Évaluation de l’efficacité photosynthétique chez les mutants photorespiratoires par analyse par fluorescence chlorophyllienne

Les conditions de stress abiotiques couramment observées dans les champs des agriculteurs peuvent avoir un impact négatif sur les rendements des cultures en réduisant l’efficacité photosynthétique. Les conditions environnementales néfastes telles que les vagues de chaleur, les changements climatiques, la sécheresse et la salinité du sol peuvent causer des stress abiotiques qui modifient la disponibilité du CO₂ et réduisent la réponse d’une plante à un stress lumineux élevé. Les deux plus grands flux de carbone terrestres sont la photosynthèse et la photorespiration, qui sont essentielles à la croissance des plantes et aux rendements des cultures. Bon nombre des protéines et enzymes importantes impliquées dans ces processus ont été caractérisées dans des conditions de laboratoire et identifiées au niveau génétique¹. Bien que beaucoup de progrès aient été réalisés dans la compréhension de la photosynthèse et de la photorespiration, de nombreuses étapes, y compris le transport entre organites végétaux, restent non caractérisées ^2,3.

La photorespiration, le deuxième flux de carbone dans les plantes après la photosynthèse, commence lorsque l’enzyme Rubisco fixe l’oxygène au lieu du dioxyde de carbone au ribulose 1,5 bisphosphate (RuBP), générant le composé inhibiteur 2-phosphoglycolate (2PG)¹. Pour minimiser les effets inhibiteurs de 2PG et recycler le carbone précédemment fixé, les plantes C3 ont développé le processus multi-organellaire de la photorespiration. La photorespiration convertit deux molécules de 2PG en une molécule de 3-phosphoglycérate (3PGA), qui peut réintégrer le cycle de fixation du carbone^{C3 1}. Ainsi, la photorespiration ne convertit que 75% du carbone précédemment fixé à partir de la génération de 2PG et consomme de l’ATP dans le processus. En conséquence, le processus de photorespiration est un frein important de 10% à 50% sur le processus photosynthétique, en fonction de la disponibilité de l’eau et des températures de la saison de croissance⁴.

Les enzymes impliquées dans la photorespiration sont un domaine de recherche depuis des décennies, mais seul un petit nombre de protéines de transport ont été caractérisées au niveau génétique, même si au moins 25 étapes de transport sont impliquées dans le processus ^5,6,7. Les deux protéines de transport qui sont directement impliquées dans le mouvement du carbone généré dans le processus de photorespiration sont le transporteur plastidique glycolate/glycérate PLGG1 et le symporteur de sodium d’acide biliaire BASS6, qui sont tous deux impliqués dans l’exportation du glycolate du chloroplaste ^5,6.

Sous [CO₂] ambiant, Rubisco fixe une molécule d’oxygène à RuBP environ 20% du temps¹. Lorsque les plantes sont soumises à un faible [CO 2], les taux de photorespiration augmentent, ce qui fait d’un faible [CO₂] un environnement idéal pour tester les mutants qui peuvent être importants sous un stress photorespiratoire élevé. Des tests de lignées d’ADN-T de protéines de transport de chloroplastes supplémentaires sous faible teneur en CO₂ pendant 24 h et en mesurant les changements de fluorescence chlorophyllienne ont conduit à l’identification de lignées végétales bass6-1 qui ont démontré un phénotype⁵ mutant de photorespiration. Une caractérisation plus poussée a démontré que BASS6 est un transporteur de glycolate dans la membrane interne du chloroplaste.

Cet article décrit en détail un protocole similaire à celui qui a été initialement utilisé pour identifier BASS6 comme un transporteur de photorespiration, qui provenait d’une liste de protéines de transport putatives situées dans la membrane chloroplastique⁸ Ce protocole peut être utilisé dans une expérience à haut débit caractérisant les mutants de l’ADN-T d’Arabidopsis ou les plantes mutantes générées par EMS comme moyen d’identifier des gènes importants pour maintenir l’efficacité photosynthétique sous une gamme de stress abiotiques tels que la chaleur, stress lumineux élevé, sécheresse et disponibilité du CO₂ . Le criblage de mutants végétaux par fluorescence chlorophyllienne a été utilisé dans le passé pour identifier rapidement des gènes importants pour le métabolisme primaire⁹. Avec jusqu’à 30% du génome d’Arabidopsis contenant des gènes codant pour des protéines de fonction inconnue ou mal caractérisées, l’analyse de l’efficacité photosynthétique induite par le stress pourrait fournir un aperçu des fonctions moléculaires non observées dans des conditions contrôlées chez les plantes mutantes¹⁰. Le but de cette méthode est d’identifier les mutants de la voie photorespiratoire en utilisant un criblage à faible teneur en CO₂ . Nous présentons une méthode pour identifier les mutants qui perturbent la photorespiration après une exposition à un faible taux de CO₂. Un avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’un criblage à haut débit pour les semis qui peut être effectué dans un laps de temps relativement court. Les sections du protocole vidéo fournissent des détails sur la préparation et la stérilisation des semences, la croissance des plantes et le traitement à faible teneur en CO₂ , la configuration du système d’imagerie par fluorescence, la mesure du rendement quantique des échantillons traités, les résultats représentatifs et les conclusions.

