Identifier l’interaction entre les cellules tueuses naturelles et les neurones nocicepteurs

Résumé

Les neurones nocicepteurs et les cellules NK interagissent activement dans un contexte inflammatoire. Une approche de co-culture permet d’étudier cette interaction.

Résumé

Les neurones somatosensoriels ont évolué pour détecter les stimuli nocifs et activer les réflexes défensifs. En partageant des moyens de communication, les neurones nocicepteurs ajustent également les défenses de l’hôte en contrôlant l’activité du système immunitaire. La communication entre ces systèmes est principalement adaptative, aidant à protéger l’homéostasie, elle peut également conduire à, ou favoriser, l’apparition de maladies chroniques. Les deux systèmes ont co-évolué pour permettre une telle interaction locale, comme on le trouve dans les tissus lymphoïdes primaires et secondaires et les muqueuses. Des études récentes ont démontré que les nocicepteurs détectent directement les antigènes étrangers, les cytokines dérivées des cellules immunitaires et les microbes et y répondent.

L’activation des nocicepteurs entraîne non seulement une hypersensibilité à la douleur et des démangeaisons, mais abaisse le seuil de déclenchement des nocicepteurs, conduisant à la libération locale de neuropeptides. Les peptides qui sont produits par, et libérés de, les terminaisons périphériques des nocicepteurs peuvent bloquer la chimiotaxie et la polarisation des lymphocytes, contrôlant la localisation, la durée et le type d’inflammation. Des preuves récentes montrent que les neurones sensoriels interagissent avec les cellules immunitaires innées par contact cellule-cellule, par exemple, engageant les récepteurs du groupe 2D (NKG2D) sur les cellules tueuses naturelles (NK).

Étant donné que les cellules NK expriment les récepteurs apparentés de divers médiateurs produits par les nocicepteurs, il est concevable que les nocicepteurs utilisent des neuropeptides pour contrôler l’activité des cellules NK. Ici, nous concevons une méthode de co-culture pour étudier les interactions neurone-cellule NK dans une boîte. En utilisant cette approche, nous avons constaté que les neurones nocicepteurs lombaires diminuent l’expression des cytokines des cellules NK. Dans l’ensemble, une telle méthode réductionniste pourrait être utile pour étudier comment les neurones innervant les tumeurs contrôlent la fonction anticancéreuse des cellules NK et comment les cellules NK contrôlent l’élimination des neurones lésés.

Introduction

Les corps cellulaires des neurones sensoriels proviennent des ganglions de la racine dorsale (DRG). Les DRG sont situés dans le système nerveux périphérique (SNP), entre la corne dorsale de la moelle épinière et les terminaisons nerveuses périphériques. La nature pseudo-unipolaire des neurones DRG permet le transfert de l’information de la branche périphérique, qui innerve le tissu cible, vers la branche centrale, qui transporte l’information somatosensorielle vers la moelle épinière¹. À l’aide de récepteurs de canaux ioniques spécialisés, les neurones de premier ordre détectent les menaces posées par les agents pathogènes, les allergènes et les polluants², conduisant à l’afflux de cations (Na+, Ca²⁺) et à la génération d’un potentiel d’action 3,4,5.

Ces neurones envoient également un potentiel d’action antidromique vers la périphérie, où la détection initiale du danger s’était produite, ce qui conduit à la libération locale des neuropeptides ^1,4. Par conséquent, les neurones nocicepteurs servent de mécanisme de protection, alertant l’hôte du danger environnemental 4,5,6,7.

Pour communiquer avec les neurones de second ordre, les nocicepteurs libèrent divers neurotransmetteurs (p. ex. glutamate) et neuropeptides (p. ex. peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP), substance P (SP) et peptide intestinal vasoactif (VIP))^6,7. Ces peptides agissent sur les capillaires et favorisent l’extravasation plasmatique, l’œdème, l’afflux local et la modulation des cellules immunitaires ^2,4,7.

