plus, cette méthode présente un grand potentiel puisqu’elle est compatible avec les balises enzymatiques auto-étiquetantes telles que SNAP ou CLIP. Les approches de marquage enzymatique présentent certains avantages par rapport à l’approche d’immunomarquage en ce qui concerne la spécificité élevée et l’efficacité du marquage ^8,9,10.

Dans ce manuscrit, une procédure détaillée de LR-ExM est démontrée. LR-ExM est une méthode très efficace et flexible pour atteindre une résolution spatiale élevée avec une efficacité d’étiquetage améliorée.

1. Culture cellulaire

1. Utiliser des cellules U2OS cultivées dans le milieu 5A de McCoy supplémenté avec 10% FBS à 37 °C dans 5% CO₂.
2. Cellules de culture sur un verre chambré de 16 puits amovibles (surface de culture 0,4 cm²) pour faciliter la manipulation.

2. Fixation et perméabilisation

REMARQUE : Les conditions de fixation et de perméabilisation dépendent des protocoles d’immunomarquage optimisés. Ce qui suit est un protocole de fixation et de perméabilisation des microtubules co-immunocolorants et des fosses recouvertes de clathrine (CCP).

1. Une fois que le nombre de cellules atteint ~0,04 x 10 6, fixer les cellules contenant 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 3,2 % dans un tampon PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA et 1 mM MgCl₂, pH^6,9) pendant 10 minutes à température ambiante (tableau 1).
   REMARQUE: La fixation à l’aide de PFA est effectuée dans une hotte de sécurité certifiée.
2. Lavez les cellules trois fois pendant 5 minutes chacune avec 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Perméabiliser les cellules avec le tampon de perméabilisation de 100 μL à température ambiante pendant 15 minutes (tableau 1).
   REMARQUE: Procéder au marquage dès que possible pour éviter la dégradation de la protéine cible, de l’ARN ou de l’ADN, et pour obtenir un résultat optimal. Si nécessaire, cependant, les échantillons fixes peuvent être stockés pendant une période prolongée (jusqu’à un mois) dans un tampon PBS à 4 °C. Remplacez tout PBS évaporé et protégez l’échantillon du photoblanchiment.

3. Blocage endogène de la streptavidine et de la biotine

1. Incuber les cellules avec la solution de streptavidine diluée dans un tampon de blocage cellulaire (100 μL) pendant 15 minutes à température ambiante (tableau 1).
2. Rincer brièvement avec 200 μL de tampon de blocage cellulaire.
3. Incuber les cellules avec 100 μL de solution de biotine diluée dans un tampon de blocage cellulaire pendant 15 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : lorsque vous utilisez une approche d’auto-balisage, telle que l’utilisation de balises SNAP ou CLIP-, ignorez l’étape 4 et passez à l’étape 5.1 : approche d’auto-étiquetage.

4. Coloration primaire des anticorps

1. Incuber des cellules avec un anticorps anti-α-tubuline chez le rat (dilution de 1:500) et un anticorps anti-clathrine à chaîne lourde de lapin (dilution de 1:100) dans 100 μL de tampon de blocage cellulaire pendant 16 h à 4 °C ou 1 h à température ambiante. Doublez le temps d’incubation des échantillons de tissus.
2. Lavez les échantillons quatre fois avec 200 μL de PBS pendant 5 minutes chacun.

5. Coloration des anticorps secondaires spécifiques LR-ExM

1. Conjuguer les anticorps IgG avec les agents de liaison trifonctionnels tels que le N-hydroxysuccinimide (NHS) - méthacrylamide (MA)-biotine ou le NHS-MA-digoxigénine (Dig) (Figure 1B). La synthèse des ancrages trifonctionnels et la conjugaison des anticorps secondaires sont précédemment introduites chez Shi et ^al.1. Approche d’automarquage : conjuguer les anticorps IgG avec les agents de liaison trifonctionnels, tels que MA-benzylguanine (BG)-Biotine ou MA- benzylcytosine (BC)-Dig (Figure 1B). La synthèse d’ancrages trifonctionnels et une conjugaison des anticorps secondaires sont précédemment introduites chez Shi et ^al.1.
2. Incuber des cellules avec les anticorps secondaires anti-lapin-Dig-MA (dilution 1:100) et anti-rat-biotine-MA (dilution 1:100) dans 100 μL de tampon de blocage cellulaire pendant 1 h à température ambiante. Doublez ce temps d’incubation pour les échantillons de tissus.
3. Lavez les échantillons quatre fois dans 200 μL de PBS pendant 5 minutes chacun.