1. Préparation et stérilisation des semences

NOTE: La préparation des semences consiste en l’absorption et la stérilisation des semences. Il est important de noter que toutes ces étapes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour maintenir des conditions stériles. Tous les matériaux, réactifs et milieux de croissance nécessaires doivent être autoclavés (voir le tableau des matériaux).

1. Imbibation et stratification des graines
   NOTE: Les lignées de graines utilisées sont plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) et de type sauvage (WT, Col-0).
   1. Distribuer les graines dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL. Absorber les graines dans de l’eau stérile dans une hotte à flux laminaire et stratifier à 4 °C dans l’obscurité pendant 2 jours.
2. Stérilisation des semences
   1. Dans des conditions stériles, préparer 10 mL de solution d’eau de Javel à 50 % (v/v) et ajouter environ 20 μL de Tween 20. Pour la stérilisation des graines, retirer l’eau des graines imbibées, ajouter 1 mL de solution d’eau de Javel dans les tubes de microcentrifugation et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   2. Retirer la solution d’eau de Javel à l’aide d’une pipette.
   3. Rincer les graines dans 1 mL d’eau stérile pour les remettre en suspension. Retirez l’eau une fois que les graines se sont déposées au fond. Répétez l’étape 1.6 et l’étape 1.7 sept fois.
   4. Remettez les graines en suspension dans une solution stérile d’agarose à 0,1%.
3. Placage de semences
   1. Faire un volume de 1 L de milieu basal Murashige & Skoog avec des vitamines et 1,0 g/L d’acide 2-(N-morphonio)éthanésulfonique (MS) en ajoutant 5,43 g de poudre à 500 mL d’eau distillée. Ajustez le pH entre 5,6 et 5,8 à l’aide d’hydroxyde de potassium (KOH). Remplir à 1 L avec de l’eau distillée.
      1. Diviser la solution liquide en 500 mL et placer chaque moitié dans une fiole de 1 L contenant une barre d’agitation magnétique. Ajouter 5 g de poudre de gélose pour obtenir une solution de gélose à 1 % avec p/v pour chaque fiole.
      2. Autoclave à 121 °C et 15 psi pendant 30 min; Ensuite, placer à température ambiante tout en remuant lentement. Une fois refroidi, verser 25 ml de gélose MS dans une boîte de Pétri carrée. Laissez-le se solidifier.
         NOTE: Ces plaques Murashige & Skoog Basal Medium contiennent 1% MS medium avec vitamines et 1% d’agar pour la culture des mutants testés.
   2. Coupez une pointe de pipette de 200 μL avec une lame de rasoir. Placer une graine au centre de la grille carrée désignée pour chaque mutant ou génotype d’essai (1 cm² carré) d’une plaque MS carrée (figure 1) à l’aide d’une micropipette de 200 μL.
      REMARQUE: La grille carrée de 1 cm x 1 cm aide à maintenir une distance uniforme entre les plantules et à éviter le chevauchement, ce qui sera important dans l’imagerie et l’analyse ultérieures de la fluorescence.
   3. Une fois les graines plaquées, enveloppez-les avec du ruban chirurgical autour du couvercle pour les sceller et placez-les dans la chambre de croissance dans les conditions décrites ci-dessous.

2. Croissance des plantes et faible traitement au CO₂

1. Cultivez les plantes pendant 7 à 9 jours à 20 °C dans un cycle lumineux de 8 h de 120 μmol·m−²s⁻¹ et 16 h d’obscurité à 18 °C. Vérifiez les plantes le 6ème jour pour déterminer si elles sont assez grandes pour l’imagerie. Le 8ème jour après le placage, exposer les plantes à un faible taux de CO₂.
2. Traitement à faible teneur en CO₂
   1. Après les 7 à 9 jours, placer quatre des huit plaques des conditions ambiantes de la chambre de croissance dans des conditions photorespiratoires de 20 °C, des niveaux de lumière continue de 200 μmol·m−2 s⁻¹ et un faible taux de CO₂ pendant ¹²h.
   2. Construire l’état à faible teneur en CO₂ à l’aide d’un récipient transparent hermétique avec 100 g de chaux sodée placé au fond du récipient. Placez le récipient dans la même chambre de croissance que le témoin. Maintenir les installations de contrôle à une température inférieure à 120 μmol·m−2 s⁻¹ dans le CO₂ ambiant pendant ¹²h.