Les systèmes somatosensoriel et immunitaire utilisent un système de communication partagé composé de cytokines et de neuropeptides, et de leurs récepteurs apparentés^{respectifs 4}. Bien que cette communication bidirectionnelle aide à protéger du danger et à préserver l’homéostasie, elle peut également contribuer à la physiopathologie de la maladie⁴.

Les cellules NK sont classées comme cellules lymphoïdes innées et sont spécialisées pour éliminer les cellules infectées par le virus. La fonction des cellules NK est régie par un équilibre de récepteurs stimulateurs et inhibiteurs, y compris le récepteur activateur NKG2D⁸. Le ligand endogène de NKG2D, acide rétinoïque inductible précoce1 (RAE1), est exprimé par des cellules subissant des stress tels que tumorigenèse et infection ^8,9.

Des recherches récentes ont montré que les lésions nerveuses périphériques conduisent les neurones sensoriels à exprimer des molécules inadaptées telles que la stathmine 2 (STMN2) et RAE1. Ainsi, par contact cellule-cellule, les cellules NK exprimant NKG2D ont été activées par interaction avec les neurones exprimant RAE1. À leur tour, les cellules NK ont été capables d’éliminer les neurones nocicepteurs blessés et l’hypersensibilité à la douleur contondante normalement associée à une lésion nerveuse¹⁰. En plus de l’axe NKG2D-RAE1, les cellules NK expriment les récepteurs apparentés de divers médiateurs produits par les nocicepteurs. Il est donc possible que ces médiateurs modulent l’activité des cellules NK. Cet article présente une méthode de co-culture pour étudier la biologie de l’interaction neurone-cellule NK nocicepteur. Cette approche aidera à faire progresser la compréhension de la façon dont les neurones nocicepteurs modulent les réponses innées des cellules immunitaires aux blessures, aux infections ou aux tumeurs malignes.

Protocole

Les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Montréal (#22053, #22054) ont approuvé toutes les procédures relatives aux animaux. Voir le tableau 1 pour une liste des solutions et de leur composition et le tableau des matériaux pour une liste des matériaux, de l’équipement et des réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Isolement, culture et stimulation des cellules NK

1. Générer un neurone nocicepteur intact (contrôle des compagnons de portée; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) et des souris ablées (TRPV1 cre::D TA fl/wt) en croisant des souris lox-stop-lox-toxine diphtérique (DTA fl/^fl) avec des souris TRPV1^cre/wt.
2. À l’aide de l’inhalation de CO₂, euthanasier une souris témoin naïve (TRPV1 wt::D TA^fl/wt).
3. Recueillir la rate dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile.
4. Homogénéiser la rate à l’aide d’un pilon.
5. Diluer les cellules avec 1 mL de PBS stérile.
6. Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 50 μm dans un tube conique de 15 mL.
7. Remplissez le volume (10 ml) avec du PBS stérile.
8. Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
9. Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.
10. Resuspendre les cellules à une concentration de 10⁸ cellules/mL dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.
11. Suivez les instructions du fabricant pour purifier magnétiquement les cellules NK de la rate à l’aide d’un kit d’isolation des cellules NK de souris. Confirmer la pureté des cellules NK à l’aide de la cytométrie^{en flux 11}.
12. Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
13. Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.
14. Resuspendre les cellules NK dans le milieu de culture RPMI 1640 supplémenté (contenant IL-2 et IL-15).
15. Culture 2 × 10⁶ cellules NK/ml dans une plaque de fond en U à 96 puits pendant 48 h.