6. Ancrage supplémentaire

1. Incuber des cellules avec 0,25% de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS (100 μL) pendant 15 min à température ambiante afin d’ancrer les protéines sur l’hydrogel. Vous pouvez également utiliser un ester de N-hydroxysuccinimide de 25 mM d’acide méthacrylique (MA-NHS) pour l’ancrage. Une incubation d’une heure à température ambiante est encouragée.
2. Lavez les échantillons trois fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun.

7. Gélification

NOTE: La vitesse d’expansion est déterminée par le temps de diffusion du sel et de l’eau vers ou dans le gel; Ainsi, la coulée de gels minces accélère le temps d’expansion.

1. Retirez la structure supérieure de la plaque de gel à 16 puits. Ajouter 40 μL de solution monomère à chaque puits pour conditionner les cellules sur la glace. Incuber sur la glace pendant 5 min.
   1. Pour préparer une solution de monomère, voir le tableau 2.
2. Préparer la solution de gélification sur glace. Ajouter de l’eau distillée double et un accélérateur de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à 10 % de N, N, N′ (TEMED) (10 % MED : solution de monomère = 1:47); n’ajoutez pas encore l’initiateur (Tableau 3).
3. Pour une chambre de culture cellulaire d’une surface de 0,4 cm², utilisez un volume de solution de gélification d’environ 40 μL. Préparer 45 μL de solution de gélification pour chaque puits.
4. Ajouter 10% de persulfate d’ammonium (APS) à la solution de gélification, incuber sur de la glace et pipeter immédiatement 40 μL de solution de gélification dans chaque joint en silicone bien sur de la glace. Incuber sur la glace pendant 3 min (10 % APS:10 % TEMED:solution monomère = 1:1:47).
5. Protéger l’échantillon de la lumière et déplacer le verre de couverture de la boîte de Petri de 10 cm dans un incubateur à 37 °C pendant 1,5 h pour la gélification. Pour maintenir l’humidité du gel pendant l’incubation à 37 °C, couvrez la boîte de Petri avec le couvercle et mettez quelques gouttes d’eau dans la boîte de Pétri.

8. Digestion

1. Après la gélification, retirez le verre pour séparer le gel et transférez le gel sur une plaque à 6 puits. Digérer les cellules incorporées avec 2 mL de tampon de digestion (tableau 1) pendant une nuit à température ambiante ou 4 h à 37 °C. Utilisez au moins 10 fois l’excès de volume de tampon de digestion.
2. Lavez les gels avec au moins 10 fois plus d’eau que le volume final du gel. Répétez l’étape de lavage quatre fois pendant 20 à 30 minutes à chaque fois. Le gel se dilate d’environ deux fois dans chaque dimension.
   REMARQUE: Les échantillons de gel peuvent être conservés jusqu’à 1 mois dans un tampon PBS à 4 ° C. Remplacez toute eau évaporée pour éviter le dessèchement et protégez l’échantillon de la lumière pendant le stockage. Pour éviter la dégradation des ancrages trifonctionnels, les échantillons doivent être colorés dès que possible après la digestion et le lavage.

9. Coloration par fluorescence post-digestion

1. Incuber des gels dans un volume de 2 mL de tampon de coloration streptavidine (STV)/digoxigénine (DIG) avec un colorant STV de 2 à 5 μM et/ou un colorant anti-DIG pendant 24 h à température ambiante. Conservez les échantillons dans l’obscurité.