3. Configuration du système d’imagerie par fluorescence

1. Placer une plaque d’essai (préparée conformément aux sections 1 et 2) centrée sous la caméra à une distance fixe dans le système d’imagerie par fluorescence.
2. Dans le logiciel de l’instrument, accédez à la fenêtre Live et cochez la case Clignotements pour activer les clignotements de mesure non actiniques.
3. Cliquez sur les outils Zoom et Mise au point jusqu’à ce qu’une image complète et nette soit visible. À cette fin, utilisez une scène ou une étagère pour ajuster la distance entre les plantes et la caméra. Maintenez le zoom, la mise au point et la distance par rapport à la caméra constants pendant toute l’expérience.
4. Réglez la valeur de El. Shutter sur 0 et réglez la sensibilité pour obtenir un signal fluorescent compris entre 200 et 500 unités numériques.
   REMARQUE: Une valeur El. Shutter inférieure (0-1) garantira que les flashs de mesure ne sont pas actiniques, tandis qu’une valeur plus élevée (2) améliorera la résolution de l’image.
5. Placez un posemètre dans la même position que celle utilisée pour régler les paramètres de la caméra.
6. Dans la fenêtre Live, cochez la case Super pour démarrer une impulsion saturante d’une durée de 800 ms. N’oubliez pas de cocher la case à chaque fois pour une nouvelle impulsion.
7. Utilisez le curseur pour ajuster le pourcentage de puissance relative de la super impulsion jusqu’à ce que le posemètre indique 6 000 à 8 000 μmol·m−²s⁻¹.

4. Concevoir le programme de rendement quantique

1. Importez les outils d’exploitation standard pour le système d’imagerie.
   Inclure default.inc
   Inclure light.inc
   Remarque : La syntaxe de programme utilisée pour référence dans cette expérience est pour un système d’imagerie FluorCam.
2. Définissez les variables globales suivantes en fonction des paramètres d’éclairage configurés :
   Obturateur = 0
   Sensibilité = 40
   Super = 65
3. Incluez le pas de temps pour la journalisation des données :
   TS = 20 ms
4. Recueillir la mesure de Fo en échantillonnant la fluorescence dans un état adapté à l’obscurité.
   F0duration = 2s;
   F0period = 200ms;
   REMARQUE: F0duration définit la plage de temps sur laquelle la fluorescence adaptée à l’obscurité est enregistrée. F0period définit l’intervalle de temps sur lequel la mesure de fluorescence adaptée à l’obscurité est répétée.
5. Enregistrez les mesures de Fo dans des tableaux de données.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo »
   =>checkpoint,"endFo »;
   Où < , > représente l’ensemble des valeurs de fluorescence indexées par le temps; => stocke les mesures dans un fichier système ; mfmsub représente l’ensemble des données de l’expérience ; et checkpoint crée un sous-ensemble pour les données de mesures spécifiques telles que startFo.
6. Recueillir et stocker la mesure Fm en échantillonnant la fluorescence après une impulsion de saturation.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0duration + 40ms
   a2 = a1 + 480 ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>point de contrôle,"startFm »
   =>checkpoint,"endFm »
   =>checkpoint,"timeVisual »;
   où a1 et a2 sont des variables pour coordonner le temps d’échantillonnage avec l’impulsion saturante; a1 représente l’heure de début de la mesure Fm; et a2 représente le temps médian de l’impulsion.

5. Mesure du rendement quantique des échantillons traités

1. Immédiatement après le traitement, couvrir les plaques de papier d’aluminium pendant 15 min pour une adaptation à l’obscurité. Retirez la feuille pour mesurer le rendement quantique du photosystème II à l’aide d’un fluoromètre modifié par amplitude d’impulsion. Ensuite, placez la plaque de semis directement sous la caméra et exécutez le protocole de rendement quantique trouvé dans le référentiel GitHub.
2. Téléchargez le protocole quantum_yield à partir de GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) ou utilisez un programme de conception similaire à partir de la section 4. Utilisez le logiciel du fluoromètre pour ouvrir le fichier programme en cliquant sur l’icône du dossier et en accédant à l’emplacement du fichier.
3. Exécutez le programme de rendement quantique en cliquant sur l’icône de l’éclair rouge.
4. Une fois le protocole terminé, accédez à la fenêtre de préanalyse . Divisez la plaque en semis individuels à l’aide des Outils de sélection pour mettre en surbrillance tous les pixels de chaque semis sur l’image de l’assiette. Cliquez sur Exclusion d’arrière-plan pour supprimer tous les pixels d’arrière-plan mis en surbrillance, ne laissant que la zone de semis.
5. Cliquez sur Analyser pour générer des données de fluorescence pour chaque semis sur l’image de l’assiette. Ajustez manuellement la plage de valeurs de fluorescence pour afficher des valeurs minimales et maximales cohérentes parmi toutes les plaques.
6. Cliquez sur Moyenne numérique dans l’onglet Experiment | Exporter | Numérique. Sélectionnez Toutes les données et par colonne et cliquez sur OK pour générer un fichier texte contenant les mesures QY pour chaque plant.