2. Isolement et culture des neurones DRG

1. 24 h avant la fin de la stimulation des cellules NK (étape 1.15), enduire une plaque de 96 puits de 100 μL/puits de laminine (1 ng/mL) et incuber pendant 45 min (37 °C).
2. Après l’incubation, retirez la solution et laissez les puits sécher à l’air libre dans une enceinte de biosécurité.
3. En inhalant du CO₂ , euthanasier le neurone nocicepteur intact (contrôle du compagnon de portée; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) ou ablée (TRPV1^cre::D TA^fl/wt).
   REMARQUE: L’inhalation de CO₂ est préférable à la luxation cervicale car elle évite de perturber les nerfs spinaux connectés au DRG.
4. Fixez la souris sur la planche en position couchée, soulevez la peau et incisez la peau le long de la colonne dorsale. Reportez-vous à Perner et al. pour une vidéo détaillée¹².
5. Coupez l’articulation lombo-sacrée et séparez le sacrum de la colonne lombaire avec des ciseaux.
6. Séparez la colonne vertébrale en coupant les muscles et les côtes des deux côtés de la colonne vertébrale dans le sens crânien jusqu’à ce que la base du crâne soit atteinte.
7. À l’aide de ciseaux, couper la colonne vertébrale au niveau de l’articulation atlanto-occipitale.
8. Retirez les muscles et les tissus adipeux de la colonne vertébrale.
9. Épinglez et ouvrez la colonne vertébrale pour retirer la moelle épinière et accéder au DRG. Recherchez le DRG dans le foramina intervertébral relié à la moelle épinière par la racine dorsale mais séparé des méninges.
10. Récolter les DRG dans un tube conique de 15 mL rempli de 10 mL de DMEM supplémenté en froid glacé.
11. Centrifuger la préparation (200 × g, 5 min, température ambiante) et retirer le surnageant.
12. Ajouter 250 μL de PBS contenant de la collagénase IV (1 mg/mL) et de la dispase II (2,4 U/mL).
13. Incuber le DRG avec la solution de collagénase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, agitation légère). Lors de la mise en commun des ganglions de plusieurs souris, maintenir un rapport de 125 μL de solution C/D par ganglion.
14. Pour inactiver les enzymes, ajoutez 5 mL de milieu DMEM supplémenté.
15. Centrifuger la solution (200 × g, 5 min) et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
16. Pour éviter la perte cellulaire indésirable, laissez ~100 μL du surnageant.
17. Ajouter 1 mL de milieu DMEM supplémenté.
18. À l’aide d’un pistolet à pipette et de trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes, triturer doucement (~10 haut/bas par pipette Pasteur) le DRG en une préparation unicellulaire.
19. Dans une enceinte de biosécurité, diluer l’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 15 %. Conserver 1 mL d’aliquotes à −20 °C.
20. Créer un gradient de BSA dans un tube conique de 15 mL en ajoutant 2 mL de PBS stérile et en distribuant lentement 1 mL de solution de BSA à 15% au fond du tube. Évitez de perturber le gradient en retirant doucement la pipette.
21. À l’aide d’une pipette P200, pipeter lentement la suspension ganglionnaire triturée (qui contient les neurones) sur le côté du tube dans le gradient.
22. Centrifuger le gradient BSA contenant des neurones (200 × g, 12 min, température ambiante). Réglez l’accélération et la décélération de la centrifugeuse à la vitesse minimale.
    REMARQUE: Après centrifugation, les neurones seront au fond du tube tandis que les débris cellulaires seront piégés dans le gradient BSA.
23. Retirer délicatement tout le surnageant à l’aide d’une pipette.
24. Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de Neurobasal.
25. Plaque 10⁴ neurones par puits (200 μL de neurobasal/puits) dans une plaque de 96 puits à fond plat recouverte de laminine.
    REMARQUE: En moyenne, un enquêteur sera en mesure de remplir ~ 8 puits par souris.
26. Culture des neurones (37 °C, pendant la nuit) pour permettre l’attachement.