10. Expansion

1. Lavez et étendez le gel quatre fois avec de l’eau excessive (2-3 mL) pendant 30 min à 1 h à chaque fois.
2. Pour faciliter la visualisation des cellules sous microscopie fluorescente, colorez les cellules avec DAPI pendant le troisième des cinq lavages. Diluer la concentration du stock de DAPI (5 mg/mL, stocké à 4 °C) dans des dilutions 1:5 000 dans de l’eau de lavage. Incuber le gel avec une solution DAPI-eau (2 mL) pendant 30 min à 1 h.
3. Lavez deux fois de plus avec 3 ml d’eau.
4. Étendre les gels dans n’importe quel plat assez grand pour contenir les échantillons. Les gels expansés qui sont préparés sur un verre de couverture de 0,4 cm² s’adaptent bien dans une plaque de fond de verre à 6 puits.
   REMARQUE: Les échantillons colorés après expansion peuvent être conservés jusqu’à 4 mois dans un tampon PBS à 4 ° C. Ajouter suffisamment d’eau pour éviter le séchage et protéger l’échantillon du photoblanchiment. Répétez l’étape d’expansion et de coloration DAPI avant l’imagerie. Pour éviter tout risque de dégradation fluorophore, les échantillons doivent être imagés dès que possible.

11. Imagerie

1. Enduisez la chambre d’imagerie à fond de verre à 6 puits de poly-L-lysine à 0,01 % (3 mL chacune) pour immobiliser les échantillons de gel.
2. Transférer les échantillons de gel dans la chambre d’imagerie revêtue.
3. Imagez les échantillons avec toutes les portées de fluorescence souhaitées.

Les fosses recouvertes de clathrine (CCP) sont immunocolorées à l’aide d’ancrages trifonctionnels (figure 1B) et le LR-ExM est effectué comme décrit à la figure 1A. LR-ExM (Figure 2C,E) montre une intensité de fluorescence beaucoup plus élevée que la microscopie d’expansion de rétention de protéines (proExM, Figure 2A) ou la biotine-ExM (Figure 2B); le signal pour LR-ExM était environ six fois plus élevé que pour proExM (Figure 2D). LR-ExM peut capturer efficacement de petites structures telles que les CCP, qui sont encore plus petites que la limite de diffraction (Figure 2F,G).

Certains résultats représentatifs du LR-ExM sont présentés en utilisant l’approche d’immunomarquage. Les microtubules et les CCP sont co-immunocolorés à l’aide d’ancrages trifonctionnels, y compris NHS-MA-DIG et NHS-MA-biotine (Figure 3A,B). LR-ExM est disponible pour l’approche enzymatique basée sur les étiquettes. Le résultat est démontré à l’aide des ancrages trifonctionnels BG-MA-biotine (pour SNAP-tag) et BC-MA-DIG (pour CLIP-tag) à la figure 3C-F. De plus, on peut combiner à la fois l’immunomarquage et l’approche protéine-marqueur dans LR-ExM, comme le montre la figure 3G-J. À partir de ces résultats, il est confirmé que LR-ExM est bénéfique pour obtenir des images de haute qualité avec une efficacité et une résolution d’étiquetage améliorées.

LR-ExM montre également d’excellentes performances dans les échantillons de tissus. LR-ExM est réalisé sur le tissu cérébral de la souris en co-immunocolorant le marqueur présynaptique Basson et le marqueur postsynaptique Homer1. Les deux étiquettes sont claires et bien séparées, ce qui permet une haute résolution et une efficacité d’étiquetage (Figure 4A-E).

Figure 1 : Flux de travail de la microscopie à expansion de rétention d’étiquettes (LR-ExM). a) Déroulement du LR-ExM. (B) Schémas des ancrages trifonctionnels. Cette figure a été modifiée à partir de Shi et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification des images confocales de microscopie à expansion de rétention du signal (A-C) (ExM) de fosses recouvertes de clathrine (CCP) dans des cellules U2OS indirectement immunocolorées pour la chaîne lourde de clathrine (POI). (A) Rétention protéique ExM (ProExM) à l’aide d’anticorps secondaires conjugués AF488. (B) ExM avec marquage post-expansion utilisant des anticorps conjugués à la biotine. (C) LR-ExM utilisant des anticorps conjugués avec des ancrages trifonctionnels NHS-MA-biotine. Les échantillons en B et C sont colorés après expansion avec de la streptavidine-AF488. D) Quantification de l’intensité de la climatisation à la climatisation. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. n = 3 pour chaque cas. Les rapports d’expansion de longueur pour les images en A, B, C et E-G sont respectivement de 4,3, 4,5, 4,6 et 4,3. Le taux d’expansion de longueur pour les échantillons utilisés dans la placette D est de 4,5 ± 0,2. Barres d’échelle, 500 nm (A-C et E) et 100 nm (F et G). Toutes les barres d’échelle sont dans des unités de pré-expansion. Arb. u., unités arbitraires; VUT, streptavidine. Toutes les images sont obtenues à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif (Nikon CSU-W1) avec un objectif d’immersion dans l’eau 60x (NA1.27). Cette figure a été modifiée à partir de Shi et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats représentatifs du LR-ExM à l’aide de microscopes confocaux. (A,B) Images confocales LR-ExM de microtubules marqués avec des anticorps secondaires conjugués NHS-MA-biotine (magenta) et des CCP marqués avec des anticorps secondaires conjugués NHS-MA-DIG (vert) dans une cellule U2OS. (B) Vue agrandie. (C-F) Images confocales LR-ExM de CCP et/ou de mitochondries dans des cellules HeLa marquées à l’aide d’une approche de marquage de protéine (C) clathrine marquée par une étiquette SNAP, (D) TOMM20 marquée par une étiquette CLIP et (E) imagerie bicolore. (F) Vue agrandie. (G) Images confocales LR-ExM bicolores utilisant une combinaison d’approche d’immunomarquage (NPC, rouge chaud) et d’approche protéine-étiquette (LAME A/C marquée SNAP (cyan)). (H) Vue agrandie. (I,J) Vues des canaux individuels de H. Notez que le fond cytoplasmique dans G est causé par l’anticorps anti-NUP153. Les rapports d’expansion de longueur pour les images en A-B : 4,7, C-D : 4,4, E-F : 4,5 et G-J sont de 4,5. Barres d’échelle, 1 μm pour A, 200 nm pour B et F, 500 nm pour C-E, 2 μm pour G et 500 nm pour H, I et J. Toutes les barres d’échelle sont dans des unités de pré-expansion. Toutes les images sont obtenues à l’aide d’un microscope confocale à disque rotatif (Nikon CSU-W1) avec un objectif d’immersion dans l’eau 60x (NA1.27). Cette figure a été modifiée à partir de Shi et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs du LR-ExM sur des échantillons de tissus. (A) Image confocale LR-ExM de la tranche de cerveau de souris indirectement immunocolorée pour le marqueur présynaptique Basson (magenta) et le marqueur postsynaptique Homer1 (vert). (B,C) Images agrandies des synapses. (D, E) Profils d’intensité transversale le long des axes longs de la boîte jaune. Basson est marqué avec des anticorps secondaires conjugués NHS-MA-DIG, et Homer1 est marqué avec des anticorps secondaires conjugués NHS-MA-biotine. Tous les échantillons sont colorés après expansion avec de la streptavindine-AF488 et/ou de l’anti-digoxine-AF594. Les rapports d’expansion de longueur pour les images en A-C sont de 4,2. Barres d’échelle, 1 μm (A) et 200 nm (B,C). Toutes les barres d’échelle sont dans des unités de pré-expansion. Toutes les images sont obtenues à l’aide d’un microscope confocale à disque rotatif (Nikon CSU-W1) avec un objectif d’immersion dans l’eau 60x (NA1.27). Cette figure a été modifiée à partir de Shi et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Produits chimiques et tampons Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Solution de monomère Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Solution de gélification Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.