6. Ouverture du fichier de données

1. Ouvrez le fichier texte dans une feuille de calcul pour analyse. Parmi les en-têtes indiquant le numéro de zone, la taille des pixels, Fm, Ft, Fq et QY, identifiez le numéro de zone pour le génotype de base (WT ou mutant test) et QYmax. Effectuer un test t par paires par rapport au type sauvage pour déterminer la signification. Les données sont interprétées comme significativement différentes lorsque les valeurs p sont inférieures à 0,05.

Les résultats montrent des images sur plaque d’images brutes et de fluorescence provenant du criblage ambiant et à faible teneur en CO2 des mutants WT et testés. Chaque plantule est étiquetée par numéro de zone, avec les lectures de fluorescence correspondantes données en QY. Les données sont exportées sous forme de fichier texte et peuvent être ouvertes dans une feuille de calcul pour analyse (voir le tableau supplémentaire S1). Les lignées mutantes plgg1-1 et abcb26 ont été sélectionnées pour démontrer l’identification positive et négative des gènes associés au stress photorespiratoire. PLGG1 code pour le premier transporteur dans la voie après l’oxygénation de RuBP6, tandis que ABCB26 est censé coder pour un transporteur d’antigène non connu pour être impliqué dans la photorespiration11. Les efficacités Fv/Fm QY adaptées à l’obscurité de WT et des mutants sont visualisées par des diagrammes de boîtes et de moustaches. Pour tester la différence statistique entre les mutants WT et test, un test t par paires a été utilisé avec une valeur de p < 0,05. Ici, nous avons utilisé des lignées photorespiratoires mutantes avec un QY Fv/Fm réduit comme mutants de test pour vérifier l’efficacité de la méthode de dépistage. Les résultats montrent que les mutants testés ont une efficacité QY significativement inférieure à celle de WT. La figure 3B montre une réduction significative du rapport entre la fluorescence variable et maximale (Fv/Fm) pour plgg1-1 mais pas abcb26 à faible CO2. Ce résultat est cohérent avec le rôle de PLGG1 en tant que transporteur impliqué dans la photorespiration, tandis que abcb26 ne démontre pas de phénotype différent du contrôle WT dans des conditions de faible teneur en CO2 . Ainsi, cette méthode de dépistage permet d’identifier les mutants photorespiratoires en utilisant un criblage à faible teneur en CO2 .

Figure 1 : Exemple de schéma de la disposition de la plaque de semence. Deux répliques techniques sont montrées avec six graines placées dans une rangée. WT contrôle les graines placées au-dessus des graines mutantes. Abréviation : WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images Fv/Fm adaptées à l’obscurité de semis âgés de 9 jours. Le contrôle de type sauvage est comparé aux lignées mutantes de l’ADN-T à température ambiante et à faible teneur en CO2. L’échelle de couleurs représente la moyenne Fv/Fm de chaque plantule. Barre d’échelle = 1 cm. Abréviations : Fv/Fm = rapport entre la fluorescence variable et la fluorescence maximale; WT = type sauvage; PLGG1-1 = Glycolate/glycérate plastidal translocateur 1; abcb26 = Cassette de liaison ATP B26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Observations de fluorescence. Mesures de rendement quantique maximal (Fv/Fm) effectuées sur des semis dans des conditions (A) ambiantes et (B) faibles en CO2. Les cases représentent la plage entre les quartiles intérieurs, les lignes à l’intérieur des boîtes représentent les médianes et les moustaches représentent les observations maximales et minimales. * Indique une différence significative basée sur un test t par paires par rapport à WT (n > 44, p < 0,05; Tableau supplémentaire S2). Abréviations : Fv/Fm = rapport entre la fluorescence variable et la fluorescence maximale; WT = type sauvage; PLGG1-1 = Glycolate/glycérate plastidal translocateur 1; abcb26 = Cassette de liaison ATP B26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Données fluorescentes compilées à partir de toutes les plaques de semis utilisées dans l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Les statistiques sont rapportées à partir d’un test t entre le type sauvage et les deux génotypes mutants. Les mutants sont considérés comme significativement différents du type sauvage lorsque la valeur de p est inférieure à 0,05. Le tableau A représente les tests t effectués sur des plantes cultivées dans des conditions ambiantes de CO 2, tandis que le tableau B représente les tests t effectués sur des végétaux cultivés à faible teneur en CO2. Test t : deux échantillons en supposant des variances égales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou de conflits d’intérêts.