3. Co-culture et cytométrie en flux

1. Retirez lentement le neurobasal de la culture neuronale.
2. Après 48 h de stimulation avec IL-2 et IL-15 (voir étapes 1.14-1.15), remettre en suspension les cellules NK et ajouter 10⁵ cellules NK / puits à la culture de neurones (plaque inférieure plate à 96 puits).
   REMARQUE: En moyenne, l’enquêteur sera en mesure de remplir ~ 6 puits par souris.
3. Co-culture des cellules en MX neurobasale supplémentée (37 °C, 48 h).
4. Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).
5. Jeter le surnageant et colorer les cellules avec Viability Dye eFlour-780 (1:1 000, 15 min, 4 °C).
6. Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).
7. Bloquer les sites non spécifiques sur les cellules avec CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
8. Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).
9. Coloration (15 min, 4 °C) des cellules avec BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anti-NKp46 (1:100) et phycoérythrine (PE) anti-GM-CSF (1:100).
10. Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).
11. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans le tampon FACS (500 μL) et immunophénotyper les cellules NK par cytométrie^{de flux 11}. Voir la figure 1A pour la stratégie d’établissement de points de contrôle.

Résultats

Les cellules NK ont été purifiées magnétiquement à partir de splénocytes de souris témoins (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) et stimulées (48 h) avec IL-2 et IL-15. Les cellules NK ont ensuite été cultivées seules ou co-cultivées avec des neurones DRG prélevés à partir de neurones nocicepteurs intacts (contrôle des compagnons de portée; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) ou ablated (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). Les cellules ont ensuite été exposées à l’agoniste TRPV1 capsaïcine (1 μM) ou à...

Discussion

Davies et ^al.11 ont constaté que les neurones blessés régulent positivement RAE1. Grâce au contact cellule-cellule, les cellules NK exprimant NKG2D ont ensuite pu identifier et éliminer les neurones RAE1⁺ , ce qui limite la douleur chronique¹¹. Étant donné que les cellules NK expriment également divers récepteurs neuropeptidiques et que ces neuropeptides sont connus pour leurs capacités immunomodulatrices, il semble de plus en plus important d’étudier l’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris CD16/32	Jackson Laboratory	N° de chat : 017769
B-27	Jackson Laboratory	N° de chat : 009669
Albumine sérique bovine (BSA) de qualité de culture	World Precision Instruments	N° de catalogue : 504167
BV421 anti-souris NK-1.1	Fisher Scientific	N° de chat : 12430112
Passoire à cellules (50 &mu ; m)	Fisher Scientific	N° de chat : A3160702
Collagénase IV	Fisher Scientific	N° de chat : 15140148
Toxine diphtériafl/fl	Scientific	N° de chat : SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	N° de chat : 13-678-20B
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat n° : 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no : CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no : C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no : 04942078001
Fetal bovin sérum bovin (FBS)	Sigma	Cat no : 806552
FITC anti-souris NKp46	Sigma	Cat no : L2020
Plaque à fond plat à 96 puits	Sigma	N° de cat : 03690
Pipette Pasteur en verre	Sigma	N° de cat : 470236-274
Facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF)	VWR	N° de cat : 02-0131
Laminin	Cedarlane	N° de cat : 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	N° de cat : A14867-01
Souris IL-15 recombinante	Gibco	N° de cat : 22400-089
Souris recombinante IL-2	Gibco	N° de cat : 21103-049
Facteur de croissance nerveuse (NGF)	Life Technologies	N° de cat : 13257-019
Milieu neurobasal	PeproTech	N° de cat : 450-51-10
PE anti-souris GM-CSF	PeproTech	N° de cat : 212-12
Pénicilline et Streptomycine	PeproTech	N° de cat : 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	N° de cat : 19855
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Biolegend	N° de cat : 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	N° de cat : 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	N° de cat : 505406	Clone MP1-22E9
Pinces à épiler et outils de dissection.	Biolegend	N° de cat : 65-0865-14
Plaque à 96 puits à fond en U	Biolegend	N° de cat : 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson